細(xì)胞周期同步化方法在細(xì)菌細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用

傅雄飛 黃雄亮 夏 霖

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 合成生物學(xué)研究所定量合成生物學(xué)研究中心 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

細(xì)胞周期是細(xì)胞生長、繁殖和發(fā)育過程中的一個重要的調(diào)控過程，也是生命活動中普遍存在的一個復(fù)雜過程。細(xì)胞周期是由一系列與細(xì)胞周期相關(guān)的調(diào)控蛋白組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能確保細(xì)胞周期相關(guān)事件正確、有序地進行。細(xì)胞的生長、細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生、染色體的復(fù)制以及細(xì)胞的分裂等事件的開始與結(jié)束都受到細(xì)胞周期的調(diào)控，每個事件都在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的監(jiān)測下環(huán)環(huán)相扣。

對細(xì)胞周期的研究并不僅僅為了滿足人類對生命本質(zhì)的好奇。除了提高人們對生命的認(rèn)知以外，細(xì)胞周期研究對于疾病治療也有著極大的促進作用。細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對細(xì)胞的生長過程起監(jiān)控作用，使細(xì)胞能夠正常、穩(wěn)定地把遺傳物質(zhì)傳遞給子代細(xì)胞。當(dāng)遺傳物質(zhì)染色體 DNA 出現(xiàn)損傷時，細(xì)胞將停止生長直到損傷得以修復(fù)。而當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生紊亂時，細(xì)胞的生長分裂也會出現(xiàn)問題從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1]。中國儒家創(chuàng)始人孔子曾說：“未知生，焉知死？”，其認(rèn)為只有真正了解了“生”，才能去解析“死”，而科學(xué)家們對細(xì)胞周期的研究正是對生命本質(zhì)的探索。只有當(dāng)人們知道了細(xì)胞生長繁殖的過程，才能對細(xì)胞的死亡和疾病的發(fā)生有更加直觀的認(rèn)識。

合成生物學(xué)是近十年來迅速發(fā)展的新興學(xué)科，通過使用分子生物學(xué)工具和技術(shù)，對細(xì)胞進行正向工程化改造，用于研究細(xì)胞系統(tǒng)并促進其對生產(chǎn)性目的的應(yīng)用[2-3]。在對細(xì)胞進行人為改造的過程中，復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)使得許多理性設(shè)計變得不可預(yù)期，阻礙了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。因此，對細(xì)胞周期的研究是該領(lǐng)域發(fā)展不可避免的一環(huán)。

2 細(xì)胞周期的定義

細(xì)胞周期是指細(xì)胞在連續(xù)分裂的過程中，從一次分裂結(jié)束到下一次分裂開始的這段時間所經(jīng)歷的全過程，包括一系列特定的、有序的且周期性發(fā)生的事件。其中，最為重要的事件是染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂。根據(jù)不同的細(xì)胞類型，細(xì)胞周期的研究可以分為真核細(xì)胞和原核細(xì)胞兩部分。

在真核細(xì)胞中，細(xì)胞周期可以簡單地分為分裂間期和分裂期兩個階段。在分裂間期，細(xì)胞持續(xù)生長，體積變大，并執(zhí)行染色體復(fù)制，確保細(xì)胞在進入分裂期所需的營養(yǎng)充足以及遺傳物質(zhì)的倍增。該期還可進一步地分為染色體復(fù)制前的準(zhǔn)備階段 G1期、染色體復(fù)制階段 S 期以及染色體復(fù)制結(jié)束后的 G2期。在有絲分裂過程中，當(dāng)細(xì)胞進入分裂期后，有絲分裂開始，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)依次一分為二，從而形成兩個子細(xì)胞。真核細(xì)胞的細(xì)胞周期以 cyclin/CDK(cyclin/Cyclin-Dependent Kinase)復(fù)合體為調(diào)控核心。細(xì)胞外部和內(nèi)部的各種信號通過不同的信號通路傳遞給cyclin/CDK 復(fù)合體，從而激活或抑制該復(fù)合體的活性，進而激活或抑制受其調(diào)控的蛋白，調(diào)控下游相應(yīng)事件的發(fā)生[4-7]。

在原核細(xì)胞中，細(xì)胞周期主要由 C 期和 D期組成。其中，C 期是指從染色體復(fù)制起始到復(fù)制完成這段時間，而 D 期則是從染色體復(fù)制完成到細(xì)胞分裂這一階段。當(dāng)原核細(xì)胞的生長速率較慢時，上一輪分裂結(jié)束至下一輪分裂開始的間隔要大于 C 期與 D 期的時間之和，此時在上一輪分裂結(jié)束至染色體復(fù)制開始會有一段間隙期，將這一階段定義為 B 期[8-9]。與真核細(xì)胞的細(xì)胞周期最大的區(qū)別是，在營養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)條件下，部分原核細(xì)胞如大腸桿菌、沙門氏菌等能夠以較快的速率進行生長分裂，此時 C 期與 D 期的時間之和要遠(yuǎn)大于細(xì)胞分裂的間隔時間，多次染色體復(fù)制事件將發(fā)生重疊，正在進行的細(xì)胞分裂所對應(yīng)的染色體復(fù)制起始發(fā)生在上一輪甚至更早的分裂周期。

3 細(xì)胞周期研究方法

細(xì)胞在培養(yǎng)過程中是相對獨立的個體，每一個細(xì)胞的生長分裂都由其獨自的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)。因此，細(xì)胞群體由一個個處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞組成。目前，對細(xì)胞周期的研究主要可以分為單細(xì)胞水平和群體水平上的研究兩大類。

在單細(xì)胞水平上對細(xì)胞周期進行研究主要依賴于顯微技術(shù)，可對群體中的每個細(xì)胞進行獨立的觀測研究。然而，許多傳統(tǒng)的生化分析方法無法在顯微成像的同時對單細(xì)胞進行分析，大部分顯微成像所用到的分子標(biāo)記也具有一定的局限性，這使得顯微成像技術(shù)在細(xì)胞周期研究中也受到了一定的限制[10-11]。

在群體水平上研究細(xì)胞周期，一方面是通過條件突變株來研究細(xì)胞周期相關(guān)的關(guān)鍵基因及其在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用；另一方面則是通過數(shù)學(xué)模型的輔助，對細(xì)菌在培養(yǎng)過程中的細(xì)胞周期相關(guān)參數(shù)的群體平均值進行計算，進而在宏觀上對細(xì)胞周期進行研究[12-15]。

除此之外，還可以通過同步化的方法，使細(xì)胞群體中的每一個細(xì)胞都處于細(xì)胞周期的同一階段，然后同步地進行生長分裂，如圖 1 所示。通過這一獨特的策略來研究細(xì)胞周期大大地提高了研究目標(biāo)的樣本量，使得許多只能在群體水平上使用的研究方法也可以用于細(xì)胞周期研究。

圖1 細(xì)胞周期同步化Fig.1 Cell cycle synchronization

4 同步化方法的標(biāo)準(zhǔn)

自 19 世紀(jì) 50 年代以來，科學(xué)家們一直致力于細(xì)胞周期同步化方法的研究和探索，尤其是在細(xì)胞周期研究領(lǐng)域嘗試了各種各樣的方法來獲得同步化的細(xì)胞。然而，并不是所有的方法都適用于細(xì)胞周期研究：有的方法獲得的同步化效果較差，有的甚至?xí)肱c細(xì)胞周期不相關(guān)的影響因素，從而導(dǎo)致人們對細(xì)胞周期的機理產(chǎn)生錯誤的理解。因此，使用同步化方法對細(xì)胞周期進行研究需要滿足以下幾個基本標(biāo)準(zhǔn)：(1)同步化方法可以獲得大量的同步化細(xì)胞；(2)經(jīng)同步化方法處理后獲得的同步化細(xì)胞能夠繼續(xù)正常地進行生長分裂；(3)獲取的同步化細(xì)胞應(yīng)集中在細(xì)胞周期的某個特定階段，同步化程度需要足夠高，能夠?qū)?xì)胞周期事件有較高的分辨率，如大部分的同步化細(xì)胞能夠在差異較小的一個時間段內(nèi)進行分裂；(4)同步化方法應(yīng)盡可能少地引入與細(xì)胞生理條件不一致的影響因素，對細(xì)胞周期產(chǎn)生較少的干擾，使同步化細(xì)胞能較好地反映正常細(xì)胞周期的特性；(5)利用同步化方法獲得的同步化細(xì)胞在同步生長分裂的過程中，細(xì)胞周期相關(guān)的周期性事件至少在 2～3 個分裂周期中能有較好的重復(fù)性[16-20]。這些標(biāo)準(zhǔn)對同步化方法具有較為嚴(yán)格的限制，目的是為了降低研究方法對細(xì)胞周期研究帶來額外的不可預(yù)估的影響。針對不同的研究目標(biāo)和對象，不同的同步化方法具有不同的優(yōu)缺點，熟悉了解不同方法的優(yōu)缺點可以合理地避免方法對研究產(chǎn)生的不良影響。

5 同步化方法在細(xì)菌細(xì)胞周期研究中的發(fā)展與應(yīng)用

由于不同細(xì)菌在形態(tài)、分裂模式等生理特性上的差異，同步化方法的應(yīng)用在一定程度上存在菌種限制性。

5.1 新月柄桿菌

新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)的細(xì)胞分裂是不對稱分裂，形成一個一端帶鞭毛的可游動的細(xì)胞和一個一端帶柄狀莖桿的莖細(xì)胞。其中，只有莖細(xì)胞可以進行 DNA 復(fù)制。與其他細(xì)菌不同的是，新月柄桿菌的一輪細(xì)胞周期中只會起始一次 DNA 復(fù)制，這可能更有助于其適應(yīng)在營養(yǎng)相對匱乏的環(huán)境下生存。對新月柄桿菌細(xì)胞周期的研究可以幫助人們更好地理解細(xì)胞分化和發(fā)育，同時，因為新月柄桿菌在細(xì)胞周期伴隨著獨特的形態(tài)變化，這使得人們可以更容易地分離處于不同細(xì)胞周期階段的新月柄桿菌，從而獲得同步化的新月柄桿菌。因此，新月柄桿菌已成為細(xì)胞周期研究的一個重要的模式工具菌株。

1962 年，根據(jù)新月柄桿菌分裂所產(chǎn)生的兩種不同形態(tài)子細(xì)胞在浮力密度上的差異，Stove 和Stanier[21]使用差速離心的方法分離出新月柄桿菌分裂后產(chǎn)生的兩種不同形態(tài)的細(xì)胞：游動細(xì)胞和葉狀柄細(xì)胞，將二者分別接種至新鮮培養(yǎng)基中可以觀測到兩類細(xì)胞的同步化生長和分裂以及在生長分裂過程中的形態(tài)變化。1977 年，參考真核細(xì)胞中的血細(xì)胞和裂殖酵母的同步化方法，Evinger和 Agabian[22]利用密度梯度離心的方法對新月柄桿菌進行同步化。與差速離心的方法相比，密度梯度離心的方法分離獲得的同步化細(xì)胞的同步化程度更高。1993 年，Stephens 和 Shapiro[23]使用這一同步化方法對新月柄桿菌鞭毛形成的相關(guān)基因在細(xì)胞周期不同時期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行檢測。1997 年，Mohl 和 Gober[24]在同步化培養(yǎng)的新月柄桿菌中研究了 ParA 和 ParB 在細(xì)胞周期不同時期的轉(zhuǎn)錄表達模式以及細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn) ParA 和ParB 在新復(fù)制 DNA 遷移至準(zhǔn)備分裂的細(xì)胞兩端這一事件中起重要作用。Domian 等[25]還利用同步化方法研究了新月柄桿菌的細(xì)胞周期核心調(diào)控蛋白 CtrA 在細(xì)胞周期不同階段的磷酸化水平和空間分布，進一步闡釋了 CtrA 在新月柄桿菌細(xì)胞周期中的調(diào)控模式。隨著技術(shù)的發(fā)展，Shapiro實驗室于 2000 年使用微陣列芯片對新月柄桿菌在細(xì)胞周期不同時期的轉(zhuǎn)錄組進行了全局分析，發(fā)現(xiàn)新月柄桿菌中有 553 個基因(占所有基因的19%)的轉(zhuǎn)錄水平在細(xì)胞周期中并不是恒定不變的，而是隨著細(xì)胞周期的進行發(fā)生周期性變化，分別對應(yīng)細(xì)胞周期中的不同事件，在特定的時期發(fā)揮其功能。通過與 CtrA 溫度敏感型菌株的比較，他們還確定了其中 26% 的細(xì)胞周期依賴的基因直接或間接地受到 CtrA 蛋白的調(diào)控[26]。隨后，更多的文章報道了通過新月柄桿菌同步化方法結(jié)合組學(xué)分析從全局的角度對其細(xì)胞周期進行分析[27-30]。

另外，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，Madren 等[31]開發(fā)出了一個可以在長達 4 天的時間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生新分裂游動細(xì)胞的微流控芯片。該方法利用葉狀柄細(xì)胞易于黏附在材料表面的特性，使之黏附在微流控芯片中，而新分裂的游動細(xì)胞則會被流動的新鮮培養(yǎng)基帶出芯片，基本原理與后面將提到的大腸桿菌膜洗脫同步化裝置原理類似。相比于傳統(tǒng)的離心分離法，該方法的好處在于需要的培養(yǎng)基較少，避免了復(fù)雜繁瑣的離心過程，減少了對同步化細(xì)胞的干擾，并且該同步化芯片可以在4 天內(nèi)連續(xù)不斷地產(chǎn)生新分裂的同步化細(xì)胞，更有利于時間較長的實驗持續(xù)進行。傳統(tǒng)的離心分離法根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)和浮力密度來進行同步化，無法將新分裂的游動細(xì)胞與快要分化成葉狀柄細(xì)胞的流動細(xì)胞分離，而該方法洗脫獲得的都是新分裂的子細(xì)胞，因此只要將收集時間控制在較短的區(qū)間，就可獲得同步化程度更高的子細(xì)胞。然而，由于微流控芯片技術(shù)更適用于實時觀察分析，所以微流控芯片同步法在同步化細(xì)胞的產(chǎn)量上要遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的離心分離法。

5.2 大腸桿菌

大腸桿菌(Escherichia coli)是目前科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)中都普遍使用的模式細(xì)菌，人們對于大腸桿菌的研究可以追溯至一百多年前?？茖W(xué)家們對大腸桿菌的同步化方法也做了許多的嘗試，然而，與新月柄桿菌不同的是，大腸桿菌的分裂是對稱分裂，母細(xì)胞在分裂后形成兩個相同大小、相同形態(tài)的子細(xì)胞，而且也不會形成像新月柄桿菌的葉狀柄類似的結(jié)構(gòu)，因此，大腸桿菌的同步化要相對更難一些。

1956 年，Barner 和 Cohen[32]通過去除培養(yǎng)基中的胸腺嘧啶(T)使胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌停止在 DNA 合成階段，并在合適的時間后補充胸腺嘧啶使這些被捕獲在 DNA 合成階段的大腸桿菌同步地開始 DNA 合成以及生長分裂。這種通過改變細(xì)胞的生長條件(如營養(yǎng)、溫度等)來使處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞同步在同一階段，獲得的同步化生長的細(xì)胞群體在生長分裂過程中的生理特性往往會受到生長條件變化所帶來的影響，因而并不能很好地反映正常細(xì)胞周期中的細(xì)胞生理性質(zhì)[16-18]。為了解決這一問題，Maruyama 和 Yanagita[17]通過物理的方法，在不改變細(xì)胞生理條件的情況下獲得同步化的細(xì)胞。他們利用堆疊的濾紙過濾處于對數(shù)生長期的 B 系大腸桿菌，分離獲得了較大與較小的兩類細(xì)胞，分別接種到新鮮培養(yǎng)基中時，均可獲得階梯狀增長的生長曲線。從生長曲線可以看出，較大的一類細(xì)胞是更接近細(xì)胞分裂的成熟細(xì)胞，較小的一類則是處于細(xì)胞周期中相對不成熟的狀態(tài)。相比于之前的同步化方法，通過堆疊濾紙過濾的方法可以獲得同步化效果較好的 B 系大腸桿菌。1963年，Helmstetter 和 Uretz[33]使用濾紙堆疊過濾的方法獲得同步化生長的大腸桿菌，并發(fā)現(xiàn)該菌對于 X 射線和紫外射線的敏感性并不是恒定不變的，而是隨著細(xì)胞周期的變化呈周期性變化。

雖然不少研究表明通過濾紙堆疊方法獲得的同步化大腸桿菌的同步化效果較好，但 Helmstetter等[19]認(rèn)為僅僅是根據(jù)大小篩選的原理并不能獲得如此高的同步化效果。隨后，Helmstetter 通過減少濾紙堆疊厚度發(fā)現(xiàn)，減少堆疊的濾紙可以獲得更好的同步化效果，從而搭建了基于膜洗脫原理的子細(xì)胞洗脫同步化裝置(Membrane-Elution Baby Machine)。該方法的實現(xiàn)要求細(xì)菌具有黏附在膜表面的能力，并可以在膜表面進行正常的生長分裂，而新分裂的新生子細(xì)胞則會被流動的培養(yǎng)基洗脫，通過收集較短時間內(nèi)分裂的子細(xì)胞可以獲得同步化程度較高的細(xì)胞群體。由于該方法沒有改變細(xì)菌生長過程中的生理條件，也不需要過于繁瑣的樣品處理步驟，黏附在膜上的細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)可以達到一個穩(wěn)定的生長狀態(tài)，因此通過這一方法獲得的同步化細(xì)胞受到的干擾較小，可以較好地反映細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)生長條件下的生理特性[34-36]。使用多聚賴氨酸對硝酸纖維素濾紙進行預(yù)處理可以將這一方法應(yīng)用到黏附性較差的 K 系大腸桿菌上，但富含氨基酸的培養(yǎng)基中帶電氨基酸的存在會極大地影響多聚賴氨酸介導(dǎo)的黏附作用，大大降低了同步化細(xì)胞的產(chǎn)量[37]。

2005 年，Bates 等[38]通過改造大腸桿菌鞭毛，使得大腸桿菌可在誘導(dǎo)劑的作用下黏附在玻璃微球表面，隨后將黏附了大腸桿菌的玻璃微球裝載至色譜柱中，可使用新鮮培養(yǎng)基進行洗脫。新分裂的細(xì)胞在沒有誘導(dǎo)劑的情況下將形成正常鞭毛，因此無法黏附在玻璃微球表面，將被流動的培養(yǎng)基帶出，通過收集洗脫下來的新生子細(xì)胞即可獲得同步化大腸桿菌。這一方法適用于任意培養(yǎng)基以及大多數(shù)含有鞭毛的細(xì)菌，其雖然進一步擴大了膜洗脫同步化方法的適用范圍，但同步化的效果相對較低，同步化程度約為 79%。2019年，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，Chang 等[39]在大腸桿菌 MG1655 一端表面展示綠色熒光蛋白 GFP，通過生物素化的 anti-GFP 抗體與鏈霉親和素包被的磁珠結(jié)合，得到人造磁細(xì)菌。使用磁場將人造磁細(xì)菌吸附在微流控芯片的通道頂部，新分裂的子細(xì)胞則可以被流動的新鮮培養(yǎng)基洗脫，從而獲得同步化細(xì)胞。這一方法充分利用了合成生物學(xué)的方法，結(jié)合微流控芯片技術(shù)，將基于膜洗脫原理的同步化方法應(yīng)用于黏附力較弱的 K 系大腸桿菌 MG1655，進一步擴大了膜洗脫同步化方法的應(yīng)用。

基于膜洗脫原理的同步化方法為大腸桿菌細(xì)胞周期研究提供了一個更為直接的方法。1968年，Cooper 和 Helmstetter[40]使用膜洗脫獲取新分裂子細(xì)胞的同步化方法研究大腸桿菌在細(xì)胞周期不同階段的 DNA 復(fù)制情況，直接測定了大腸桿菌在不同生長速率下的 C 期和 D 期，驗證了大腸桿菌快速生長狀態(tài)下的多復(fù)制叉同時進行DNA 合成以及緩慢生長狀態(tài)下存在 DNA 復(fù)制停止的間隙期兩種 DNA 復(fù)制模式，并提出了穩(wěn)態(tài)生長的細(xì)菌群體中每個細(xì)胞復(fù)制起點的群體平均數(shù)與生長速率的定量關(guān)系。2005 年，Bates等[41]使用顯微成像技術(shù)對同步化大腸桿菌進行實時監(jiān)測，觀察染色體和 DNA 復(fù)制復(fù)合體在細(xì)胞周期過程中的動態(tài)變化。

5.3 其他細(xì)菌

除了新月柄桿菌和大腸桿菌以外，科學(xué)家們同樣嘗試過許多其他細(xì)菌的同步化。例如，枯草芽孢桿菌可以通過芽孢的同步萌芽來獲得同步化細(xì)胞[42]。De Nisco 等[43]通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)菌嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)調(diào)控的方法獲得苜蓿中華根瘤菌的同步化細(xì)胞，并對同步化培養(yǎng)的根瘤菌進行了轉(zhuǎn)錄組分析。海洋中的藍細(xì)菌細(xì)胞周期與晝夜循環(huán)相關(guān)聯(lián)，因此通過周期性光照即可使藍細(xì)菌細(xì)胞周期同步化。Waldbauer 等[44]對同步化的藍細(xì)菌進行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析，探索藍細(xì)菌在白天光合作用固碳到晚上呼吸作用這一過程中所涉及的基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控。使用dnaA溫度敏感型突變株可以獲得結(jié)核分支桿菌的同步化細(xì)胞，Nair 等[45]和Bandekar 等[46]通過該方法分別分析了該菌細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄表達模式，預(yù)測其細(xì)胞周期相關(guān)基因的功能。

6 總結(jié)與展望

總體來說，細(xì)菌細(xì)胞周期同步化法可以分為條件轉(zhuǎn)變法、物理分離法和基于膜洗脫原理的子細(xì)胞裝置(Baby Machine)三大類[16,36]。條件轉(zhuǎn)變法包括周期性轉(zhuǎn)變溫度、轉(zhuǎn)變培養(yǎng)基營養(yǎng)、周期性光照等，其中根據(jù)條件轉(zhuǎn)變次數(shù)又可以分為周期性條件轉(zhuǎn)變和預(yù)轉(zhuǎn)變。周期性轉(zhuǎn)變是指周期性變換細(xì)菌生長的生理條件，使細(xì)菌細(xì)胞周期同步化。預(yù)轉(zhuǎn)變則是指通過化學(xué)試劑、營養(yǎng)下調(diào)等條件改變將細(xì)菌細(xì)胞可逆地阻斷在細(xì)胞周期的某個時期，去除化學(xué)阻斷劑或重新上調(diào)營養(yǎng)后，將不再改變細(xì)菌生長的生理條件，使細(xì)菌細(xì)胞在適宜的條件下同步地生長分裂。物理分離法則是利用細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞具有不同大小、密度或表面抗原等特性，通過離心、流式細(xì)胞技術(shù)、微流控芯片等物理方法分選出處于特定時期的細(xì)胞。例如，新月柄桿菌的密度梯度離心法就是根據(jù)新分裂的兩種子細(xì)菌的浮力密度差異對其進行分離。相比于條件轉(zhuǎn)變法，物理分離法是直接對混合培養(yǎng)的細(xì)菌進行分類分離，因為不改變細(xì)菌生長過程中的生理條件，不會對細(xì)菌細(xì)胞周期造成干擾，由此獲得的同步化細(xì)胞在同步化培養(yǎng)時的細(xì)胞周期特性更接近于正常穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)時的狀態(tài)。基于膜洗脫原理的子細(xì)胞裝置因為“母細(xì)胞”固定在裝置上，在流動的新鮮培養(yǎng)基中持續(xù)地生長分裂，經(jīng)一定的時間后可以達到穩(wěn)態(tài)生長，而且省去了物理分離法中繁瑣的樣品處理步驟，收集短時間內(nèi)新分裂的子細(xì)胞可以認(rèn)為是受到干擾最小的。

盡管條件轉(zhuǎn)變法對細(xì)菌的生理狀態(tài)干擾最大，但當(dāng)研究目標(biāo)是與改變的條件相關(guān)聯(lián)的事件時，使用該法進行同步化研究也可獲得有用的參考信息[47-52]。通過子細(xì)胞裝置獲得的同步化細(xì)胞受到的干擾最小，但其要求細(xì)菌能夠很好地黏附在材料表面，這極大地限制了該方法的適用性，同時其同步化細(xì)胞產(chǎn)量也不如物理分離法[35,38,53]。三種方法都有各自的優(yōu)缺點，不同的細(xì)菌適用不同的方法，在選擇使用方法時應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)繕?biāo)、細(xì)菌種類等實際情況仔細(xì)斟酌。

隨著顯微成像技術(shù)的發(fā)展，在單細(xì)胞水平上對細(xì)胞周期進行研究成為該類研究的一個重要方法[54-56]。但細(xì)胞周期同步化方法受到細(xì)菌類型、同步化產(chǎn)量、同步化質(zhì)量等因素的限制，使得同步化方法的研究及應(yīng)用難以普及。然而，細(xì)胞周期同步化方法不僅可以為研究提供大量的組學(xué)信息，也使許多生化與分子實驗技術(shù)，如 Western Blot、熒光實時定量 PCR 等技術(shù)得以應(yīng)用到研究當(dāng)中，同時細(xì)胞群體的同步化也能提高單細(xì)胞顯微成像分析過程中處于同一細(xì)胞周期階段的細(xì)胞數(shù)，使數(shù)據(jù)分析更具有統(tǒng)計意義[41,57-58]。大腸桿菌的細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然有許多不清晰的地方，DNA 復(fù)制與細(xì)胞分裂通過什么機制來調(diào)控偶聯(lián)在一起是目前人們比較關(guān)心的一個問題?；谀は疵摷夹g(shù)的大腸桿菌細(xì)胞周期同步化裝置——子細(xì)胞裝置，可以為研究人員提供干擾極小的同步化細(xì)胞，對于穩(wěn)態(tài)生長條件下的大腸桿菌細(xì)胞周期研究具有重要的意義。盡管這一方法受到菌株黏附能力的限制而不能很好地應(yīng)用到不同的菌株當(dāng)中，而隨著技術(shù)的發(fā)展，人們通過對細(xì)菌進行定向地改造，將逐漸克服這些限制。目前，合成生物學(xué)的快速發(fā)展也為克服細(xì)菌細(xì)胞周期同步化方法的限制帶來了新的技術(shù)和思路[38-39]，只要攻克了其中的短板問題，同步化方法必然會給細(xì)菌細(xì)胞周期研究帶來極大的推動作用。