高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)測(cè)試

王 忠 崔金明* TOKUYASU Taku Andrew

1(廣州中國科學(xué)院先進(jìn)技術(shù)研究所 廣州 511458)

2(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

細(xì)胞電穿孔技術(shù)又稱電轉(zhuǎn)染技術(shù)，是細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)中常用的一種途徑，最早在 1982 年由Neumann 等[1]報(bào)道。該技術(shù)通過施加一定的電場(chǎng)強(qiáng)度可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜，在細(xì)胞膜上形成小孔或通路，從而將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞內(nèi)[2]，是基因工程領(lǐng)域以及新興的合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。目前，市場(chǎng)上的電穿孔儀多為傳統(tǒng)電穿孔儀，包括一個(gè)電壓發(fā)生器和一個(gè)帶有兩個(gè)金屬電極的標(biāo)準(zhǔn)電擊杯。其中，標(biāo)準(zhǔn)電擊杯的電極間距一般為1 mm，電穿孔時(shí)需要對(duì)其施加幾百伏到幾千伏的電壓，存在操作危險(xiǎn)、依賴人工操作、難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化運(yùn)行等局限性。為解決傳統(tǒng)電穿孔儀的局限，微型電穿孔技術(shù)在 2000 年被首次提出[3]。微型電穿孔儀彌補(bǔ)了傳統(tǒng)電穿孔儀的部分不足，能夠提高細(xì)胞存活率和細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，甚至實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的電穿孔操作[4-9]，但微型電穿孔儀處理的細(xì)胞數(shù)量偏少，而在生物學(xué)實(shí)際應(yīng)用中，往往需要一定的細(xì)胞數(shù)量，才能獲得足夠的基因型和表型多樣性用于篩選。為此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置，既降低了細(xì)胞電穿孔所需電壓，又能高通量操作，提高細(xì)胞處理量。

2 高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置設(shè)計(jì)

細(xì)胞電穿孔的成功率主要受電場(chǎng)強(qiáng)度、電壓波形、電壓持續(xù)時(shí)間、溫度和 pH 等多種因素的影響[10-16]。本研究從降低細(xì)胞電穿孔所需電壓以及提高細(xì)胞處理量的角度出發(fā)，設(shè)計(jì)了一種由絕緣薄膜隔離電極的高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置。其中，采用電絕緣的聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride，PVC)薄膜來隔離兩個(gè)電極，二者的間距完全由 PVC 薄膜的厚度決定。本實(shí)驗(yàn)采用厚度為 0.08 mm(80 μm)的PVC 薄膜，因而電極間距為 80 μm。

該細(xì)胞電穿孔裝置的電極間距比實(shí)驗(yàn)室常用的標(biāo)準(zhǔn)電擊杯(毫米級(jí))低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但又比微型電穿孔儀采用的電極間距(微米級(jí))高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，因而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電穿孔所需的電壓比標(biāo)準(zhǔn)電擊杯明顯降低，而每次細(xì)胞電穿孔的處理量又比微型電穿孔儀多；同時(shí)，裝置的出入口可以通過硅膠軟管與蠕動(dòng)泵或注射器相連，實(shí)現(xiàn)高通量操作，顯著提高細(xì)胞處理量，提高實(shí)驗(yàn)效率。該細(xì)胞電穿孔裝置的實(shí)物圖、三維模型的剖視圖和爆炸視圖如圖 1 和圖 2 所示。

圖1 由薄膜隔離電極的高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置Fig.1 High throughput and small distance electroporation device with thin film isolated electrodes

圖2 剖視圖和爆炸視圖Fig.2 Cutaway view and explosion view

3 實(shí)驗(yàn)測(cè)試

為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)裝置的細(xì)胞電穿孔情況并測(cè)量電穿孔的效率，分別采用大腸桿菌 MG1655 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pUC57、畢次酵母 GS115 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pPIC9K進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)測(cè)試。為了避免引入其他不確定因素，采用實(shí)驗(yàn)室常用的 Bio-Rad MicroPulser 電穿孔儀作為脈沖發(fā)生器，對(duì)該高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置和 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯進(jìn)行對(duì)比測(cè)試。為能測(cè)試不同電壓條件下的電穿孔效果，在電穿孔電路中設(shè)置了一個(gè)分壓電阻。電穿孔實(shí)驗(yàn)原理圖和實(shí)物圖分別如圖 3 和圖 4 所示。

圖3 電穿孔實(shí)驗(yàn)原理圖Fig.3 Schematic diagram of the electroporation experiment

圖4 電穿孔實(shí)驗(yàn)實(shí)物圖Fig.4 Picture of the electroporation experiment

3.1 大腸桿菌 MG1655 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pUC57 測(cè)試

(1)菌株：E.coliMG1655 購自 Invitrogen公司。

(2)質(zhì)粒：pUC57 購自 Novagen 公司，質(zhì)粒濃度為 122.127 ng/μL。

(3)實(shí)驗(yàn)參數(shù)：選擇 Bio-Rad MicroPulser 電穿孔儀的 Manual 模式，設(shè)定脈沖電壓；該高通量小間距電穿孔裝置的兩個(gè)電極之間的電穿孔腔體體積為 2 μL，控制脈沖發(fā)生器每 5 s 施加一次脈沖電壓，設(shè)定注射泵的注射速度為 0.4 μL/s，以確保流過裝置的細(xì)胞液完全接受脈沖電壓的作用。

(4)實(shí)驗(yàn)過程：往 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入 1 μL 質(zhì)粒，混勻后通過注射泵以 0.4 μL/s的速度注入電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔(整個(gè)操作在冰水環(huán)繞環(huán)境下進(jìn)行)。為了探索不同電壓情況下的細(xì)胞電穿孔效果，分別采用 200 V、220 V、240 V、260 V、280 V 和 300 V 電壓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)照組，往 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入1 μL 質(zhì)粒，置于 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯內(nèi)，施加大腸桿菌通常采用的 1.8 kV 脈沖電壓進(jìn)行細(xì)胞電穿孔。電穿孔后，先將細(xì)胞液與 900 μL SOC 緩沖液混合，放入 37 ℃ 搖床復(fù)蘇 1 h；然后，將細(xì)胞液涂布于含卡那霉素(終濃度為 50 mg/μL)的 LB(Luria-Bertani)瓊脂培養(yǎng)基上，放入 37 ℃ 溫箱過夜培養(yǎng)，第 2 天早上統(tǒng)計(jì) LB 瓊脂板上的菌落數(shù)。

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第 2 天早上發(fā)現(xiàn) 6 種測(cè)試電壓下的 LB 瓊脂板上均有菌落長(zhǎng)出，表明這些電壓條件下都有細(xì)胞成功電穿孔，菌落數(shù)量及轉(zhuǎn)化效率計(jì)算結(jié)果如表 1 所示。其中，電穿孔轉(zhuǎn)化效率計(jì)算公式為：

表1 電穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of electroporation experiments

E.coliMG1655 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pUC57 的電穿孔實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于采用 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，雖然該電穿孔裝置成功進(jìn)行電穿孔所需的電壓降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但是電穿孔轉(zhuǎn)化效率也降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

3.2 畢次酵母轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pPIC9K 測(cè)試

(1)菌株：Pichia pastorisGS115 購自Invitrogen 公司。

(2)質(zhì)粒：pPIC9K 購自 Invitrogen 公司，質(zhì)粒濃度為 224.600 ng/μL。

(3)實(shí)驗(yàn)參數(shù)：依然選擇 Bio-Rad MicroPulser電穿孔儀的 Manual 模式，設(shè)定脈沖電壓；控制脈沖發(fā)生器每 5 s 施加一次脈沖電壓，設(shè)定注射泵的注射速度為 0.4 μL/s，以確保流過裝置的細(xì)胞液完全接受脈沖電壓的作用。

(4)實(shí)驗(yàn)過程：往 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入 1 μL 質(zhì)粒，混勻后通過注射泵以 0.4 μL/s的速度注入電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔(整個(gè)操作在冰水環(huán)繞環(huán)境下進(jìn)行)，電穿孔電壓采用 150 V。作為對(duì)照組，往 100 μL 的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入1 μL 質(zhì)粒，置于 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯內(nèi)，施加畢次酵母通常采用的 1.5 kV 脈沖電壓進(jìn)行細(xì)胞電穿孔。電穿孔后，先將細(xì)胞液與 900 μL 1 mol/L 的D-山梨醇溶液混合，放入 30 ℃ 搖床復(fù)蘇 1 h；然后，將細(xì)胞液涂布于 MD (Minimal Dextrase) 培養(yǎng)基平板上，放入 30 ℃ 溫箱中培養(yǎng) 3 天，第 4天早上統(tǒng)計(jì) MD 平板上的菌落數(shù)。

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第 4 天早上發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的MD 平板上有菌落長(zhǎng)出，但菌落數(shù)量比對(duì)照組低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，如圖 5 所示。

圖5 畢次酵母轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pPIC9K 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of plasmid pPIC9K transfected by Pichia pastoris

畢次酵母轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pPIC9K 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于采用 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，該電穿孔裝置成功進(jìn)行電穿孔所需的電壓降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但電穿孔轉(zhuǎn)化效率也降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)采用電絕緣的 PVC 薄膜，設(shè)計(jì)了一種電極間距為 0.08 mm(80 μm)的電穿孔裝置，加工制作方便，而且電極間距可以通過選用不同厚度的 PVC 薄膜來改變；相比實(shí)驗(yàn)室常用的1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電穿孔所需的電壓降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，提高了電穿孔實(shí)驗(yàn)的安全性；相比微型電穿孔儀，細(xì)胞處理量得到較大提高；而且裝置可以通過硅膠軟管與蠕動(dòng)泵或注射器相連，實(shí)現(xiàn)高通量操作，提高了細(xì)胞處理量和實(shí)驗(yàn)效率。

E.coliMG1655 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pUC57 實(shí)驗(yàn)以及PichiapastorisGS115 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pPIC9K 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文提出的高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置可以成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞電穿孔，所需要的電壓比 1 mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，顯著提高了實(shí)驗(yàn)操作的安全性，但電穿孔效率比 1 mm 標(biāo)準(zhǔn)電擊杯低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

電穿孔效率低的原因可能有兩方面：(1)該裝置電穿孔腔橫截面的長(zhǎng)寬比(長(zhǎng)度 2 mm、寬度0.08 mm)較大，導(dǎo)致更多細(xì)胞處于靠近電極的區(qū)域，而該區(qū)域在施加電壓過程中的溫度、pH 變化較大，影響電穿孔效率；(2)針對(duì)該電穿孔裝置所采用的電壓波形、持續(xù)時(shí)間等參數(shù)不夠理想。若想實(shí)現(xiàn)更高的電穿孔效率，則需對(duì) PVC薄膜通道的形狀(影響電穿孔腔橫截面的長(zhǎng)寬比)、細(xì)胞電穿孔施加的電壓波形、大小等實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化。