Bkt 基因和 crtR-B 基因在集胞藻 PCC 6803 中的重組表達及功能分析

劉亞銘 王 康 崔玉琳 陳 高 秦 松*

1(中國科學院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室 煙臺 264003)

2(中國科學院大學 北京 101418)

3(中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071)

4(山東省農業(yè)科學院農作物種質資源研究所 濟南 250100)

5(山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室 濟南 250100)

1 引 言

類胡蘿卜素(Carotenoids)是一類廣泛存在于高等植物、真核微藻和藍藻光合膜的烯萜類化合物[1]，通常是由 8 個類異戊二烯單位組成的碳氫化合物及其氧化衍生物[2-3]。在光合生物中，其作為捕光色素成分參與光合作用，并可以通過清除自由基和抗氧化來實現自我保護[4-5]。研究表明，類胡蘿卜素在人體健康方面也發(fā)揮著重要作用。其中，一些類胡蘿卜素可作為人體內維生素 A 的重要來源；而大部分的類胡蘿卜素有很強的抗氧化活性[6]，能夠增強人和動物的免疫力[2,7-8]，具有多種重要的保健功能和較大的醫(yī)用價值。例如，角黃質具有抗氧化、抗癌、提高免疫力，以及保護皮膚和骨骼健康等作用[4]；金盞花黃質作為蝦青素合成的中間產物，可以通過激活抗氧化防御對出血性腦損傷發(fā)揮保護作用，具有防止腦內出血的潛力[9]。

藍藻，又稱藍細菌，是一類能夠進行光合作用的原核生物[10]。集胞藻 PCC 6803 是研究代謝調控的模式藍藻，也是利用合成生物學手段構建細胞工廠的優(yōu)良底盤[11-12]。其既能自養(yǎng)，又能異養(yǎng)，并且遺傳背景清晰，是最早完成全基因組測序的藻類，具有天然的遺傳轉化系統(tǒng)[13]。集胞藻 PCC 6803 中含有的內源性 β-胡蘿卜素單酮醇酶能催化β-胡蘿卜素轉化為海膽酮，但不能將海膽酮進一步轉化；而內源性 β-胡蘿卜素羥化酶(β-Carotene Hydroxylase，CRTR-B)[14-15]也只能催化 β-胡蘿卜素轉化為玉米黃素。然而，在雨生紅球藻中，β-胡蘿卜素酮化酶(β-Carotene Ketolase，BKT)[14]不僅可以催化 β-胡蘿卜素轉化為海膽酮，并進一步轉化為角黃質，還可以催化金盞花黃質轉化為蝦青素；β-胡蘿卜素羥化酶則可以催化 β-胡蘿卜素轉化為玉米黃素，并催化角黃質轉化為蝦青素。

為進一步闡明bkt基因和crtR-B基因的功能及其作用機制，本文克隆了來自雨生紅球藻的 β-胡蘿卜素酮化酶基因(bkt)和 β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR-B)，并在集胞藻 PCC 6803 中表達，實現對集胞藻中類胡蘿卜素代謝途徑的修飾。本文研究結果為進一步闡明bkt基因和crtR-B基因的功能及其作用機制奠定了分子基礎，也為研究其他微型藻類中的類胡蘿卜素代謝途徑提供參考。

2 材料與方法

2.1 集胞藻 PCC 6803 的培養(yǎng)

集胞藻 PCC 6803 購自中國科學院淡水藻種庫，編號 FACHB-898。使用 BG11 培養(yǎng)基培養(yǎng)集胞藻 PCC 6803，培養(yǎng)溫度為(30±2)℃，光照強度為 50 μmol photon/(m2·s－1)，光/暗周期為 12 h/12 h。

2.2 同源重組載體的構建

首先，使用植物基因組 DNA 提取試劑盒(大連寶生物，中國)提取集胞藻 PCC 6803 的基因組DNA；然后，利用大腸桿菌 DH-5α(Invitrogen，中國)進行 DNA 克隆和質粒構建，并在 37 ℃、160 r/min 搖床中培養(yǎng)；最后，使用細菌質粒DNA 快速提取試劑盒(上海生工，中國)提取重組質粒。根據集胞藻 PCC 6803 密碼子偏好性對來自雨生紅球藻的bkt基因(GenBank：AY603347.1)和crtR-B基因(GenBank：AF162276.1)進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的bkt基因和crtR-B基因由 GenScript 公司合成。p5S1285UD-bkt質粒和pSKT1T2-crtR-B質粒圖譜見圖 1。從美國國立生物技術信息中心網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取已知的基因序列，用 Primer 5.0 軟件設計引物，本研究中所用引物見表 1(均由北京睿博興科生物技術有限公司合成)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

圖1 p5S1285UD-bkt 和 pSKT1T2-crtR-B 質粒圖譜Fig.1 Plasmid maps of p5S1285UD-bkt and pSKT1T2-crtR-B

2.3 集胞藻 PCC 6803 的轉化和突變株的篩選

離心收集處于對數生長期的集胞藻 PCC 6803 藻株，其在 730 nm 處的光密度(Optical Density，OD)值約為 0.6，使用新鮮的 BG11 培養(yǎng)基調整細胞濃度至OD730＝2.5，備用。將上述得到的質粒通過自然轉化法[16]轉化至處理好的藻細胞中。在含有 5 μg/mL 慶大霉素和 25 μg/mL卡那霉素的 BG11 固體培養(yǎng)基上，對轉化后的集胞藻 PCC 6803 分別進行篩選。同時，將轉化初始質粒 p5S1285UD[17]和 pSKT1T2[16]的突變株設為對照組。

2.4 突變株的驗證

對于突變株的 DNA 水平驗證，提取集胞藻PCC 6803 野生型和突變株基因組 DNA，通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)驗證目的基因的轉入情況，引物見表 1。

具體地，先使用植物 RNA 提取試劑盒(Omega，中國)提取集胞藻 PCC 6803 野生型和突變株的總 RNA；然后，通過 cDNA 合成試劑盒(大連寶生物，中國)將 mRNA 反轉錄為cDNA；最后，以 cDNA 作為模板，分別用引物bkt-RT-F/bkt-RT-R 和crtR-B2-F/crtR-B2-R 檢驗bkt基因和crtR-B基因 RNA 水平的表達。

2.5 生長曲線的測定

取處于對數生長期的集胞藻，調節(jié)初始接種濃度OD730值為 0.5，每 24 h 取樣 1 次，用普析Tu-1810 紫外分光光度計測定OD730值，繪制生長曲線。其中，實驗組和對照組各設置 3 個平行。

2.6 色素分析

本文使用的類胡蘿卜素標準品購自 Sigma(中國)。參照 Baroli 等[18]的方法，用丙酮提取色素，并通過 Thermo Fisher UltiMate-3000 液相色譜儀(配置 UV-可見檢測器)對色素進行分離和鑒定。其中，色譜柱使用 C18 反相柱，Acclaim 120A(5 μm×4.6 mm×250 mm)。流動相比例參數、流速以及梯度洗脫時間均參照文獻[18]的方法設定。

2.7 統(tǒng)計分析

所有實驗重復 3 次，數據表示為 3 次實驗的平均值±標準偏差。使用 SPSS 軟件進行信度檢測。當P＜0.05 時，認為在統(tǒng)計學上具有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 突變株的構建和鑒定

本實驗構建的表達載體 p5 S1285 UDbkt和 pSKT1T2-crtR-B如圖 1 所示。其中，p5S1285UD-bkt質粒中含有 1 000 bp 上游同源臂(1285U，GenBank：NC_017277.1)和 1 000 bp下游同源臂(1285D)，并使用從 pFastBacI 質粒(Invitrogen)克隆慶大霉素抗性基因作為選擇標記基因。在 pSKT1T2-crtR-B質粒中，PpsbA2啟動子和由引物 PpsbA2-F/PpsbA2-R 擴增的psbA2開放閱讀框作為上下游同源臂。另外，在 pSKT1T2-crtR-B質粒中以卡那霉素抗性基因作為選擇標記基因。經過轉化和抗生素篩選后，采用 PCR驗證目的基因的轉入情況，分別檢測野生型和突變株基因組 DNA 中外源序列是否進行同源重組。當使用引物 1285U-F/1285D-R 對整個同源交換片段進行檢驗時，在bkt-Gm突變株中擴增出預期的 4.9 kb 條帶，而在對照組中僅擴增出2.0 kb 條帶(圖 2(a))，表明bkt-Gm突變株中包含Gm基因和bkt基因的外源基因表達盒已經整合到基因組 DNA 中。同樣，如圖 2(b)，當用引物 PpsbA2-F/PpsbA2-R 對整個同源交換片段進行檢驗時，在crtR-B-Kan突變株中擴增出預期的 4.1 kb條帶，而在對照組中僅擴增出 1.5 kb 條帶，這表明crtR-B-Kan突變株的基因組 DNA 中已經整合了包含crtR-B基因和Kan基因的外源基因表達盒。同時，測序結果也表明，crtR-B基因和bkt基因已經整合到集胞藻 PCC 6803 基因組DNA 中。

圖2 DNA 水平鑒定Fig.2 The identification of mutant in DNA level

為了進一步驗證bkt基因和crtR-B基因轉錄水平的表達，從野生型和突變株中提取總 RNA。如圖 3 所示，在bkt-Gm突變株和crtR-B-Kan突變株中分別擴增出代表bkt基因和crtR-B基因的大約 410 bp 和 258 bp 的條帶，而在對照組中沒有觀察到條帶，說明整合到基因組中的bkt基因和crtR-B基因被轉錄。這表明，bkt基因和crtR-B基因完全轉入集胞藻 PCC 6803，且具有表達活性，bkt-Gm突變株和crtR-B-Kan突變株已構建成功。

圖3 RNA 水平鑒定Fig.3 The identification of mutant in RNA level

3.2 正常培養(yǎng)條件下藻株的生長情況

為了檢測轉入bkt基因和crtR-B基因是否對藻株的生長產生影響，本文檢測了野生型與突變株在正常培養(yǎng)條件下的生長情況。圖 4 結果顯示，野生型和突變株的生長速率相似，表明轉入bkt基因和crtR-B基因對集胞藻的生長基本沒有影響。

圖4 正常培養(yǎng)條件下野生型、bkt-Gm 突變株和crtR-B-Kan 突變株的生長曲線Fig.4 The growth curve of wild strain,bkt-Gm mutants and crtR-B-Kan mutants under normal condition

3.3 野生型和突變株的色素差異

高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)檢測結果(圖 5)顯示，bkt-Gm突變株產生了角黃質，其含量為(1.38±0.07)mg/g，且海膽酮含量下降為(7.72±0.29)mg/g、β-胡蘿卜素含量下降為(13.12±0.49)mg/g(表 2)；而crtR-B-Kan突變株中檢測出金盞花黃質，其含量為(0.98±0.04)mg/g，且玉米黃素含量下降為(4.18±0.09)mg/g、β-胡蘿卜素含量下降為(12.80±0.14)mg/g(表 2)。

圖5 HPLC 檢測來自集胞藻 PCC 6803 野生型、bkt-Gm 突變株和 crtR-B-Kan 突變株的類胡蘿卜素Fig.5 HPLC analysis of pigment production from the Synechocystis sp.PCC 6803 wild type,bkt-Gm mutants and crtR-B-Kan mutants

表2 色素含量Table 2 The content of pigment

4 討論

集胞藻 PCC 6803 中含有一種 β-胡蘿卜素單酮醇酶基因(GenBank：NC_000911)，其編碼的酶能從氧氣(O2)中轉移氧原子來氧化 C4 位的 β-胡蘿卜素[19]，β-胡蘿卜素單酮醇酶通常能將 β-胡蘿卜素轉化為海膽酮[20]。β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)被認為是一種與 β-胡蘿卜素單酮醇酶具有相同功能的酶，參與 β-胡蘿卜素合成蝦青素。雖然二者都是 β-胡蘿卜素酮化酶，但在催化機理上不同[21]。其中，BKT 是在 β-胡蘿卜素的 2 個 β-紫羅蘭酮環(huán)中各插入 1 個酮基[22]，而 β-胡蘿卜素單酮醇酶是在 β-胡蘿卜素的 2 個 β-紫羅蘭酮環(huán)之一插入 1 個酮基以合成海膽酮[21,23]。本文研究結果表明，來自雨生紅球藻的 BKT 可以在集胞藻中利用海膽酮進一步合成角黃質。

集胞藻 PCC 6803 中含有 β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtR,GenBank:NP_440788.1)，負責將 1個羥基引入 β-胡蘿卜素的 β-紫羅蘭酮環(huán)[24]中。CRTR 能夠催化 β-胡蘿卜素形成玉米黃素，并在集胞藻 PCC 6803 中合成藍藻葉黃素。β-胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B)是一種來自雨生紅球藻的蝦青素合成途徑中的關鍵酶，可將 2 個羥基引入 β-胡蘿卜素中[14]。在蝦青素合成途徑中，CRTR-B負責將 β-胡蘿卜素轉化為 β-隱黃質，并進一步轉化為玉米黃素，最終將角黃素轉化為蝦青素。盡管 CRTR-B 和 CRTR 都被稱為 β-胡蘿卜素羥化酶，但來自陸生植物和綠藻的 β-胡蘿卜素羥化酶由crtR-B基因編碼[25-26]，而藍藻 β-胡蘿卜素羥化酶由crtR基因編碼，且系統(tǒng)發(fā)育上與crtR-B無關[27]。本文研究結果顯示，來自雨生紅球藻的CRTR-B 可以在集胞藻中利用玉米黃素進一步合成金盞花黃質。

類胡蘿卜素已被廣泛認為是安全的天然抗氧化劑和抗癌劑。而不同的微藻產生不同結構的類胡蘿卜素是由具有特定催化功能的類胡蘿卜素合成酶決定。深入了解微藻中類胡蘿卜素的生物合成機制既有利于促進其在食品和制藥行業(yè)的生產和應用，也為下一步在集胞藻中合成蝦青素，構建性能優(yōu)良的藻株奠定基礎。

5 結論

通過在集胞藻 PCC 6803 中分別轉入來自雨生紅球藻的bkt基因和crtR-B基因，采用 HPLC檢測色素組成發(fā)現，外源基因的表達對集胞藻PCC 6803 類胡蘿卜素的合成產生了影響。轉入bkt基因的細胞產生角黃質的同時海膽酮含量下降，表明是外源的 β-胡蘿卜素酮化酶將海膽酮轉化為角黃質；轉入crtR-B基因的細胞產生金盞花黃質的同時玉米黃素含量下降，表明是外源的 β-胡蘿卜素羥化酶將玉米黃素轉化為金盞花黃質。本文結果表明，分別來自雨生紅球藻和集胞藻 PCC 6803 的不同 β-胡蘿卜素酮化酶和 β-胡蘿卜素羥化酶具有不同的功能，僅依靠來自集胞藻PCC 6803 的 β-胡蘿卜素酮化酶和 β-胡蘿卜素羥化酶無法合成蝦青素。本實驗初步揭示了集胞藻PCC 6803 中類胡蘿卜素代謝機制，為通過基因工程手段在集胞藻 PCC 6803 細胞內積累蝦青素奠定了基礎。