微小毛霉G-3凝乳酶的酶學特性研究

邵淑娟，曾慶真，朱麗君，楊貞耐

（1.菏澤市行政審批服務局，山東菏澤 274000；2.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000；3.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學，北京 100048）

凝乳酶（Chymosin，EC 3.4.23.4）是重要的工業(yè)用酶之一，在食品、醫(yī)藥等領域應用廣泛。在干酪制作過程中，它主要起著凝固牛乳、改善風味和質構、影響干酪得率等作用[1]。傳統(tǒng)凝乳酶最初來源于未斷奶的小牛皺胃，而隨著世界干酪及干酪素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其供應已不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)所需[2]。因此，研究學者進行大量研究從動植物或微生物中尋找最具發(fā)展?jié)摿Φ哪槊?。其中，微生物具有易培養(yǎng)、生長周期短、受地域氣候時間限制小等特性，用其生產(chǎn)凝乳酶成本低、經(jīng)濟效益高、酶提取方便，因此與動植物相比最具發(fā)展前途[3]。從現(xiàn)有文獻報道可知，目前產(chǎn)生凝乳酶的微生物主要有毛霉、曲霉、根霉及細菌類等[4-5]。其中，由微小毛霉產(chǎn)生的凝乳酶較大部分蛋白分解酶的蛋白分解能力弱，對牛乳凝固作用強，安全無毒，因而成為目前微生物凝乳酶應用最多的菌種之一[6]。

本實驗室前期經(jīng)篩選培育得到一株高產(chǎn)凝乳酶的微小毛霉菌株，菌株編號為G-3。因此，本文在前期對微小毛霉（G-3）凝乳酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化的基礎上對其酶學特性進行詳細研究，為高效率、低成本產(chǎn)生凝乳酶提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

微小毛霉（G-3）由吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心選育與保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.3 g、KH2PO40.05 g、麩皮15 g、去離子水25 mL。

1.1.3 試劑

脫脂乳粉，新西蘭Fonterra公司；乙醇、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS），北京化工廠有限責任公司；金屬鹽類，汕頭市西隴化工有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱，中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；冷凍離心機，美國Thermo Eletron公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；數(shù)顯pH計，德國Sartorious公司。

1.3 方法

1.3.1 微小毛霉凝乳酶酶液的制備

向微小毛霉（G-3）固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100 mL的氯化鈉溶液（4%），攪拌后于恒溫振蕩箱上（30 ℃）以150 r/min的轉速浸提4 h。之后用4層無菌紗布過濾得該凝乳酶的粗酶液。向粗酶液中加入60%的乙醇溶液于4 ℃條件下沉淀4 h后，以10 000 r/min的轉速離心15 min（4 ℃）。將沉淀用pH為5.8的磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L）溶解即得用于以下凝乳活力測定的凝乳酶酶液。

1.3.2 凝乳活力測定

用CaCl2（0.01 mol/L）溶液將脫脂乳粉配制成的脫脂乳液（10%），準確量取35 ℃水浴10 min下的待測酶液0.2 mL及脫脂乳液2 mL，兩者迅速充分混勻后開始計時，至絮狀沉淀出現(xiàn)為終點。凝乳活力計算公式見式（1），相對凝乳活力計算公式見式（2）：

式（1）中：t為凝乳時間，單位為s；n為稀釋倍數(shù)。式（2）中：A為所測凝乳活力，單位為SU/mL；A0為對照凝乳活力，單位為SU/mL。

1.3.3 不同溫度對凝乳酶活力的影響及凝乳酶的熱穩(wěn)定性

將待測酶液分別在20～80 ℃條件下水浴10 min后，根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以最高凝乳活力項為對照記為100%，以研究該凝乳酶的最適凝乳溫度。

將待測酶液分別在35 ℃、45 ℃、55 ℃和60 ℃條件下水浴 15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、240 min、300 min和360 min，迅速降溫并于35 ℃水浴10 min后，根據(jù)1.3.2的方法測定剩余凝乳活力。以最高凝乳活力項為對照記為100%，以研究該凝乳酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4 不同pH對凝乳酶活力的影響及凝乳酶的pH穩(wěn)定性

用0.1 mol/L的NaOH溶液及0.1 mol/L的HCl溶液將待測酶液的pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0后，根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以最高凝乳活力項為對照記為100%，以研究該凝乳酶的最適凝乳pH。

用0.1 mol/L的NaOH溶液及0.1 mol/L的HCl溶液將待測酶液的pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，4 ℃避光放置24 h后，將待測酶液pH調至5.97（原待測酶液pH值），根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以最高凝乳活力項為對照記為100%，以研究該凝乳酶的pH穩(wěn)定性。

1.3.5 不同乳液質量分數(shù)對凝乳酶活力的影響

取待測溶液分別加入到質量分數(shù)為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%和20.0%的脫脂乳液中，根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以最高凝乳活力項為對照記為100%，以研究不同乳液質量分數(shù)對凝乳酶活力的影響。

1.3.6 不同金屬離子種類及濃度對凝乳酶活力的影響

在脫脂乳液中分別加入 NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、FeCl3、ZnCl2、FeCl2、CoCl2、MnSO4、K2SO4、NiSO4、Li2SO4、CuSO4、MgSO4和ZnSO4等金屬鹽類，使其濃度均為5 mmol/L，加入待測酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以未添加任何金屬鹽類的脫脂乳液測得的凝乳活力為對照記為100%，計算其相對凝乳活力。

挑選能顯著促進凝乳酶活力的金屬鹽類，并分別調整濃度為0 mol/L、0.001 mol/L、0.005 mol/L、0.010 mol/L、0.015 mol/L、0.02 mol/L和0.025 mol/L，加入待測酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以未添加任何金屬鹽類的脫脂乳液測得的凝乳活力為對照記為100%，計算其相對凝乳活力。

1.3.7 不同有機溶劑種類及溶度對凝乳酶活力的影響

在脫脂乳液中分別加入不同濃度的乙醇溶液（1%、2%、3%、4%和5%）、β-巰基乙醇溶液（1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L和7 mmol/L）及SDS溶液（1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L和4 mmol/L），加入待測酶液室溫靜置30 min后根據(jù)1.3.2的方法測定凝乳活力。以未添加有機溶劑的脫脂乳液測得的凝乳活力為對照記為100%，計算其相對凝乳活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上所有實驗進行3次生物學重復，實驗數(shù)據(jù)的平均值以及標準差采用Microsoft Excel 2019處理，并通過Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 微小毛霉凝乳酶的最適凝乳溫度及熱穩(wěn)定性分析

溫度主要影響酪蛋白膠束表面電荷而影響凝乳酶的凝乳活力[7]。如圖1所示，在20～65 ℃，隨著溫度升高，膠束表面電荷減少，聚集作用增強，凝乳酶的活力也逐漸增加。當溫度高于65 ℃時，凝乳活力明顯下降，到80 ℃時，相對凝乳活力僅為7.76%。因此，該微小毛霉凝乳酶的最適作用溫度為65℃。

圖1 不同溫度對凝乳酶活力的影響

凝乳酶的熱穩(wěn)定性可決定干酪加工、成熟過程中凝乳酶的殘余量，并可進一步影響干酪成品的風味和質構。從圖2可看出，隨著水浴時間的延長，各溫度下凝乳酶的凝乳活力均呈一定程度的下降趨勢。該酶在35～45 ℃有較高熱穩(wěn)定性，此區(qū)間水浴150 min，相對凝乳活力仍在85%以上。但隨著溫度的升高，凝乳活力明顯降低。當溫度達到55 ℃，水浴150 min后，相對凝乳活力僅為63.46%，溫度達到60 ℃，水浴120 min，凝乳酶蛋白變性完全失活。該凝乳酶在55 ℃后的熱不穩(wěn)定性，在干酪后期制作過程中對凝乳酶的滅活有較大幫助。

圖2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

2.2 微小毛霉凝乳酶的最適pH及pH穩(wěn)定性分析

pH的變化可影響凝乳酶的空間結構及凝乳酶活性中心的解離形式，從而影響酶促反應動力學導致凝乳活力改變[8]。由圖3所示，凝乳酶在pH為5.0時，表現(xiàn)出最強的凝乳活力，隨著凝乳酶所處環(huán)境由弱酸性轉到偏中性時，凝乳活力下降極快。當凝乳酶處于中性條件時，相對凝乳活力僅為對照的20.51%，處于偏堿性條件時，由于凝乳酶的空間結構可能發(fā)生了不可逆轉的變化使得凝乳活力幾乎完全喪失。因此，該凝乳酶的最適凝乳pH為5.0，在此pH條件下，凝乳酶、脫脂乳液的存在狀態(tài)可能最適合彼此相互結合，發(fā)生催化反應，從而使凝乳活力達到最大值。

圖3 不同pH對凝乳酶活力的影響

有研究顯示在偏酸性條件下，酪蛋白的疏水性增強，膠束易解離，從而使酪蛋白聚集產(chǎn)生凝乳[9]。由圖4可看出，凝乳酶在弱酸性（pH=4～6）條件下，凝乳活力較穩(wěn)定，均保持在90%以上，其中在pH為6時酶最穩(wěn)定。pH過大（＞7）會造成凝乳活力較大損失，這可能是因為凝乳酶屬于酸性蛋白酶，在持續(xù)堿性條件下由于活力位點的電荷改變，凝乳酶不能有效與底物結合發(fā)生催化作用。因此可看出，該凝乳酶的耐酸能力比耐堿能力強，這一特性在干酪制作過程中具有一定優(yōu)勢。

圖4 凝乳酶的pH穩(wěn)定性

2.3 微小毛霉凝乳酶的最適底物質量分數(shù)分析

由圖5可知，不同質量分數(shù)的脫脂乳液對凝乳酶的凝乳活力有較大影響。隨著乳液質量分數(shù)的升高，凝乳酶的相對凝乳活力逐漸降低，當乳液質量分數(shù)達到20%時，相對凝乳活力僅為23.6%。當乳液質量分數(shù)為5%時，該酶活力最強。而李玉秋等研究報道，凝乳酶的最適凝乳底物質量分數(shù)為10%，與本研究結果不同，這可能是由于脫脂乳粉及凝乳酶的來源不同導致最適作用底物濃度也有所不同[10]。

圖5 不同乳液質量分數(shù)對凝乳酶活力的影響

2.4 不同種類及濃度的金屬離子對凝乳酶活力的影響

在干酪制造過程中，金屬離子具有防腐作用，并能改善干酪的質構、風味及功能性。因此，選擇合適種類和濃度的金屬離子可使凝乳酶發(fā)揮最佳的凝乳效果[11]。由圖6、7可知，Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+分別對凝乳酶的活力有明顯促進作用，其中以Mn2+、Mg2+、Ca2+的促進作用最顯著。Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+分別對凝乳酶的活力有抑制作用，其中以Co2+、Ni2+的抑制作用最顯著。而Na+、K+、Li+對凝乳酶的活力作用較不明顯。本研究結果與其他研究報道略有差異，如潘道東等研究表明Cu2+和Zn2+對根霉凝乳酶有促進作用[12]，李柳研究發(fā)現(xiàn)Mn2+對甲醇芽孢桿菌凝乳酶有抑制作用[1]，宋曦等研究表明Na+、Li+對地衣芽孢桿菌凝乳酶有抑制作用[8]。金屬離子對凝乳酶活力的影響較為復雜，不同來源的凝乳酶或反應體系濃度不同，都可能導致金屬離子對凝乳酶活力作用產(chǎn)生差異。此外，通過分析比較相同濃度下的MgCl2溶液與MnSO4溶液、KCl溶液與K2SO4溶液對凝乳酶活力作用發(fā)現(xiàn)，SO42-比Cl-更能促進凝乳酶的活力。

圖6 不同種類金屬離子對凝乳酶活力的影響（含Cl-）

圖7 不同種類金屬離子對凝乳酶活力的影響（含SO42-）

為了進一步證明Mn2+、Mg2+、Ca2+對凝乳酶活力的促進作用，考察了不同濃度下的Mn2+、Mg2+、Ca2+對凝乳酶凝乳活力的影響。從圖8可看出，隨著Mn2+、Mg2+濃度的增加，凝乳酶的相對凝乳活力均呈上升趨勢，且當Mn2+、Mg2+濃度達到0.025 mol/L時，相對凝乳活力達到最大值。而隨著Ca2+濃度的增加，凝乳酶的相對凝乳活力呈先上升后下降的趨勢，當Ca2+濃度達到0.02 mol/L時，相對凝乳活力最高。

圖8 不同濃度金屬離子對凝乳酶活力的影響

2.5 有機溶劑對凝乳酶凝乳活力的影響

表1顯示，乙醇對凝乳酶活力有一定的抑制作用，且隨著其濃度的增加，抑制作用隨之增強。當乙醇濃度為5%時，相對凝乳活力僅為對照的69.59%。這可能是由于乙醇的加入降低了脫脂乳液中蛋白質的介電常數(shù)，從而降低了凝乳酶的凝乳活力。由表1可看出，SDS溶液作為一種蛋白變性劑對凝乳酶活力也有抑制作用，且比乙醇的抑制作用更強。當SDS濃度為4 mmol/L時，相對凝乳活力僅為對照的21.46%。表1顯示，β-巰基乙醇對凝乳酶活力有明顯促進作用，但這種促進作用并不隨β-巰基乙醇濃度的變化而變化。β-巰基乙醇中的巰基在凝乳酶中可作為活性催化集團的中心，同時與另一巰基形成二硫鍵，從而穩(wěn)定凝乳酶的結構，促進凝乳酶的活力[13]。

表1 不同種類及濃度的有機溶劑對凝乳酶活力的影響

3 結論

本文主要測定了在不同溫度、pH、乳液濃度、金屬離子、有機溶劑種類及濃度等條件下微小毛霉（G-3）凝乳酶的相對凝乳活力。研究顯示，該凝乳酶的最適凝乳溫度為65℃，在35～45℃有較好熱穩(wěn)定性，此溫度區(qū)間保溫150 min，相對凝乳活力仍在85%以上。酶的最適凝乳pH為5.0，且此酶的耐酸能力比耐堿能力強，pH為6.0時酶最穩(wěn)定。凝乳酶的最適底物質量分數(shù)為5%。Ca2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+可明顯促進凝乳酶活力，其中以Mn2+、Mg2+、Ca2+的促進作用最顯著，Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+對酶活力有抑制作用，其中以Co2+、Ni2+的抑制作用最顯著，而Na+、K+、Li+對凝乳酶的活力幾乎無作用。乙醇、SDS溶液對凝乳酶活力有抑制作用，且均隨著濃度增加，抑制作用隨之增強。而β-巰基乙醇對凝乳酶活力有明顯促進作用。上述研究表明，該凝乳酶可作為傳統(tǒng)凝乳酶的替代酶，根據(jù)該凝乳酶的酶學特性制作干酪具有廣闊的發(fā)展前景。