五味消毒飲標準煎液指紋圖譜的建立

鄭艷萍，張曉琳，彭雲(yún)，趙開軍，貴書琪，4，刁和芳*（.江蘇弘典中藥產(chǎn)業(yè)研究院有限公司 南京市工程技術研究中心，南京 004；.蘇州思源天然產(chǎn)物研發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 56；.南京中山制藥有限公司 江蘇省中藥經(jīng)典名方工程技術研究中心，南京 0046；4.中國藥科大學中藥學院，南京 98）

五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒》，由金銀花、蒲公英、天葵子、野菊花、紫花地丁5 味藥組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，常用于疔毒等癥。現(xiàn)代研究表明，本方主要含有綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷等成分[1-5]，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、增強機體免疫功能等作用[6-7]，臨床上廣泛用于五官科、內科、外科、婦科等火毒濕熱所致的感染性疾患[8-10]。目前，五味消毒飲臨床應用以傳統(tǒng)湯劑為主[11]，然而，其質量一致性易受煎煮方式及原藥材品質的影響。因此，為了確保五味消毒飲后續(xù)研發(fā)的劑型能保持原方的藥效，有必要建立標準煎液的質量控制方法。

中藥復方制劑成分復雜，部分指標性成分檢測并不能充分體現(xiàn)整體質量與藥效。中藥指紋圖譜能全面、系統(tǒng)地反映復方制劑的整體特征，已成為中藥質量控制的有效手段[12-13]。本研究采用HPLC 法建立五味消毒飲標準煎液的指紋圖譜，為五味消毒飲標準煎液的質量評價提供方法及依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；EL104 電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

金銀花Lonicera japonicaThunb.產(chǎn)地來源為山東和河南，野菊花Chrysanthemum indicumL.產(chǎn)地來源為安徽和湖北，蒲公英Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.產(chǎn)地來源為河南、山西、內蒙古，紫花地丁Viola yedoensisMakino 產(chǎn)地來源為河南、山東、陜西，天葵子Semiaquilegia adoxoides（DC.）Makino 產(chǎn)地來源為安徽、湖北、湖南，各10 個批次（均購于安徽匯中州中藥飲片有限公司和安徽金芙蓉中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中山制藥有限公司李輝執(zhí)業(yè)中藥師鑒定）。經(jīng)檢驗，以上藥材水分、灰分、含量、浸出物等均符合2015年版《中國藥典》一部相關規(guī)定。

綠原酸（批號：110753-201716，純度≥99%）和咖啡酸（批號：110885-201703，純度≥99%）（對照品，中國食品藥品檢定研究院），木犀草苷（批號：17030405，純度≥99%）和蒙花苷（批號：15101207，純度≥99%）（對照品，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院）。

甲醇、乙腈（色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司），磷酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷對照品適量，加80%甲醇配制成質量濃度分別為32、19.68、10.7、17.28 μg·mL－1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取金銀花150 g、野菊花60 g、蒲公英60 g、紫花地丁60 g、天葵子60 g，加4.5 L 水，浸泡20 min，加熱至沸，沸騰20 min 后過濾，藥渣加4 L 水，加熱至沸，沸騰20 min 后過濾，合并藥液，減壓濃縮至含生藥1.0 g·mL－1。量取濃縮液1 mL，加入1 mL 水，混勻，用80%甲醇定容至50 mL，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按照表1對應的產(chǎn)地及批號的藥材制備16 批五味消毒飲標準煎液。

表1 16 批五味消毒飲標準煎液藥材樣品產(chǎn)地及批號Tab 1 Origin places and batch numbers of herbs in 16 batches of Wuwei Xiaoduyin standard decoction

2.1.3 單味藥供試液 分別取金銀花150 g，野菊花60 g，蒲公英60 g，紫花地丁60 g，天葵子60 g，按照“2.1.2”項下方法制備，即得各單味藥的供試液。

2.2 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），洗脫梯度（0～20 min，90%～80%B；20～40 min，80%～75%B；40～52 min，75%～70%B；52～52.01 min，70%～90%B；52.01～60 min，90%B）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm；進樣量：20 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密稱取綠原酸對照品10.3 mg 和蒙花苷對照品1.1 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到各對照品儲備液。綠原酸對照品儲備液用甲醇稀釋至264、132、66、33、16.5 μg·mL－1，蒙花苷對照品儲備液用甲醇稀釋至35.2、17.6、8.8、4.4、2.2 μg·mL－1，進樣測定，以對照品溶液的質量濃度（μg·mL－1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程：綠原酸Y＝6.11×104X－2.23×104（r＝0.9999），線性范圍：16.5～264 μg·mL－1；蒙花苷Y＝5.03×104X＋4.25×103（r＝0.9999），線性范圍：2.2～35.2 μg·mL－1。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進樣，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果顯示相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在8 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣5 次，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果顯示相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 參照“2.1.2”項下方法平行制備5 份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果顯示相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收試驗

① 綠原酸加樣回收試驗：按“2.1.2”項下方法制備9份標準煎液濃縮液，每3份一組，取0.25 mL 置25 mL 量瓶中，加入0.25 mL 水，搖勻，分別加入165 μg·mL－1綠原酸對照品溶液10、13、15 mL，加80%的甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果低、中、高回收率均在101.0%～102.8%，RSD均小于1.0%。

② 蒙花苷加樣回收試驗：按“2.1.2”項下方法制備9份標準煎液濃縮液，每3份一組，取0.30 mL 置50 mL 量瓶中，加入0.70 mL 水，搖勻，分別加入44 μg·mL－1蒙花苷對照品溶液4、5、6 mL，加80%的甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，結果低、中、高回收率均在97.0%～99.2%，RSD均小于1.0%。

2.4 五味消毒飲標準煎液含量測定

取“2.1.2”項下供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件檢測，計算綠原酸及蒙花苷含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Sample content determination (n ＝3，mg·g－1)

2.5 五味消毒飲標準煎液指紋圖譜的建立

將16 批供試品溶液按“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄1 h 內的色譜圖。將其導入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”，生成五味消毒飲標準煎液特征指紋圖譜，見圖1，結果確定了13 個共有峰。取混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定，見圖2，通過比對各峰與混合對照品色譜峰保留時間，確認 3、6、9、13號峰分別為綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷。

圖1 16 批五味消毒飲標準煎液HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 16 batches of Wuwei Xiaoduyin standard decoction

圖2 混合對照品HPLC 指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of mixed reference substances

在16 批五味消毒飲標準煎液指紋圖譜中，3號峰（綠原酸）峰面積最大且分離度好，故選用3號峰作為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”，對16 批標準煎液的指紋圖譜進行相似度分析，結果分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.996、0.998，均大于0.99，說明樣品制備方法及所建立的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，能作為五味消毒飲標準煎液質量控制的參考依據(jù)。

2.6 指紋圖譜特征峰的歸屬分析

將單味藥供試液按“2.2”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。通過與標準煎液及其對照指紋圖譜進行比較，確定各特征峰歸屬，結果見圖3。指紋圖譜特征峰主要由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁4 味藥材所貢獻。其中，1 號峰、3號峰、4 號峰、9 號峰、10 號峰、11 號峰、12 號峰主要來源于金銀花，次要來源于野菊花；2 號峰單獨來源于蒲公英；5 號峰和7 號峰單獨來源于紫花地?。? 號峰來源于蒲公英和金銀花；8 號峰來源于紫花地丁和金銀花；13 號峰單獨來源于野菊花。五味消毒飲標準煎液共有峰歸屬見表3。

表3 五味消毒飲標準煎液共有峰歸屬Tab 3 Common peaks attribution in Wuwei Xiaoduyin standard decoction

圖3 單味藥標準煎液HPLC 指紋圖譜及對照指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprint of single medicinal material standard decoction and reference substance

3 討論

在對五味消毒飲標準煎液指紋圖譜特征峰進行歸屬分析時，發(fā)現(xiàn)天葵子沒有對應特征峰，可能是因為天葵子的主要成分為內酯類和氰苷類化合物[14]，其中內酯類化合物微溶于水[5]，按照五味消毒飲經(jīng)典名方的傳統(tǒng)工藝，藥材加水制備標準煎液后，其溶于標準煎液中的含量很低，難以檢測。

為了對五味消毒飲進行質量控制，張宇等[7]采用HPLC 法測定了其口服液中綠原酸和咖啡酸的含量，楊宏靜等[6]利用HPLC 法測定了五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的含量。然而，利用己知的少量活性成分的含量來控制中藥的質量不充分，指紋圖譜能更全面地反映其整體特征[15]。楊曉琴等[11]建立了五味消毒飲口服液的HPLC 指紋圖譜，并對其特征峰進行了對照品歸屬，但并未歸屬到藥材。本研究建立了五味消毒飲標準煎液的HPLC 特征指紋圖譜，對共有峰進行了中藥材歸屬和化學成分指認，較全面地反映了五味消毒飲標準煎液的整體化學特征，該方法穩(wěn)定可靠、重復性好，可為五味消毒飲標準煎液的質量控制提供依據(jù)。

此外，本課題組前期對供試品的制備方法進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)減壓濃縮后，直接用80%甲醇稀釋會產(chǎn)生大量淺棕色大片絮狀沉淀，沉淀會包裹藥液成分，影響測定結果，加水后再稀釋，這種情況得到較大改善。對60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇稀釋溶劑進行比較，發(fā)現(xiàn)80%甲醇為稀釋溶劑時，各成分的峰面積都較高，故選擇濃縮液加水稀釋后用80%甲醇稀釋定容。比較了色譜柱Comasil ODS AR-Ⅱ、Nucleosil C18、YMC-Pack ODS-A 洗脫效果，結果表明，YMCPack ODS-A 對應圖譜的色譜峰分離最佳，峰形最好，因此選用YMC-Pack ODS-A 色譜柱。對流動相甲醇-0.3%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液進行考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.3%磷酸水溶液洗脫時，色譜峰拖尾；以乙腈-0.4%磷酸水溶液洗脫時，色譜峰分離度較差；以乙腈-0.1%磷酸水溶液洗脫時，色譜峰分離度較好，保留時間適中，故流動相確定為乙腈-0.1%磷酸水溶液。對供試液進行全波長掃描，結果在檢測波長為330 nm 時，圖譜信息最為豐富，響應值普遍較高，且分離效果較好，因此選擇330 nm 為檢測波長。