DNA 合成技術(shù)與儀器研發(fā)進(jìn)展概述

江湘兒 王 勇 沈 玥

1(深圳華大生命科學(xué)研究院 深圳 518083)

2(廣東省高通量基因組測序與合成編輯應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 深圳 518120)

3(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院 深圳 518055)

1 引 言

合成生物學(xué)促進(jìn)了生命科學(xué)從基于觀測、描述及經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)躍升為可預(yù)測、可定量及可工程化的科學(xué)，并在醫(yī)療、能源、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、信息等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，潛力巨大，已成為各國科技戰(zhàn)略布局的必爭之地[1-5]。DNA 合成作為合成生物學(xué)的關(guān)鍵基礎(chǔ)性技術(shù)，其重要性堪比測序技術(shù)對基因組學(xué)的支撐[6]。合成技術(shù)及核心工具合成儀的創(chuàng)新，將解決合成生物學(xué)發(fā)展的限速問題；合成技術(shù)及核心工具合成儀的自主，也將標(biāo)志著合成生物學(xué)領(lǐng)域中關(guān)鍵“卡脖子”技術(shù)取得重要突破，并保障生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)自主發(fā)展。

DNA 合成原理主要包括化學(xué)法及生物法。其中，化學(xué)法(尤其是固相亞磷酰胺三酯合成法)最為成熟且被廣泛應(yīng)用，而有關(guān)生物法合成技術(shù)的一系列產(chǎn)業(yè)布局也陸續(xù)在歐美國家出現(xiàn)，但總體仍處于原理驗(yàn)證階段。自 20 世紀(jì) 80 年代開始，基于化學(xué)法原理的 DNA 合成儀經(jīng)歷了從柱式合成到高通量芯片合成的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。本文圍繞DNA 合成技術(shù)與儀器，系統(tǒng)闡述 DNA 合成方法及配套設(shè)備研制的進(jìn)展，并結(jié)合日益增長的需求與法律法規(guī)的完善對未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

2 DNA 合成技術(shù)

2.1 寡核苷酸合成技術(shù)概述

寡核苷酸(Oligonucleotide)是一類多個(gè)相鄰核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接的短鏈核苷酸(包括脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)內(nèi)的核苷酸)的總稱，其人工化學(xué)合成過程是一個(gè)多步連續(xù)的反應(yīng)，目標(biāo)產(chǎn)物的得率受合成過程中副反應(yīng)發(fā)生(如脫嘌呤等)的影響。因此，化學(xué)合成過程中一般先將不參與反應(yīng)的基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來，經(jīng)過一輪縮合反應(yīng)后再將上一輪被保護(hù)基團(tuán)上的保護(hù)基脫除下來，以形成目標(biāo)磷酸二酯鍵[7]。

寡核苷酸化學(xué)合成起步于 20 世紀(jì) 40 年代末。1955 年，劍橋大學(xué)的 Todd 實(shí)驗(yàn)室，第一次化學(xué)法成功合成了簡單二聚寡核苷酸，并獲得1957 年諾貝爾獎(jiǎng)(圖 1)[8]。1965 年，Khorana 等利用化學(xué)方法大量合成脫氧核苷的單一聚合物或2 種、3 種脫氧核苷的重復(fù)序列，同時(shí)將人工合成的 64 種核糖三糖苷用于研究蛋白質(zhì)的生物合成過程，從而確定了氨基酸的三聯(lián)密碼子，并獲得 1968 年諾貝爾獎(jiǎng)[8]。

圖1 首次化學(xué)合成寡核苷酸[8]Fig.1 The first attempt of oligonucleotides synthesis by chemistry[8]

隨后的 60 至 70 年代，寡核苷酸的化學(xué)合成方法不斷被完善，主要包括改善亞磷酰胺單體的穩(wěn)定性和反應(yīng)活性以提高單體偶聯(lián)步效率，以及優(yōu)化保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)活性和產(chǎn)物的穩(wěn)定性以提高氧化環(huán)節(jié)的氧化效率等。逐漸形成了今天被廣泛應(yīng)用的固相亞磷酰胺三酯合成法，該方法于 20世紀(jì) 80 年代由 Marvin Caruthers 課題組提出[7]。然而，由于每一步化學(xué)反應(yīng)的不完全性和副反應(yīng)的發(fā)生，隨著寡核苷酸合成鏈的延長，合成錯(cuò)誤率急劇上升，合成產(chǎn)物得率也顯著下降。此外，由于合成過程中需要大量使用有毒化學(xué)試劑，所產(chǎn)生的廢液、廢氣也需要特殊處理。為此，近年來科研人員發(fā)展了很多方法來提高合成效率、降低副反應(yīng)發(fā)生率。同時(shí)，嘗試開發(fā)不依賴有毒化學(xué)試劑的合成方法，主要包括光化學(xué)脫保護(hù)合成法、電化學(xué)脫保護(hù)合成法、氫膦酸酯合成法、兩步合成法、雙堿基單體合成法等寡核苷酸化學(xué)合成技術(shù)，以及基于末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase，TdT)等生物合成技術(shù)[9]?？傮w而言，DNA 合成技術(shù)發(fā)展歷程如圖 2 所示。

圖2 DNA 合成技術(shù)發(fā)展歷程Fig.2 The development of DNA synthesis technology

2.2 寡核苷酸化學(xué)法合成技術(shù)

2.2.1 亞磷酰胺三酯合成法

亞磷酰胺三酯合成法是最為廣泛使用的寡核苷酸合成法，也是目前國內(nèi)外主流 DNA 合成儀采用的合成方法，包括脫保護(hù)、偶聯(lián)、蓋帽和氧化 4 步循環(huán)(圖 3)[8-9]。按照預(yù)定堿基序列，通過液路系統(tǒng)依次在提前做好表面修飾的固相載體上加入相應(yīng)的 4 種亞磷酰胺合成單體(A、T、C、G)及其他必須的化學(xué)試劑，以完成指定寡核苷酸序列的合成。待合成后，通過氨氣或利用其他堿性條件，將產(chǎn)物從固相載體上切除并收集，即可獲得目標(biāo)堿基序列的寡核苷酸。但由于每一步化學(xué)反應(yīng)的不完全性和副反應(yīng)的發(fā)生(如脫保護(hù)過程中的脫腺苷等)，寡核苷酸合成鏈越長，合成效率越低，合成錯(cuò)誤率也越高，這極大地限制了寡核苷酸合成的長度及合成質(zhì)量。

圖3 亞磷酰胺三酯合成法原理[9]Fig.3 The mechanism of phosphoramide chemistry[9]

2.2.2 光化學(xué)脫保護(hù)合成法

按合成原理，光化學(xué)脫保護(hù)合成法可細(xì)分為光制酸脫保護(hù)合成法和光敏單體介導(dǎo)光控脫保護(hù)合成法(圖 4)[10-16]。光制酸脫保護(hù)技術(shù)原理為，光制酸前體通過光照產(chǎn)生酸，從而進(jìn)行 5′-二甲氧基三苯甲基(N,N-Dimethyltryptamine，DMT)保護(hù)基團(tuán)的脫保護(hù)。該技術(shù)遵循成熟的化學(xué)合成工藝，可以確保高效的偶聯(lián)效率和高保真的合成質(zhì)量。同時(shí)，該方法非常靈活，任意修飾的單體分子都可以用來合成一系列修飾寡核苷酸。但光制酸效率較低，需要復(fù)雜的光控條件，且儀器設(shè)計(jì)及操作也相對比較繁瑣。光敏單體介導(dǎo)光控脫保護(hù)合成法需要特定光敏保護(hù)基團(tuán)的合成單體，與傳統(tǒng)合成單體相比，同樣需要特殊避光保存，但反應(yīng)效率顯著降低，合成過程中容易產(chǎn)生更多隨機(jī)合成突變，導(dǎo)致合成序列保真度較低，因此限制了該方法的應(yīng)用。

圖4 光化學(xué)脫保護(hù)合成法原理[10]Fig.4 The mechanism of DNA synthesis by photochemical deprotection[10]

2.2.3 電化學(xué)脫保護(hù)合成法

與經(jīng)典亞磷酰胺 4 步法直接加入有機(jī)酸或利用光制酸脫保護(hù)技術(shù)光照原位生產(chǎn)酸相比，電化學(xué)合成法中脫保護(hù)過程所需酸的來源不同。該方法利用通電條件下，在電極陽極表面原位產(chǎn)生質(zhì)子酸，來脫除 DMT 保護(hù)基團(tuán)，隨后進(jìn)行常規(guī)的偶聯(lián)、蓋帽和氧化步驟，并進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。盡管該合成方法脫保護(hù)體系中加入了 2,6-二甲基吡啶作為有機(jī)堿，用來中和擴(kuò)散出來的酸以避免相鄰電極上的 DMT 基團(tuán)脫保護(hù)，但在高密度陣列反應(yīng)點(diǎn)中，當(dāng)相鄰距離過近時(shí)，則無法有效控制擴(kuò)散(圖 5)[17-21]。此外，該方式產(chǎn)生酸的效率較低，需要較長時(shí)間通電，且電化學(xué)過程對反應(yīng)環(huán)境較為敏感，致使合成穩(wěn)定性較低、合成錯(cuò)誤率偏高。

圖5 電化學(xué)脫保護(hù)合成法原理[21]Fig.5 The mechanism of DNA synthesis by electrochemical deprotection[21]

2.2.4 氫膦酸酯合成法

經(jīng)典亞磷酰胺 4 步法中，采用三價(jià)磷的亞磷酰胺為合成單體，該三價(jià)磷分子結(jié)構(gòu)易被氧化或與水反應(yīng)而變質(zhì)。為了保證高效的偶聯(lián)效率以及高保真的合成質(zhì)量，整個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)過程需要嚴(yán)格的無水無氧環(huán)境，這不可避免地增加了寡核苷酸合成過程控制的難度，繼而影響合成的成本。而氫膦酸酯合成法是將傳統(tǒng)的三價(jià)亞磷酰胺單體發(fā)展為五價(jià)磷單體，該單體在空氣環(huán)境下相對穩(wěn)定，理論上可以降低經(jīng)典亞磷酰胺四步法對水氧環(huán)境的要求(圖 6)[22-23]。然而，由于該方法的偶聯(lián)反應(yīng)活性比三價(jià)亞磷酰胺的低，導(dǎo)致合成效率也較低，因此限制了該方法的進(jìn)一步應(yīng)用。

圖6 氫膦酸酯合成法原理[22-23]Fig.6 The mechanism of DNA synthesis by H-phosphonate chemistry[22-23]

2.2.5 兩步合成法

兩步合成法的關(guān)鍵是用芳氧基羰基(Aryloxycarbonyl)取代 5′-DMT 封閉基團(tuán)，并且利用 N-二甲氧基三苯甲基保護(hù)腺嘌呤和胞嘧啶的環(huán)外氨基。通過這些修飾，每個(gè) 2′-脫氧核苷-3′-亞磷酰胺與固相載體上延伸的寡聚脫氧核苷酸偶聯(lián)之后，可用過氧陰離子緩沖溶液(pH＜10)處理。該過氧陰離子溶液不僅具有較強(qiáng)的親核性，還具有溫和的氧化性。其中，該試劑的強(qiáng)親核性能不可逆地除去 5′-氧-碳酸酯保護(hù)基團(tuán)，且其溫和的氧化電位能定量地氧化核苷酸之間的亞磷酸三酯，而不會(huì)氧化雜環(huán)堿基，一并完成氧化和脫保護(hù)兩個(gè)步驟。與此同時(shí)，在合成較短寡核苷酸鏈過程中，可以省略蓋帽步驟，從而實(shí)現(xiàn)兩步法合成(圖 7)[24]。但該方法所涉及的緩沖體系穩(wěn)定性較差，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，且省略蓋帽步驟會(huì)產(chǎn)生很多偶聯(lián)不完全的副產(chǎn)物，難以應(yīng)用于長鏈寡核苷酸的合成。

圖7 兩步合成法原理[24]Fig.7 The mechanism of DNA synthesis by two-step cycle chemistry[24]

2.2.6 雙堿基單體合成法

與經(jīng)典的亞磷酰胺三酯合成法相比，光化學(xué)脫保護(hù)合成法、電化學(xué)脫保護(hù)合成法、氫膦酸酯合成法和兩步合成法等新發(fā)展的生化體系，普遍存在合成效率不高及穩(wěn)定性較差等問題，較難實(shí)現(xiàn)長鏈寡核苷酸的高質(zhì)量合成，而雙堿基單體合成法則有望解決這些問題。其原理是基于較成熟的亞磷酰胺 4 步循環(huán)法，采用雙堿基亞磷酰胺單體作為基本反應(yīng)單元進(jìn)行合成反應(yīng)(圖 8)[25]。合成同樣長度的寡核苷酸序列，雙堿基單體合成法所需反應(yīng)循環(huán)數(shù)較亞磷酰胺 4 步循環(huán)法減半，因此雙堿基反應(yīng)效率大幅提升，且反應(yīng)錯(cuò)誤率也會(huì)相應(yīng)地降低。而在同樣的反應(yīng)循環(huán)數(shù)下，采用雙堿基合成法能快速高效地得到長鏈寡核苷酸目標(biāo)序列。其中，在＞200 nt 長鏈寡核苷酸高效合成時(shí)，雙堿基合成法更具優(yōu)勢。然而，當(dāng)前該方法的單體成本較高，且雙堿基單體溶解度較差而易結(jié)晶堵塞試劑管道，所需配套的儀器液路系統(tǒng)復(fù)雜度高，因此暫未形成基于該方法的設(shè)備與應(yīng)用。隨著雙堿基單體大規(guī)模制備工藝的逐步完善，及硬件系統(tǒng)設(shè)計(jì)與搭建能力的不斷提升，有望研制出基于該方法的合成儀，從而在合成成本、合成錯(cuò)誤率及合成長度等方面實(shí)現(xiàn)技術(shù)突破。

圖8 雙堿基單體合成法原理[25]Fig.8 The mechanism of DNA synthesis by dimer phosphoramide chemistry[25]

2.3 寡核苷酸生物法合成技術(shù)

如上所述，傳統(tǒng)亞磷酰胺化學(xué)合成法受化學(xué)反應(yīng)效率限制，DNA 合成產(chǎn)物長度僅能達(dá)到約 200～250 nt[26]，極大地限制了下游應(yīng)用。合成過程中涉及強(qiáng)酸、強(qiáng)氧化劑，產(chǎn)生較多對環(huán)境有害的化學(xué)廢液，導(dǎo)致后續(xù)處理費(fèi)用高昂。而生物酶法 DNA 合成技術(shù)通常在水相環(huán)境下進(jìn)行，可有效避免上述問題，并有望以更低的成本合成更長的 DNA 分子[27-31]。2020 年 10 月，Nature Biotechnology《自然生物技術(shù)》雜志在題為“Enzymatic DNA synthesis enters new phase”的新聞報(bào)道中提到，一些新創(chuàng)公司把酶法合成作為更快且更高效合成長鏈 DNA 分子的新技術(shù)手段，同時(shí)極大地降低了合成和 DNA 鏈的組裝成本[32]。

DNA 分子的體內(nèi)合成主要是由各種 DNA 聚合酶催化并依賴于 DNA 模板進(jìn)行合成。DNA 末端轉(zhuǎn)移酶和部分種類的 DNA 聚合酶卻可以不依賴于已有的 DNA 模板分子，直接催化 DNA 鏈的合成[33-34]。發(fā)展基于生物酶的 DNA 合成新技術(shù)，并結(jié)合同源重組等體內(nèi)組裝方法，可以使寡核苷酸合成長度和準(zhǔn)確度提升數(shù)個(gè)量級(jí)，這將極大地提高利用合成生物學(xué)設(shè)計(jì)與構(gòu)建的能力。同時(shí)，這一技術(shù)也將促進(jìn)如 DNA 數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和新材料的設(shè)計(jì)制造等新興領(lǐng)域的重大突破。與 DNA 化學(xué)法合成相比，生物酶法合成潛力巨大，有望在合成長度和產(chǎn)量方面實(shí)現(xiàn)顯著提升，并大幅降低成本[35]。

2.3.1 TdT 酶介導(dǎo)的酶促合成反應(yīng)

TdT 酶介導(dǎo)的酶促合成反應(yīng)是目前酶法合成DNA 的研究熱點(diǎn)。TdT 是一種非模板依賴性酶，通常以隨機(jī)方式延伸 DNA 鏈，可將 4 種天然堿基加到 DNA 鏈的 3′端[33-34,36]。如何控制反應(yīng)的啟動(dòng)與終止，實(shí)現(xiàn)某一特定序列的片段合成，是利用該酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)從頭合成 DNA 的關(guān)鍵問題。此外，酶促反應(yīng)的催化效率、酶對修飾單體的特異性以及單體的特異性添加問題，亦是難點(diǎn)。

從 2013 年開始，3 家以 TdT 酶為基礎(chǔ)的DNA 合成公司：Molecular Assemblies、DNA Script 和 Nuclera 相繼成立。該方法本質(zhì)上都是通過修飾核苷酸分子，化學(xué)合成帶有可逆終止基團(tuán)的核苷酸單體，然后利用 TdT 酶將堿基不斷地添加到所合成序列的末端。其原理是通過化學(xué)反應(yīng)控制核苷酸分子上的化學(xué)修飾基團(tuán)，使該酶每次只能延伸目標(biāo)單堿基，隨后除去終止基團(tuán)并開始下一個(gè)目標(biāo)堿基的合成，最終實(shí)現(xiàn)控制 DNA鏈中目標(biāo)堿基的有序連接(圖 9)[29-30,37-40]。鑒于TdT 酶對其所修飾的基團(tuán)要求極高，該方法前期投入較大，需耗費(fèi)大量的人力和物力進(jìn)行蛋白質(zhì)改造研究及化學(xué)修飾基團(tuán)篩選。

圖9 TdT 酶介導(dǎo)的酶促合成反應(yīng)[29-30,37-40]Fig.9 Enzymatic DNA Synthesis by TdT[29-30,37-40]

2.3.2 TdT-dNTP 交聯(lián)體介導(dǎo)的酶促合成反應(yīng)

由 Dan Arlow 和 Sebastian Palluk 等人于 2018年共同成立的 Ansa Biotechnologies 公司(https://ansabio.com/)，針對 TdT 酶難以接受修飾核酸的問題，提出 TdT-dNTP 交聯(lián)體介導(dǎo)的可逆終止合成法。TdT 酶與單獨(dú) 3′端帶可逆接頭的脫氧核苷三磷酸(dNTP)結(jié)合，當(dāng)新合成鏈的 3′端暴露出來時(shí)，該 TdT 酶與核苷酸的偶聯(lián)物就能連接上去，新目標(biāo)堿基也隨之被引入。同時(shí)，TdT酶繼續(xù)停留在 3′端上阻止其他偶聯(lián)物繼續(xù)添加(圖 10)[34,41-42]。與 TdT 酶介導(dǎo)的生物酶法合成相比，該策略由于要先將 TdT 酶與核苷酸偶聯(lián)，導(dǎo)致 TdT 酶消耗量更大。

圖10 TdT-dNTP 交聯(lián)體介導(dǎo)的酶促合成反應(yīng)原理[34]Fig.10 TdT-dNTP conjugates for reversible termination of primer elongation[34]

2.3.3 混合酶介導(dǎo)的酶促反應(yīng)

成立于 2016 年的英國 Camena Bioscience 公司利用特定組合的酶在三核苷酸異構(gòu)體中實(shí)現(xiàn)無模板的 DNA 合成。它們的從頭酶法合成和基因組裝技術(shù)叫 gSynthTM，每條引物的 3′端都由可逆終止核苷酸(rtNTP)組成，包含特定組合的酶或有末端轉(zhuǎn)移酶活性的核糖酶，通過不斷的重復(fù)延伸，合成 300 nt 長度的引物(圖 11)[43-44]。與同為 300 nt 長度堿基的合成片段相比，因其減少了連接步驟，故準(zhǔn)確率較化學(xué)法合成有明顯提升。該公司于 2020 年初，利用自己特有技術(shù)與平臺(tái)從頭合成了 2.7 kb 長度的質(zhì)粒(pUC19)，亦證明該方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，未來可應(yīng)用于蛋白改造及微生物菌株構(gòu)建等領(lǐng)域。

圖11 混合酶介導(dǎo)的酶促反應(yīng)[43-44]Fig.11 Multiplexed enzymatic DNA synthesisTM[43-44]

此外，Kern Systems 公司從 DNA 存儲(chǔ)的應(yīng)用需求出發(fā)，采用一種免修飾的策略合成DNA。該方法利用兩種酶之間的競爭，首先 TdT酶將核苷酸整合到 DNA 鏈末端，此時(shí)體系內(nèi)存在另一種酶——三磷酸腺苷雙磷酸酶作為核酸降解酶，可以使體系中核苷酸濃度降低，最終導(dǎo)致無法進(jìn)行新一輪的合成[45]。該方法因不能嚴(yán)格控制堿基的添加與終止，可能會(huì)導(dǎo)致合成錯(cuò)誤率較高。但通過加入特定冗余及糾錯(cuò)機(jī)制等方式可以實(shí)現(xiàn)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行 DNA 存儲(chǔ)[46]。

迄今為止，以上提及的 6 家酶法合成公司先后已獲得超過 1.5 億美元的融資，但整體仍處于概念驗(yàn)證階段，尚未達(dá)到大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用水平(表 1)。我國亦有如中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所及湖南大學(xué)等科研院校的研發(fā)團(tuán)隊(duì)在生物法合成方向有所布局。

表1 主流生物酶法合成公司概覽Table 1 Enzymatic DNA synthesis companies

3 DNA 儀器研發(fā)

3.1 儀器發(fā)展概述

DNA 合成儀是 DNA 合成的核心裝備。自20 世紀(jì) 90 年代起，以美英為首的西方發(fā)達(dá)國家在經(jīng)典化學(xué)合成法原理基礎(chǔ)上開始了 DNA 合成儀的研發(fā)與商業(yè)化，經(jīng)歷了從第一代柱式合成儀到第二代高通量芯片合成儀兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。目前，第一代柱式合成儀有多款機(jī)型在市場上流通，其中接受度較高的代表是 Bioautomation-Mermade 和 Biolyitc-Dr.Oligo 系列合成儀。第二代高通量芯片合成儀于 2000 年面世，根據(jù)其技術(shù)原理的不同，大致分為 5 類，包括美國 LC Sciences 公司為代表的光脫保護(hù) μParaflo 合成儀、美國 CustomArray 公司為代表的電化學(xué)合成技術(shù)合成儀(于 2017 年被金斯瑞生物收購)、美國 Agilent Technologies 及 Twist Bioscience 公司為代表的噴墨打印合成儀、英國 Evonetix 公司為代表的集成電路控制合成儀(僅發(fā)布技術(shù)，未見商業(yè)機(jī)器發(fā)布)及中國華大基因?yàn)榇淼幕谛酒诌x原理的高通量合成儀等[9,47-50]。其中，國外以美國 Twist Bioscience 公司的高通量噴墨合成儀的綜合性能較為突出。盡管基于生物酶法合成技術(shù)(如 TdT 酶合成法)陸續(xù)在歐美國家出現(xiàn)一系列產(chǎn)業(yè)布局，但總體仍處于原理驗(yàn)證階段，而國內(nèi)對該領(lǐng)域的布局較晚，尚未出現(xiàn)商業(yè)化設(shè)備(圖 12)。

圖12 DNA 合成儀匯總Fig.12 The summary of DNA synthesizers

3.2 基于化學(xué)合成法的合成儀

3.2.1 一代柱式合成儀

柱式合成儀的合成載體為管道合成柱，其內(nèi)部填充的可控多孔玻璃為真正的反應(yīng)介質(zhì)。柱式合成儀通過電腦程序控制與可控多孔玻璃反應(yīng)試劑的加入，最終合成單鏈 DNA。目前國際上具有柱式 DNA 合成儀自主研發(fā)和生產(chǎn)能力的研究機(jī)構(gòu)及企業(yè)主要集中在發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，包括美國的 GE、ABI、貝克曼庫爾特、Biolytic、Bioautomation、Synthomics 等公司，德國的 K&A Laborgeraete、PolyGen 等公司，韓國的 Bioneer 公司，丹麥的 TAG Copenhagen A/S，日本的瑞翁醫(yī)療株式會(huì)社等①：美國 GE (https://www.gehealthcare.cn/)，美國 ABI (https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/brands/applied-biosystems.html)，貝克曼庫爾特(https://www.beckmancoulter.cn/)，Biolytic (https://www.biolytic.com/)，Bioautomation (https://bioautomation.com/)，Synthomics (https://tracxn.com/d/companies/synthomics.com)，K &A Laborgeraete (https://www.dna-synthesizer.de/company/)，PolyGen(http://www.polygen.de/index.html)，TAG Copenhagen A/S (http://tagc.dk/)，瑞翁醫(yī)療株式會(huì)社 (https://www.zeonmedical.co.jp/c/)。隨著寡核苷酸合成需求的不斷提升，國內(nèi)也涌現(xiàn)出多家開發(fā)一代柱式合成儀的公司，如北京擎科生物科技有限公司、上海儀鉑生物科技有限公司、江蘇領(lǐng)坤生物科技有限公司、北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司等。

當(dāng)前，柱式合成儀單批次合成通量最高可達(dá) 1 536 條寡核苷酸，最大合成長度一般在150～200 nt，超過該長度以后，每步副反應(yīng)和合成效率會(huì)顯著影響寡核苷酸的序列準(zhǔn)確性與產(chǎn)率。產(chǎn)量一般在 0.5～1 000 nmol 水平，合成錯(cuò)誤率約為 1/1 000 nt，成本為 0.05～0.5 元/nt。盡管1 536 通量的一代柱式合成儀的較早期低通量型號(hào)設(shè)備在合成時(shí)間和效率已有較大提高，但仍無法從根本上大幅降低單堿基合成成本，繼而無法滿足捕獲探針、大規(guī)模基因合成及 DNA 存儲(chǔ)等通量較高的應(yīng)用需求。因此，通過技術(shù)創(chuàng)新以提升通量、降低合成成本成為當(dāng)下亟待解決的難題。

3.2.2 二代高通量芯片合成儀

芯片合成儀是以芯片為合成載體，其單張芯片可實(shí)現(xiàn)成千上萬條長度不等的單鏈 DNA 合成。該類型設(shè)備可在提供高通量合成的同時(shí)，降低試劑的消耗，初步實(shí)現(xiàn)低成本高通量的寡核苷酸合成。其中，國外技術(shù)與市場布局發(fā)展較早，前期技術(shù)積累超過 10 年。相比一代技術(shù)，二代技術(shù)通量高、成本低，但目前市場上尚無商業(yè)化儀器，僅提供技術(shù)服務(wù)。根據(jù)合成原理，高通量合成儀主要包括 5 類(表 2)。

表2 二代高通量芯片合成儀代表性公司概覽Table 2 The high throughput chip-based DNA synthesizers and corresponding companies

3.2.2.1 光化學(xué)原理

LC Sciences 公司基于光脫保護(hù)原理的高通量DNA 合成儀，采用數(shù)字化光源投影技術(shù)，將電腦可控的高分辨率多點(diǎn)平行光投影到反應(yīng)位點(diǎn)，通過光照來控制各反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)，以控制每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行合成反應(yīng)。相較于一代合成儀，該裝置利用微流控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)合成過程中所需單體等試劑的可控輸送，使試劑消耗量少、單堿基合成成本低。但目前單循環(huán)得率約為 98.5%，不適合較長寡核苷酸的合成，且微流控芯片加工制作復(fù)雜，合成通量較難大幅提升，需要從脫保護(hù)效率及光控系統(tǒng)的精確度上進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)[10-16]。

3.2.2.2 電化學(xué)原理

CustomArray 公司基于電化學(xué)原理的高通量DNA 合成儀是目前唯一被商業(yè)化的高通量芯片DNA 合成儀。通過電化學(xué)脫保護(hù)將合成反應(yīng)縮小到微米級(jí)別的反應(yīng)孔內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)一張芯片上集成上萬個(gè)反應(yīng)點(diǎn)。該原理的優(yōu)點(diǎn)是試劑(堿基單體等)消耗量少，單堿基合成成本極低；通量高(12 000～90 000)，一次可合成高達(dá)上萬種單鏈 DNA。缺點(diǎn)是單位點(diǎn)的產(chǎn)量低、合成效率不穩(wěn)定及錯(cuò)誤率高[17-21]。未來，可在芯片設(shè)計(jì)與加工工藝方面進(jìn)行設(shè)計(jì)與優(yōu)化，最大程度避免氫離子串?dāng)_的問題，以進(jìn)一步提高合成質(zhì)量。

3.2.2.3 噴墨打印原理

Agilent 公司最早實(shí)現(xiàn)利用噴墨打印原理進(jìn)行 DNA 合成，隨后，Twist 公司進(jìn)一步改進(jìn)合成芯片的設(shè)計(jì)，并開發(fā)了高通量 DNA 合成儀。該技術(shù)利用高速的微量噴墨打印作為單體等試劑的輸送方式，在特殊處理的微米級(jí)硅基通孔上合成寡核苷酸，可實(shí)現(xiàn)上百萬條寡核苷酸的高通量合成，再利用匹配的反應(yīng)器與這些微孔對接，進(jìn)行原位的 DNA 拼接和組裝，從而直接得到大量長片段的 DNA 分子[51-52]。該合成儀集成了微流控技術(shù)、半導(dǎo)體加工技術(shù)和分子組裝技術(shù)等一系列前沿技術(shù)。由于合成通量依賴芯片反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)量，如需進(jìn)一步提高芯片反應(yīng)位點(diǎn)密度，則要提供更為復(fù)雜的半導(dǎo)體精加工技術(shù)以及可實(shí)現(xiàn)針對高密度反應(yīng)位點(diǎn)的超高打印精度噴頭，因此較難進(jìn)一步降低成本。此外，其微量生化反應(yīng)體系中 DNA 合成產(chǎn)物的載量僅能達(dá)到 fmol 水平，需要通過擴(kuò)增的方式提升載量，但難以達(dá)到pmol～nmol 的水平。

3.2.2.4 集成電路控制原理

Evonetix 公司基于集成電路控制原理的高通量 DNA 合成儀，通過在具有特殊設(shè)計(jì)的大規(guī)?？蓪ぶ返暮铣晌稽c(diǎn)的封閉腔室內(nèi)，加入低熔點(diǎn)的可反復(fù)加熱的阻斷材料，利用電路信號(hào)控制位點(diǎn)的通電與否對其進(jìn)行加熱。在加熱情況下，特殊材料可吸附在相應(yīng)位點(diǎn)上，并阻止后續(xù)通入的試劑在其上反應(yīng)，如需在該位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)合成，可用溶劑將該材料清洗掉，使該位點(diǎn)暴露出來以進(jìn)行合成反應(yīng)[53]。Evonetix 公司合成儀的核心技術(shù)是在接近十億個(gè)位點(diǎn)的寡核苷酸合成和可實(shí)時(shí)監(jiān)測的高保真 DNA 糾錯(cuò)組裝技術(shù)(暫無相關(guān)公開信息)，但該技術(shù)還處于研發(fā)階段，實(shí)際應(yīng)用效果還有待驗(yàn)證。

3.2.2.5 基于分選的高通量并行合成原理

華大基因自主研制的基于分選的高通量并行合成原理的 DNA 合成儀，按照預(yù)合成序列信息將帶有特殊標(biāo)記的芯片合成載體，快速移動(dòng)并依次排列，集合到相應(yīng)的反應(yīng)腔室中進(jìn)行堿基合成延伸，反應(yīng)結(jié)束后回收芯片進(jìn)入下一個(gè)合成循環(huán)，直至序列合成完畢。該技術(shù)原理的優(yōu)勢包括：(1)芯片加工工藝簡單，無需復(fù)雜的微陣列芯片加工工藝，且可重復(fù)使用，對成本控制有利；(2)合成通量拓展靈活性大，合成通量取決于合成載體和反應(yīng)腔室大小，通量提升不依賴于復(fù)雜加工工藝；(3)帶有特殊標(biāo)記的芯片合成載體可單獨(dú)分離，從而實(shí)現(xiàn)合成產(chǎn)物回收的可控。目前，華大基因自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)高通量合成儀技術(shù)與儀器設(shè)計(jì)均已申請多項(xiàng)自主核心專利，并完成了原型機(jī)及多款升級(jí)機(jī)型的搭建和測試。目前最高通量達(dá) 10 萬級(jí)，在錯(cuò)誤率(約 1‰～3‰)及合成載量(＞pmol 級(jí)別)方面具有突出優(yōu)勢，有望快速實(shí)現(xiàn)合成成本的指數(shù)級(jí)下降。由于芯片在連續(xù)分選和物理轉(zhuǎn)移過程中會(huì)導(dǎo)致表面磨損，進(jìn)而影響芯片的可識(shí)別性，因此未來需要從芯片選材及結(jié)構(gòu)加工上進(jìn)一步提升其物理兼容性。

3.3 基于生物酶法合成的合成儀

DNA Script 公司基于生物酶技術(shù)，于 2020年推出了世界上首臺(tái)桌面型 DNA 酶促打印機(jī)。據(jù)其官網(wǎng)(https://dnascript.com/products/)介紹，單孔產(chǎn)量可達(dá) 200 pmol，單步反應(yīng)效率高達(dá)99.5%，合成過程中無需有機(jī)試劑，比現(xiàn)有化學(xué)法 DNA 合成儀器更環(huán)保，可大大提升 DNA合成的普及性。2021 年 2 月，DNA Script 獲得Baseclick 公司授權(quán)售賣含該公司試劑的試劑盒，從而使用戶可通過點(diǎn)擊化學(xué)(Click Chemistry)進(jìn)行修飾引物的合成，借此加快分子診斷研發(fā)進(jìn)程。此外，Molecular Assembly、Ansa Biotechnologies 等公司也在積極研究新的酶法合成技術(shù)，期望打破現(xiàn)有化學(xué)法合成的技術(shù)壁壘，以生產(chǎn)出長序列、高質(zhì)量、特定序列的DNA，但均暫未見配套儀器。

4 總結(jié)與展望

從 20 世紀(jì) 80 年代開始，DNA 合成經(jīng)歷了從第一代柱式合成到第二代高通量芯片合成兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。第一代柱式合成儀自 20 世紀(jì) 90 年代起開始商業(yè)化，而我國在合成儀器研發(fā)上起步相對較晚，當(dāng)前國內(nèi)各大 DNA 合成服務(wù)商的核心零部件或儀器大部分依賴于進(jìn)口。隨著 DNA 合成市場需求的迅速增長，自 2000 年起，歐美國家便開始部署高通量芯片合成儀研發(fā)。然而，高通量芯片合成技術(shù)發(fā)展至今，仍普遍存在以下局限性：(1)受生化效率影響，合成長度難以提升，且錯(cuò)誤率較高；(2)合成產(chǎn)物處于混合狀態(tài)，無法高效分離單種寡核苷酸，且質(zhì)量均一性不穩(wěn)定；(3)不適用于高通量基因組裝(原位組裝及自動(dòng)化拼接)；(4)合成產(chǎn)物的載量基本在 0.1～100 fmol水平，難以顯著提升。這些問題極大地限制了基于高通量芯片技術(shù)的下游應(yīng)用發(fā)展。為解決以上技術(shù)瓶頸，華大基因自主研制了基于芯片分選原理的高通量合成儀，綜合了一代柱式的高質(zhì)量合成和二代芯片的高通量合成優(yōu)勢，能更好地兼容下游各種需求，標(biāo)志著我國在全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)DNA 合成技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)重大突破。

隨著生命科學(xué)、合成生物學(xué)以及生物與信息技術(shù)交叉融合新興領(lǐng)域(如 DNA 存儲(chǔ))的快速發(fā)展，對 DNA 合成的需求量與性能提出了更高的要求，全球寡核苷酸合成市場預(yù)計(jì)將由 2021 年的 69 億美元，增長到 2026 年的 141 億美元，年復(fù)合增長率達(dá) 17.6%[27]。然而，現(xiàn)有的 DNA 合成技術(shù)和合成儀性能，仍難以從通量、質(zhì)量、成本及載量等方面滿足日益增長的 DNA 合成需求。此外，隨著全球生態(tài)和環(huán)境問題的日益嚴(yán)重，基于化學(xué)法的 DNA 合成技術(shù)將面臨較大的挑戰(zhàn)，而生物酶法合成潛力巨大，有望成為未來 DNA 合成技術(shù)的重要發(fā)展方向。近年來，歐美國家陸續(xù)出現(xiàn)如 Molecular Assemblies、DNA Script 等代表性的初創(chuàng)公司，盡管大都處于概念驗(yàn)證階段，尚未形成大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用，但相較我國，已儲(chǔ)備一定的先發(fā)優(yōu)勢。從科研產(chǎn)業(yè)需求以及戰(zhàn)略布局的雙重考量出發(fā)，我國都應(yīng)加大投入，快速推進(jìn)。

此外，合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展也對國家安全監(jiān)管體系帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。2021 年 4 月 15 日，《中華人民共和國生物安全法》正式施行，該法梳理了包括生物技術(shù)發(fā)展在內(nèi)的當(dāng)前我國生物安全領(lǐng)域存在的主要風(fēng)險(xiǎn)及防控制度。只有真正掌握以 DNA 合成為基礎(chǔ)的合成生物學(xué)創(chuàng)新技術(shù)體系，早日突破歐美國家“卡脖子”的技術(shù)封鎖，引領(lǐng)全球該領(lǐng)域第一梯隊(duì)，為我國生命科學(xué)的自主發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，方能在未來可能發(fā)生的生物戰(zhàn)爭中最大程度地保障國家安全。