黃水加碳酸鈣粉末培養(yǎng)過(guò)程中理化性質(zhì)和菌群組成的變化規(guī)律

王艷麗，張會(huì)敏，李安軍*，孟雅靜，劉國(guó)英，王錄，丁峰，周慶伍，梁金輝

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820）（2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州 236820）

濃香型白酒的生產(chǎn)是在窖池中進(jìn)行的固態(tài)發(fā)酵，酒醅是濃香型白酒發(fā)酵的主體，發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝形成的水、醇、酸、酯、糖等各種成分互溶形成液態(tài)黃水[1,2]。黃水作為濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中唯一的液態(tài)相，其中充滿了各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其為濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中包括酒醅菌群和黃水菌群之外的窖泥菌群生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。窖泥被公認(rèn)是在濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的厭氧菌群釋放源[3-5]，另一方面，由窖泥菌群產(chǎn)生的代謝物質(zhì)反過(guò)來(lái)又豐富了酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)[4]。實(shí)際上，一些窖泥源的菌屬確實(shí)被發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中遷移到底層酒醅中，也就是黃水所在的位置[4]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，窖泥與黃水共有的菌屬豐度呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)[6]，比如黃水中的Caproiciproducens，Sedimentibacter和古菌被認(rèn)為隨著窖齡增大而增加[1,2,7]；而實(shí)際上，以上3 種菌屬在窖泥中的豐度也隨著窖齡增大而增加[8]?？芍?，黃水菌群與窖泥菌群是相互影響，相互促進(jìn)的。

由窖泥“退化”所引起的釀酒質(zhì)量下降是釀酒界所關(guān)心的問(wèn)題。與正常窖泥相比，“退化”窖泥的pH 值偏低，菌群組成以乳酸桿菌為主[5]，而且經(jīng)常出現(xiàn)白色團(tuán)塊析出[5]，甚至鈣化板結(jié)的現(xiàn)象[9]。王艷麗等[10]也證實(shí)“退化”窖泥中鈣元素含量顯著較高。有研究證實(shí)窖泥的白色團(tuán)塊主要為乳酸鈣[11]。張會(huì)敏等[12]通過(guò)分析分層池底窖泥中的鈣元素證實(shí)窖泥中白色團(tuán)塊析出與窖泥中乳酸與碳酸鈣之間的反應(yīng)有密切關(guān)系。仲幾曉等[13]通過(guò)乳酸強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)乳酸的額外加入導(dǎo)致窖泥中灰白色團(tuán)塊析出，進(jìn)一步證實(shí)其中乳酸與碳酸鈣的反應(yīng)對(duì)窖泥“退化”的影響。濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，乳酸含量高達(dá)60.00～80.00 g/L 的黃水對(duì)窖泥具有重要影響，其影響分別表現(xiàn)在兩者菌群和理化指標(biāo)的相互影響上[14]。因此，有必要深入分析“退化”窖池中，黃水菌群和黃水理化性質(zhì)的變化規(guī)律，為深入分析“退化”窖泥的變化提供理論依據(jù)。

基于此，本研究選擇新、老窖池黃水為研究對(duì)象，分別向其加入適量和過(guò)量碳酸鈣粉末，模擬新老窖池黃水中發(fā)生的碳酸鈣與乳酸之間的反應(yīng)，研究靜置培養(yǎng)過(guò)程中黃水理化性質(zhì)和菌群組成的變化。為分析窖泥“退化”過(guò)程中黃水菌群變化和理化性質(zhì)變化對(duì)窖泥的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水樣本采自安徽知名某濃香型白酒企業(yè)；Omega D5625 土壤DNA 提取試劑盒Omega bio-tek 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890 氣相色譜儀（配CP-WAX 57 CB 色譜柱50 m×0.25 mm×0.2 μm），美國(guó)Agilent 公司；Acquity UPLC 液相色譜（配PDA 二極管陣列檢測(cè)器和 Waters HSS T3 色譜柱100 mm×2.1 mm×1.8 μm），美國(guó) Waters 公司；ICS5000+離子色譜儀（配ICS-5000+-DC 電導(dǎo)檢測(cè)器），ThermoFisher 公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810S），北京普析通用分析儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)賽多利斯公司；PCR 儀，美國(guó)Thermo 公司；MiSeq-PE-250 高通量測(cè)序儀，美國(guó)Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與試驗(yàn)方法

選取連續(xù)正常使用、發(fā)酵工藝相同的新窖池（窖齡6 年）和老窖池（窖齡大于50 年）各3 個(gè)，于發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別抽取新鮮黃水。取新鮮新窖池、老窖池黃水分別加入適量（質(zhì)量體積比，1.50 g/100 mL，即加入的碳酸鈣粉末完全溶于黃水）和過(guò)量（質(zhì)量體積比，3.00 g/100 mL，即加入的碳酸鈣粉末部分溶于黃水，有沉淀）的碳酸鈣粉末，然后進(jìn)行封閉靜置培養(yǎng)，并于培養(yǎng)3 天（3 d）、1 周（1 W）、2 周（2 W）、3 周（3 W）、4 周（4 W）、6 周（6 W）和2 個(gè)月（2 M），檢測(cè)黃水發(fā)酵液理化性質(zhì)，每樣本三個(gè)重復(fù)，共84 個(gè)樣本。于培養(yǎng)1 W～2 M 時(shí)，檢測(cè)黃水發(fā)酵液菌群多樣性，每樣本三個(gè)重復(fù)，共72 個(gè)樣本。

黃水培養(yǎng)過(guò)程中樣本的標(biāo)記以黃水窖齡和碳酸鈣粉末量組合標(biāo)記，其中用YHS 和OHS 分別表示新窖池黃水和老窖池黃水，用_MO 和_EX 分別表示加入適量和過(guò)量碳酸鈣粉末。如需標(biāo)記發(fā)酵時(shí)間，則在黃水發(fā)酵液的編號(hào)后面標(biāo)記具體培養(yǎng)時(shí)間如：_3 d、_1 W或_2 M 等。編號(hào)YHS_MO_1 W 為新窖池黃水加適量碳酸鈣粉末后培養(yǎng)1 周的發(fā)酵液。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

pH 值檢測(cè)使用pH 計(jì)（FE20）直接測(cè)量。銨態(tài)氮檢測(cè)采用紫外分光光度計(jì)法[15]。淀粉和還原糖測(cè)定采用反滴定法[14]。乳酸和Ca2+濃度測(cè)定，將黃水樣本與去離子水按1:9 體積比混勻，過(guò)0.22 μm 濾膜得待測(cè)濾液，然后用液相色譜檢測(cè)乳酸含量[14]，用離子色譜檢測(cè)Ca2+濃度[8]；己酸、丁酸和乙酸測(cè)定，將黃水樣本與15%甲醇溶液按照1:9 體積比混勻，過(guò)0.22 μm濾膜得待測(cè)濾液，然后用氣相色譜檢測(cè)[16]。

1.3.3 DNA 提取與Illumina 高通量測(cè)序使用Omega 土壤DNA 試劑盒（D5625）提取黃水菌群的DNA。由上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq 高通量測(cè)序16S V4 可變區(qū)，擴(kuò)增引物、擴(kuò)增體系與擴(kuò)增程序參考[14]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 熒光定量，構(gòu)建克隆文庫(kù)（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina），經(jīng)Agilent 2100 Bioanlyzer 檢驗(yàn)DNA文庫(kù)合格后，Illumina MiSeq 雙向測(cè)序（MiSeq Reagent Kit V3）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用QIIME（v1.8.0）識(shí)別疑問(wèn)序列。要求序列長(zhǎng)度≥160 bp，且不允許存在模糊堿基N，并剔除：（1）5’端引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1 的序列；（2）含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8 的序列。然后，通過(guò)QIIME 軟件（v1.8.0）調(diào)用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列，利用FLASH（v1.2.7）軟件，對(duì)通過(guò)質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對(duì)連接。調(diào)用UCLUST，對(duì)獲得的優(yōu)質(zhì)序列按97%的序列相似度進(jìn)行OTU 劃分，并選取OTU 中豐度最高的序列作為代表序列。采用Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132）注釋各代表序列，作為代表OTU 的注釋結(jié)果。去除豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的OTU，并根據(jù)OTU 豐度矩陣，使用QIIME（v1.8.0）軟件計(jì)算Shannon、Chao1 等菌群多樣性參數(shù)。差異顯著性分析通過(guò)SPSS（25.0）方差分析（ANOVA）實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)

黃水中本身富含豐富的淀粉、還原糖、銨態(tài)氮、有機(jī)酸及各種離子等。而在加入適量或過(guò)量碳酸鈣粉末后進(jìn)行靜置培養(yǎng)過(guò)程中，伴隨著其中微生物的生長(zhǎng)代謝，理化性質(zhì)也發(fā)生變化。

2.1.1 pH 值

pH 值變化規(guī)律如圖1 所示。pH 值呈現(xiàn)增加（3 d～4 W，4.27～4.58→4.94～5.29）后降低（4 W～2 M，4.94～5.29 →4.01～4.59）趨勢(shì)。培養(yǎng)3 d～3 W，pH 值無(wú)顯著變化（p?0.05）；培養(yǎng)4 W 時(shí)，pH 值呈現(xiàn)最高值（4.94、5.00、5.13 和5.29），推測(cè)可能到第4 W 時(shí)碳酸鈣與乳酸等有機(jī)酸的反應(yīng)達(dá)到最高點(diǎn)，酸性降到最低值；培養(yǎng)6 W～2 M，加入適量碳酸鈣粉末的兩組樣本pH值顯著降低，2 M 時(shí)呈現(xiàn)最低值（4.02、4.03），而加入過(guò)量碳酸鈣粉末兩組樣本的pH 值恢復(fù)至前3 W 水平（4.43、4.59），推測(cè)可能與碳酸鈣粉末反應(yīng)殆盡，黃水菌群代謝生成更多乳酸有關(guān)。加適量與過(guò)量碳酸鈣黃水相比，后者pH 值相對(duì)更高，3 d～4 W 時(shí)（4.27～4.39→4.94～5.00 vs 4.51～4.58→5.12～5.29）無(wú)顯著差異，6 W～2 M（4.16～4.23→4.01～4.03 vs 4.56～4.57→4.43～4.59）呈顯著差異（p<0.05）。此外，新、老窖池黃水相比，pH 值無(wú)顯著差異（p?0.05）。表明加適量或加過(guò)量碳酸鈣對(duì)新老窖池黃水pH 值在短時(shí)間（3 d～4 W）內(nèi)有調(diào)節(jié)作用，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)能力減弱，pH 值仍會(huì)降低，甚至低于培養(yǎng)第3 d 的黃水pH 值（YHS_MO 和OHS_MO）。這與胡曉龍[17]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥相比，退化后窖泥pH 值（6.18 vs 4.57）顯著降低，結(jié)論一致。而且黃水加碳酸鈣經(jīng)過(guò)2 個(gè)月培養(yǎng)其pH 值（4.01～4.59）與已知退化窖泥的pH 值（4.10～5.60）基本一致[18]。

圖1 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中pH 值變化 Fig.1 The pH values change of 4 groups of HS samples during two-month culturing (means ± standard deviation,n=3)

2.1.2 淀粉與還原糖

淀粉（圖2a）與還原糖（圖2b）變化規(guī)律如圖2所示。淀粉（1.23～1.57 g/100 mL→0.64～0.84 g/100 mL）與還原糖（0.38～0.58%→0.16～0.21%）均呈波動(dòng)減少趨勢(shì)。推測(cè)與黃水菌群代謝淀粉和還原糖有關(guān)。已知曲霉屬、毛霉和根霉等絲狀真菌具有分解淀粉生成還原糖的功能[19]，而黃水中富含一定量的曲霉屬[1]。此外黃水中的其他細(xì)菌如Lactobacillus、Clostridium和Acinetobacter等以及真菌如Pichia等[20]，具有把還原糖轉(zhuǎn)化為如乳酸[19]、乙酸和酒精等[21]的功能。加適量與加過(guò)量碳酸鈣黃水相比，淀粉和還原糖在各時(shí)間段的含量基本一致。新、老窖池黃水相比，淀粉與還原糖平均含量均基本相當(dāng)，推測(cè)與培養(yǎng)過(guò)程中新老窖池黃水中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度基本相當(dāng)有關(guān)。而培養(yǎng)第3 d 老窖池黃水中淀粉（1.23～1.25 g/100 mL vs 1.46～1.57 g/100 mL）和還原糖（0.38～0.39% vs 0.53～0.58%）顯著更低（p<0.05）?？赡芘c老窖池黃水中固有好氧細(xì)菌和真菌（霉菌屬和酵母菌屬）相對(duì)豐度更高[1]，且在培養(yǎng)初期，黃水中含一定量的氧，利于好氧細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，因此會(huì)呈現(xiàn)暫時(shí)的淀粉和還原糖消耗更多，含量偏低。張會(huì)敏等[14]直接對(duì)黃水進(jìn)行靜置培養(yǎng)5 個(gè)月后，其中的淀粉（1.6～1.7%→ 0.88～1.02%）和還原糖（0.59～0.60%→0.27～0.34%）降低，與本結(jié)論一致。表明加碳酸鈣對(duì)黃水培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌屬的基本代謝無(wú)明顯影響。且與黃水直接培養(yǎng)相比，黃水加碳酸鈣經(jīng)2 個(gè)月培養(yǎng)淀粉和還原糖消耗更多。說(shuō)明黃水加碳酸鈣培養(yǎng)可能在一定時(shí)間內(nèi)使菌群生長(zhǎng)更旺盛。

圖2 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中淀粉與還原糖含量變化 Fig.2 The starch and reducing sugar change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.3 鈣離子

Ca2+濃度的變化規(guī)律如圖3 所示。新老窖池黃水Ca2+濃度均有增加（4.83～6.32 g/L→5.54～8.89 g/L），推測(cè)與黃水中有機(jī)酸尤其是乳酸與碳酸鈣反應(yīng)生成易溶于水的乳酸鈣，已知乳酸鈣的溶解度超過(guò)20 g/L[22]。但加適量碳酸鈣的兩組黃水中Ca2+濃度呈現(xiàn)增加（3 d～1 W，4.83～5.06 g/L→5.31～5.86 g/L），然后基本穩(wěn)定（2 W～2 M，5.75～5.94 g/L→5.53～5.89 g/L）的趨勢(shì)；而加過(guò)量碳酸鈣的兩組黃水中Ca2+濃度呈穩(wěn)定增加（3 d～2 M，5.20～6.33 g/L→8.73～8.89 g/L）趨勢(shì)。推測(cè)加適量碳酸鈣的黃水在培養(yǎng)3 W時(shí)碳酸鈣可能基本被有機(jī)酸反應(yīng)完全，而加過(guò)量碳酸鈣的黃水中碳酸鈣與乳酸反應(yīng)仍在繼續(xù)進(jìn)行有關(guān)。新老窖池黃水相比，Ca2+濃度基本相當(dāng)。表明碳酸鈣對(duì)新老窖池黃水中Ca2+濃度增加有促進(jìn)作用，且加入的碳酸鈣含量越高，Ca2+濃度增加越顯著。王艷麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥相比，退化窖泥的鈣含量（0.82% vs 1.37%）顯著增加，與本研究結(jié)論一致。間接表明退化窖泥鈣離子增加與黃水和鈣鹽的酸解反應(yīng)有關(guān)。

圖3 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中Ca2+濃度的變化 Fig.3 The Ca2+ change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.4 銨態(tài)氮

銨態(tài)氮變化規(guī)律如圖4 所示。銨態(tài)氮呈波動(dòng)增加趨勢(shì)（1.28～1.69 g/L→1.53～2.18 g/L），其中新老窖池黃水（1.20～1.35 g/L→1.53～1.57 g/L vs 1.61～1.69 g/L→2.13～2.18 g/L）相比，后者銨態(tài)氮含量顯著更高（p<0.05）。推測(cè)與黃水加碳酸鈣培養(yǎng)后pH 值升高至4.02～5.29，更接近產(chǎn)銨態(tài)氮菌屬的最適pH值范圍[23,24]，促進(jìn)了產(chǎn)銨態(tài)氮菌屬的生長(zhǎng)，從而使銨態(tài)氮含量升高。而老窖池黃水菌群組成[2]更豐富，可能更利于銨態(tài)氮的生成。加適量與加過(guò)量碳酸鈣黃水相比，銨態(tài)氮含量無(wú)顯著差異（p?0.05）。胡曉龍[17]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥（269.2 mg/kg）相比，退化后窖泥銨態(tài)氮含量（249.88 mg/kg）顯著降低，與本研究結(jié)論相反?？赡芘c兩者菌群代謝有關(guān)，具體結(jié)合菌群組成進(jìn)一步分析。

圖4 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中銨態(tài)氮含量變化 Fig.4 The ammonium nitrogen change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.5 乳酸、丁酸、己酸和乙酸

乳酸（圖5a）、丁酸（圖5b）、己酸（圖5c）和乙酸（圖5d）變化規(guī)律如圖5 所示。乳酸呈現(xiàn)降低（3 d～1 W，62.21～64.57 g/L→54.67～57.74 g/L），再增加（1 W～2 W，54.67～57.74 g/L→64.78～69.86 g/L），再趨于穩(wěn)定（2 W～6 W，64.78～69.86 g/L→66.71～68.10 g/L），然后再增加的趨勢(shì)（6 W～2 M，66.71～68.10 g/L→67.93～75.30 g/L）。己酸和丁酸均呈現(xiàn)基本穩(wěn)定（3 d～4 W）、再增加（4 W～6 W），然后再降低（6 W～2 M）的變化趨勢(shì)。其中培養(yǎng)2 M 時(shí)，己酸恢復(fù)到第3 d水平，丁酸則更低甚至低于第3 d 水平。乙酸（4.74～5.45 g/L→5.74～9.61 g/L）呈持續(xù)增加趨勢(shì)。而加適量與加過(guò)量碳酸鈣黃水相比，其中乳酸、丁酸、己酸和乙酸差異基本不明顯，但培養(yǎng)6 W 的樣本OHS_Ex 除外。此外，新老窖池黃水相比，乳酸、丁酸和己酸差異基本不顯著，而乙酸在老窖池黃水中顯著更高（p<0.05）。表明加適量和加過(guò)量碳酸鈣對(duì)新老窖池黃水的乳酸、丁酸、己酸和乙酸含量雖有波動(dòng)影響，但最終于培養(yǎng)2 個(gè)月乳酸、乙酸增加，丁酸降低，己酸恢復(fù)至第3 d 水平。推測(cè)與培養(yǎng)前期碳酸鈣與黃水中有機(jī)酸發(fā)生中和反應(yīng)[25]，導(dǎo)致有機(jī)酸減少，而隨培養(yǎng)過(guò)程中黃水菌群代謝的影響，有機(jī)酸出現(xiàn)升降變化[26]。說(shuō)明碳酸鈣不利于新老窖池黃水中己酸和丁酸的生成，反而利于乳酸和乙酸的產(chǎn)生。余有貴等[27]研究發(fā)現(xiàn)退化窖池與常規(guī)窖池所產(chǎn)新酒相比，己酸乙酯和丁酸乙酯極顯著降低，乳酸乙酯和乙酸乙酯極顯著增加，說(shuō)明退化窖池不利于己酸和丁酸積累，而利于乳酸和乙酸積累，與本研究結(jié)論一致。

圖5 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中有機(jī)酸含量變化 Fig.5 The organic acids change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

綜上，黃水加碳酸鈣經(jīng)過(guò)2 個(gè)月培養(yǎng)，最終理化性質(zhì)pH 值、淀粉、還原糖、己酸和丁酸降低，銨態(tài)氮、鈣離子、乳酸和乙酸增加。與已知窖泥退化過(guò)程中理化性質(zhì)變化規(guī)律基本一致，表明窖泥的“退化”與其中鈣鹽和黃水的作用有關(guān)。

2.2 原核微生物菌群的α-多樣性

原核菌群的多樣性變化規(guī)律如表1～表3 所示：四組黃水中原核菌群的OTUs（125～169→83～90）、Chao1（133.08～174.44→88.08～95.52 ）和 Shannon（1.43～2.24→0.57～0.83）變化趨勢(shì)基本一致，整體上呈減少趨勢(shì)。而且無(wú)論是加適量與過(guò)量碳酸鈣黃水相比，還是新老窖池黃水相比，OTUs 和Chao1 指數(shù)均無(wú)顯著差異（p?0.05），而Shannon 指數(shù)呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律差異變化。推測(cè)加入碳酸鈣后，黃水中形成過(guò)高的Ca2+濃度，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)[28]，致使黃水原核菌群多樣性降低。其中，培養(yǎng)4 W 的黃水中OTUs 和Chao1 指數(shù)較前一周略高，可能與第4 W 時(shí)黃水的pH 值（4.94～5.29）出現(xiàn)短暫升高（圖1），對(duì)菌群生長(zhǎng)有暫時(shí)的促進(jìn)作用。表明碳酸鈣的加入對(duì)新老窖池黃水菌群的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響，致使菌群豐富度和多樣性均降低了。這與Hu[5]研究與正常窖泥相比，退化窖泥的OTUs、Chao1 和Shannon 指數(shù)顯著降低，結(jié)論一致。說(shuō)明退化窖泥的菌群多樣性降低與退化過(guò)程中黃水的影響有關(guān)。

表1 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落OTUs Table 1 The prokaryotic community OTUs of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表1 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落OTUs Table 1 The prokaryotic community OTUs of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

注：同行無(wú)連續(xù)肩標(biāo)小寫(xiě)字母表示差異顯著（p<0.05）；同列無(wú)連續(xù)肩標(biāo)大寫(xiě)字母表示差異顯著（p<0.05）。樣本OHS_Ex 在培養(yǎng)1 W 時(shí)只有一組樣本檢測(cè)到原核微生物菌群，無(wú)法與其他三組參數(shù)進(jìn)行顯著性差異分析。表2 和表3 同。

表2 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落Chao1 指數(shù) Table 2 The prokaryotic community Chao1 index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表2 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落Chao1 指數(shù) Table 2 The prokaryotic community Chao1 index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表3 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落Shannon 指數(shù) Table 3 The prokaryotic community Shannon index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表3 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中原核微生物群落Shannon 指數(shù) Table 3 The prokaryotic community Shannon index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

2.3 原核微生物菌群的β-多樣性

對(duì)OTU 注釋，共得到12 個(gè)門，其中11 個(gè)細(xì)菌門，1 個(gè)古菌門。將相對(duì)豐度超過(guò)0.1%的門定義為優(yōu)勢(shì)菌門，共得到10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，如圖6 所示。黃水加碳酸鈣培養(yǎng)過(guò)程中厚壁菌門（Firmicutes）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度占94.77%～100%，甚至3 W～2 M，F(xiàn)irmicutes 為唯一優(yōu)勢(shì)菌門（99.86%～100%）。而且無(wú)論是加適量與加過(guò)量碳酸鈣黃水相比，還是新、老窖池黃水相比，其中優(yōu)勢(shì)菌門組成均一致，以Firmicutes為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中培養(yǎng)1 W 時(shí)的優(yōu)勢(shì)菌門組成除外。推測(cè)與Firmicutes在極端條件下環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)有關(guān)，比如其中的Bacillus、Clostridium和Lactobacillus等[29]，在極端條件下均具有較強(qiáng)耐性。此外，除Firmicutes之外的非優(yōu)勢(shì)菌門以及未知菌/未可培養(yǎng)菌，只有在第1 W 呈現(xiàn)較大優(yōu)勢(shì)，與張會(huì)敏等[14]研究新老窖池黃水經(jīng)過(guò)5 個(gè)月培養(yǎng)，優(yōu)勢(shì)菌門數(shù)目增加，非優(yōu)勢(shì)菌門轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢(shì)菌門，F(xiàn)irmicutes 相對(duì)豐度降低，結(jié)論相反。表明加碳酸鈣不利于黃水中除Firmicutes 之外的其他菌門的生長(zhǎng)。

圖6 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中10 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度 Fig.6 Relative abundance of the 12 dominant phyla in 4 groups of HS samples during two-month culturing

對(duì)OUT 注釋，共得到9 個(gè)屬。將相對(duì)豐度超過(guò)0.1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)菌屬，共得到4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，如圖7 所示。其中Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度占94.48%～99.99%。培養(yǎng)第1 W，樣本YHS_Mo、YHS_Ex 和OHS_Mo 中優(yōu)勢(shì)菌屬除Lactobacillus（99.04%、98.51%和94.48%）外，還有蒼白桿菌屬（Ochrobactrum，0.11%、0.23%和0.24%）、Pelomonas（0.1%、0.14%和0.26%）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，0.14%、0.19%和0.16%）；樣本OHS_Ex 中Lactobacillus（99.73%）為唯一優(yōu)勢(shì)菌屬。培養(yǎng)2 W～2 M，Lactobacillus始終為唯一優(yōu)勢(shì)菌屬（99.65%～99.99%）。而且無(wú)論是加適量與過(guò)量碳酸鈣黃水相比，還是新、老窖池黃水相比，其中優(yōu)勢(shì)菌屬組成均一致，以Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。這與張會(huì)敏等[14]直接對(duì)新老窖池黃水進(jìn)行靜置培養(yǎng)5 個(gè)月，Lactobacillus相對(duì)豐度降低，而菌屬Acinetobacter、Thermoflavimicrobium、Bacillus、Ochrobactrum、Stenotrophomonas、Caproiciproducens、Aminobacterium、Methanoculleus、Syntrophomonas和Ruminiclostridium等相對(duì)豐度增加，結(jié)論相反。進(jìn)一步表明黃水加碳酸鈣培養(yǎng)，不利于其中包括未知菌屬在內(nèi)的菌屬的生長(zhǎng)繁殖。

圖7 4 組黃水樣本在2 個(gè)月培養(yǎng)過(guò)程中4 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度 Fig.7 Relative abundance of the 4 genera in 4 groups of HS during two-month culturing

黃水在培養(yǎng)過(guò)程中，菌群組成與理化性質(zhì)相互適應(yīng)，相互影響。推測(cè)黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)菌群組成變化可能與理化性質(zhì)變化有關(guān)。（1）pH 值升高至4.02～5.29（圖1），與已知Lactobacillus的最適pH 值范圍4.0～5.3[30,31]基本一致。（2）乳酸減少（圖5a），降低了對(duì)Lactobacillus的反饋抑制作用[32]。（3）Ca2+濃度增加（圖3），袁亮[28]研究證實(shí)Ca2+濃度超過(guò)150 mmol/L（即6 g/L）時(shí)，細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)；但閆穎娟等[33]證實(shí)在培養(yǎng)基中添加適量碳酸鈣可以促進(jìn)Lactobacillus的生長(zhǎng)；甚至黃翔等[34]發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳酸菌利用以碳酸鈣為主要原料的蛋殼制備乳酸鈣，產(chǎn)量高達(dá)40 g/L 以上，說(shuō)明該條件下Ca2+濃度（約7.34 g/L）不影響Lactobacillus的生長(zhǎng)。此外，Lactobacillus本身在黃水中的相對(duì)豐度較大（?95%）[14]，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而且Lactobacillus生長(zhǎng)代謝可產(chǎn)生抑菌素能抑制Clostridium、Bacillus等多種菌屬的生長(zhǎng)繁殖[35]。因此，黃水中添加碳酸鈣培養(yǎng)，不利于除Lactobacillus外其他菌屬的生長(zhǎng)。這與胡曉龍等[5,17]研究發(fā)現(xiàn)“退化”窖泥相比正常窖泥，菌群組成相對(duì)更單一，Lactobacillus相對(duì)豐度顯著增加，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬（91.46%），結(jié)論基本一致。進(jìn)一步說(shuō)明退化窖泥菌群組成的變化與退化過(guò)程中黃水影響有關(guān)。

值得討論的一點(diǎn)是，新老窖池黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)銨態(tài)氮含量增加（圖2），結(jié)合圖7 分析可知，代謝產(chǎn)銨態(tài)氮的相關(guān)菌屬不僅沒(méi)有增加，反而未被檢出，而且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Lactobacillus很快成為唯一優(yōu)勢(shì)菌屬，說(shuō)明本研究黃水中銨態(tài)氮含量增加與Lactobacillus的生長(zhǎng)代謝有關(guān)，有研究證實(shí)[36]銨態(tài)氮生成的主要途徑是氨基酸代謝，而Lactobacillus可以合成氨基酸代謝的關(guān)鍵酶-谷氨酰胺合成酶（GS），因此黃水加碳酸鈣培養(yǎng)后，隨Lactobacillus的生長(zhǎng)代謝，銨態(tài)氮含量增加，并且乙酸含量增加（圖5），對(duì)Lactobacillus胞內(nèi)銨濃度有促進(jìn)作用。同時(shí)Lactobacillus通過(guò)氨基酸代謝實(shí)現(xiàn)銨離子和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，增強(qiáng)Lactobacillus耐酸性[37]，說(shuō)明銨態(tài)氮增加反過(guò)來(lái)也助于Lactobacillus生長(zhǎng)。而退化窖泥中銨態(tài)氮含量則是降低的，推測(cè)與窖泥退化后出現(xiàn)板結(jié)，阻礙了窖泥營(yíng)養(yǎng)源-黃水無(wú)法滲入，導(dǎo)致其中氮源供應(yīng)減少，而銨作為微生物利用氮源的關(guān)鍵中間體，轉(zhuǎn)化減弱。因此，黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)銨態(tài)氮含量增加，而窖泥退化后銨態(tài)氮含量降低。

3 結(jié)論

以新老窖池黃水為研究對(duì)象，分析了其在分別加入適量和過(guò)量碳酸鈣粉末培養(yǎng)過(guò)程中理化性質(zhì)與菌群組成的變化規(guī)律，結(jié)果表明：

（1）黃水加碳酸鈣經(jīng)過(guò)2 個(gè)月培養(yǎng)，pH 值（4.20～4.60→5.00～5.30→4.00～4.50）、丁酸和己酸先增后降，淀粉和還原糖持續(xù)降低，Ca2+濃度（4.82～6.32 g/L→5.53～8.89 g/L）、銨態(tài)氮（1.28～1.69 g/L→1.53～ 2.18 g/L）和乙酸（4.74～5.44 g/L→5.74～9.61 g/L）呈增加趨勢(shì)，乳酸先降后增（62.21～64.57 g/L→54.67～ 57.74 g/L→67.89～75.30 g/L）。且加適量與加過(guò)量碳酸鈣黃水相比，后者pH 值和Ca2+濃度相對(duì)更高。而新、老窖池黃水相比，銨態(tài)氮和乙酸在老窖池黃水中顯著更高。

（2）黃水加碳酸鈣培養(yǎng)使菌群組成趨于單一。其中菌群多樣性參數(shù)OTUs、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)顯著降低。并于培養(yǎng)3 W 時(shí)Firmicutes（94.77%→ 100.00%）成為唯一優(yōu)勢(shì)菌門，于培養(yǎng)2 W 時(shí)Lactobacillus（94.48%→99.99%）成為唯一優(yōu)勢(shì)菌屬，而其它優(yōu)勢(shì)菌屬及未知菌屬趨于消亡（5.52%降至接近于0）。而且不管是加適量或加過(guò)量碳酸鈣黃水，還是新老黃水，黃水菌群的多樣性參數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌門及優(yōu)勢(shì)菌屬均無(wú)顯著差異。

綜上，黃水加入碳酸鈣培養(yǎng)其理化性質(zhì)更加有利于Lactobacillus占優(yōu)勢(shì)，而抑制了其它菌屬的生長(zhǎng)。與已知退化窖泥的理化性質(zhì)和菌群組成變化一致，表明退化窖泥的理化性質(zhì)和菌群組成與退化過(guò)程中黃水的影響有關(guān)。本研究為窖泥退化過(guò)程中Lactobacillus占優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象提供了部分理論依據(jù)。