黃芩苷對(duì)人皮膚惡性黑素瘤A875細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響▲

肖 敏 徐洪來(lái)

(廣西柳州市人民醫(yī)院1 皮膚科，2 肝膽外科，柳州市 545006，電子郵箱：501880191@qq.com)

惡性黑素瘤來(lái)源于黑素細(xì)胞，在皮膚腫瘤中惡性度極高，是致死率最高的一種皮膚惡性腫瘤。近年來(lái)，惡性黑素瘤的發(fā)病率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)[1]。惡性黑素瘤的發(fā)病病因和機(jī)制尚不十分清楚，目前被認(rèn)為與長(zhǎng)期日光照射、病毒感染、種族、機(jī)體免疫功能低下、外傷等多種因素密切相關(guān)[2]。對(duì)于未轉(zhuǎn)移的黑素瘤，手術(shù)切除是主要的治療手段，患者存活率可達(dá)到80%以上[3]。但由于惡性黑素瘤細(xì)胞可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，易向遠(yuǎn)處擴(kuò)散，發(fā)生轉(zhuǎn)移早，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此無(wú)法通過(guò)手術(shù)完全切除[4]。晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者則需要接受其他方法進(jìn)行治療，如化療、放療、免疫治療和靶向治療等，但預(yù)后不佳，且化療藥物的毒副作用大[5]。因此，尋找安全有效的抗惡性黑素瘤藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類(lèi)化合物。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有抗腫瘤作用，對(duì)舌癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制效果[6]。但黃芩苷對(duì)惡性黑素瘤的抗腫瘤作用還鮮有報(bào)告。本研究探討不同濃度的黃芩苷對(duì)人皮膚惡性黑素瘤A875細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其可能機(jī)制，為臨床治療惡性黑素瘤提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚惡性黑素瘤A875細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；黃芩苷(批號(hào):21967-41-9)購(gòu)自南京源植生物科技有限公司，使用時(shí)用生理鹽水溶解配比；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)：SH30809.01B)和胎牛血清(批號(hào)：021-60348065)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3(批號(hào):ab44976)、Caspase-9(批號(hào):ab52298)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin) D1抗體(批號(hào):ab16663)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，批號(hào)：ab13772)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(批號(hào):ZF.0311)購(gòu)自北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(批號(hào)：G4101-1000T)購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將A875細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔1 d更換1次培養(yǎng)液，胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A875細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組又分為80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)A875細(xì)胞增殖情況：將A875細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，密度為1×104個(gè)/孔，按1.2.2方法將細(xì)胞分組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素)，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基。繼續(xù)在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)48 h、72 h。終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，更換不含黃芩苷的新鮮無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基。每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞克隆形成能力：調(diào)整A875細(xì)胞密度為200個(gè)/孔并接種于6孔板中，按1.2.2方法將細(xì)胞分組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，其間每隔2 d換液一次(吸除舊培養(yǎng)基，加入新鮮等濃度培養(yǎng)基)。吸除培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗 2 次，1 min/次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。吸除固定液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，1 min/次，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min。去除染色液，磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，1 min/次，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。以超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)作為一個(gè)細(xì)胞克隆，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)，以細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)表示細(xì)胞克隆形成能力。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A875細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，以1 mL/孔接種于6孔板中，按1.2.2方法將細(xì)胞分組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組各亞組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，吸除上清液，收集細(xì)胞并用冷磷酸緩沖鹽溶液清洗細(xì)胞2次，1 min/次，再用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 mL培養(yǎng)管中，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和5 μL 碘化丙啶，混勻后室溫下避光孵育15 min，各實(shí)驗(yàn)管中再分別加入1×結(jié)合緩沖液400 μL。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A875細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板中，按1.2.2方法將細(xì)胞分組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組各亞組分別加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷的RPMI 1640培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。在 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞并用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液 充分洗滌2次，1 min/次，加入75%乙醇固定，4℃靜置24 h，預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，1 min/次，加入20 μL RNase 37 ℃水浴消化30 min，加入0.5 mL 碘化丙啶室溫下避光染色30 min，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)A875細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A875細(xì)胞制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以1 mL/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，將細(xì)胞分為對(duì)照組和320 μg/mL黃芩苷組，分別加入含0 μg/mL和320 μg/mL黃芩苷的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每組設(shè)6個(gè)平行孔。收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，1 min/次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，用蛋白提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，批號(hào)：YT8951)提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。將含有等量蛋白的樣品用上樣緩沖液稀釋?zhuān)糜谑榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠(分離膠15%、濃縮膠5%)行電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h；分別加入Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、β-肌動(dòng)蛋白一抗(1 ∶1 000)，4℃ 過(guò)夜；加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1 ∶500)，37℃孵育1 h后，用堿性磷酸酶顯色液顯色后掃描成像。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照，計(jì)算Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度黃芩苷對(duì)A875細(xì)胞存活率的影響 隨著黃芩苷藥物濃度的升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，A875細(xì)胞的細(xì)胞存活率逐漸下降 (均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度黃芩苷對(duì)A875細(xì)胞存活率的影響(x±s， %)

2.2 各組細(xì)胞克隆形成能力的比較 對(duì)照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組，細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度黃芩苷對(duì)A875細(xì)胞克隆形成能力的影響(x±s，個(gè))

2.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較 對(duì)照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組A875細(xì)胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度黃芩苷對(duì)A875細(xì)胞凋亡率的影響(x±s，%)

2.4 各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例的比較 對(duì)照組、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黃芩苷組G0/G1期細(xì)胞比例依次升高，S期細(xì)胞比例依次下降(P<0.05)，除對(duì)照組、80 μg/mL黃芩苷組G2/M期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余黃芩苷濃度組之間及其與對(duì)照組比較，G2/M期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例的比較(x±s,%)

2.5 各組A875細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表達(dá)水平的比較 選取實(shí)驗(yàn)中黃芩苷最高濃度組320 μg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組比較，320 μg/mL黃芩苷組A875細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平升高， CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞 Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

黃芩在我國(guó)產(chǎn)量大，用藥歷史悠久，其副作用小，毒性低，價(jià)格低廉，因此用途廣泛。在傳統(tǒng)中醫(yī)中，黃芩的功效為清熱除濕、瀉火解毒。黃芩苷是黃芩最有效的化學(xué)成分之一，在臨床上主要用于治療心血管疾病、腦缺血、肝炎、肺炎、抗感染等[7]。隨著對(duì)黃芩苷分子機(jī)制研究的逐步深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)黃芩苷還具有抗腫瘤作用，近年來(lái)的研究顯示，黃芩苷對(duì)舌癌、食管癌、骨肉瘤、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。

生物體內(nèi)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的死亡之間存在著動(dòng)態(tài)平衡，使多細(xì)胞生物個(gè)體能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育[9]。細(xì)胞無(wú)限增殖和細(xì)胞死亡抑制，是惡性腫瘤的兩大顯著特征[10]。細(xì)胞失控性增殖的原因包括：細(xì)胞快速生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，細(xì)胞凋亡減少。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成的開(kāi)始，到下一次分裂結(jié)束。細(xì)胞周期是一種復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)節(jié)過(guò)程，嚴(yán)格按照 G1-S-G2-M 循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)[11]。細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)自我更新及個(gè)體發(fā)育。細(xì)胞周期是保證細(xì)胞正常生命活動(dòng)的過(guò)程[12]。Cyclin、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑三者共同協(xié)調(diào)完成對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控[13]。Cyclin可分為多種類(lèi)型，其中CyclinD1推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[14]。在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，Cyclin存在著異常激活的現(xiàn)象[15]。因此，細(xì)胞周期活動(dòng)異常，促使細(xì)胞持續(xù)增殖，是腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，不同濃度黃芩苷干預(yù)A875細(xì)胞48 h、72 h后，隨著黃芩苷藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A875細(xì)胞的存活率逐漸下降；不同濃度黃芩苷干預(yù)A875細(xì)胞7 d后，各組細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)隨著黃芩苷藥物濃度的升高而下降(P<0.05)。均表明黃芩苷能抑制A875細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度的增加和藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制增殖作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度與時(shí)間相關(guān)性。此外，黃芩苷作用于A875細(xì)胞后G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升，S期和G2/M期比例明顯下降，且給予320 μg/mL黃芩苷干預(yù)后，A875細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低，表明黃芩苷可將A875細(xì)胞阻滯于G0/G1期，特異性抑制細(xì)胞分裂。

細(xì)胞凋亡是指由于細(xì)胞內(nèi)外的因素，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序，在基因的調(diào)控下自主地死亡，有序結(jié)束生命的過(guò)程，即程序性細(xì)胞死亡[16]。細(xì)胞凋亡常出現(xiàn)細(xì)胞收縮、出芽小體形成、細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)裂解等形態(tài)學(xué)的變化。細(xì)胞凋亡可以清除不良細(xì)胞，維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[17]。細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路包括內(nèi)源性凋亡途徑、外源性凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡途徑[18]。Caspase家族貫穿于細(xì)胞凋亡的各個(gè)時(shí)期，在細(xì)胞凋亡中起到了關(guān)鍵作用[19]。在內(nèi)源性凋亡途徑中，細(xì)胞受到外界凋亡信號(hào)的刺激,線(xiàn)粒體膜發(fā)生腫脹，通透性增高，Cyto-C、PDCD8、Bitl等凋亡啟動(dòng)因子從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，與Caspase-9及凋亡酶激活因子1結(jié)合，形成凋亡體，激活Caspase-9，進(jìn)一步激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 等因子，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[20]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的效應(yīng)因子，是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的階段[21]。細(xì)胞的凋亡，負(fù)調(diào)控著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。促使細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，是治療惡性腫瘤的一種靶向方法[23]。本研究結(jié)果顯示，給予320 μg/mL黃芩苷干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平均升高，提示黃芩苷可誘導(dǎo)A875細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)。

綜上所述，黃芩苷可以抑制A875細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，將A875細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞分裂，機(jī)制可能與黃芩苷升高Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平，降低CyclinD1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。