QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜法測定果蔬中乙烯菌核利及其代謝物的殘留量

謝建軍，侯穎燁，曾廣豐，王璐，李菊

（廣州海關技術中心，廣東廣州 510623）

乙烯菌核利（vinclozolin）是一種廣譜、保護性和觸殺型殺菌劑，廣泛應用于防治水果、蔬菜上的真菌病害。但是，動物毒理實驗表明乙烯菌核利是一種環(huán)境抗雄激素，能夠導致雄性生殖器官異常或雄性雌性化，其中存在威脅人體健康主要是其代謝物3,5-二氯苯胺（3,5-dichloroaniline）[1-5]。

GB 2763《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中對乙烯菌核利的最大殘留限量（MRL）有明確規(guī)定，且均是以乙烯菌核利和其代謝物3,5-二氯苯胺的總和計算[6]。目前，蔬菜和水果可參照NY/T 761《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》方法測定，谷糧參照GB 23200.9《食品安全國家標準糧谷中475種農藥及相關化學品殘留量測定氣相色譜-質譜法》方法測定[7,8]。這兩個標準都是多農殘檢測方法，有機溶劑用量多，前處理復雜，耗時長；且標準中沒有建立3,5-二氯苯胺的檢測方法。國內外也有部分文獻報道使用氣相色譜儀[9-11]、氣相色譜-質譜聯用儀[12,13]、液相色譜儀[14-17]測定植物源性食品中乙烯菌核利殘留量；但這些文獻報道中均未對乙烯菌核利的代謝物3,5-二氯苯胺殘留量檢測進行研究[9-14]。

因此，本文在QuEChERS 方法的基礎上[18,19]，通過對2 種提取溶劑和5 種凈化吸附劑篩選，確定了乙酸乙酯提取，PSA 粉80 mg、GCB 粉50 mg 組合吸附劑凈化，建立了同時檢測水果蔬菜中乙烯菌核利及其代謝物 3,5-二氯苯胺殘留的氣相色譜/質譜（GC/MS）檢測方法。該方法的前處理簡便、快速、便捷，可滿足果蔬中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺的定性和定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A 氣相色譜儀、5973C 質譜儀，美國Agilent 公司；IKA MS 3 basic 渦旋振蕩器，德國IKA 公司；Turbovap LV 氮氣吹干濃縮儀，美國Zymark 公司；Heidolph promax 2020 水平振蕩儀，德國Heidolph 公司；臺式離心機，德國Sigma 公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore 公司。

乙腈和乙酸乙酯為色譜純，無水硫酸鎂、氯化鈉均為分析純。PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，粒度40～63 μm）粉購于CNW Technologies 公司；C18（40～60 目）、石墨化碳黑（GCB，120～400 目）、中性氧化鋁粉（Al2O3，100～200 目）、碳納米凈化粉（NANO，納米級）均購于北京振翔工貿有限公司；乙烯菌核利標準品有效成分含量大于99.5%，3,5-二氯苯胺標準品有效成分含量大于99.9%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

番茄、黃瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄樣品購自當地超市。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量乙烯菌核利及其代謝物3,5-二氯苯胺標準品，分別置于25 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，分別配制成1.0 g/L 的標準儲備液，-18℃冰箱中保存。使用前根據需要將標準儲備液稀釋成適當濃度的標準工作液，現配現用。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

稱取水果蔬菜類試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋1 min后，加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉，迅速搖勻混合，置于水平振蕩器中振蕩15 min，以10000 r/min離心5 min，待凈化。

1.3.2 凈化

取上述1 mL上清液，將上清液置于1.5 mL高速離心管中，加入80 mg PSA和50 mg GCB粉，渦旋1 min，以12000 r/min離心5 min后，過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，注入氣相色譜-質譜聯用儀分析。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 氣相色譜（GC）條件

色譜柱：Agilent DB-5ms毛細管柱，30 m×0.25 mm（i.d.），0.25 μm；升溫程序：初始溫度70℃保持1.5 min，以10℃/min 速率升至160℃，再以20℃/min 升至280℃，保持5.0 min，總運行時間21.5 min；進樣口溫度：270℃；載氣：氦氣（99.999%以上），流速1.2 mL/min；進樣量：1.0 μL；進樣模式：脈沖無分流進樣；溶劑延遲時間：5 min。

1.4.2 質譜（MS）條件

離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃，掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM），選擇離子（*為定量離子，若有干擾，不同樣品的定量離子可以從其他定性離子中選擇）：212*/198/285（乙烯菌核利），161*/163/134（3,5-二氯苯胺）。

2 結果與討論

2.1 吸附劑的選擇優(yōu)化

2.1.1 吸附劑的種類選擇

QuEChERS 文獻報道方法使用的吸附劑種類主要有PSA、C18 和GCB，為了考察吸附劑對乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺吸附情況，本實驗采用回收試驗法篩選吸附劑的種類和用量。分別稱取PSA、C18、GCB、Al2O3、NANO 粉于1.5 mL 高速離心管中，其中PSA、C18、GCB 吸附劑稱取50 mg、80 mg、100 mg 三個水平，Al2O3、NANO 粉吸附劑稱取20 mg、50 mg、100 mg 三個水平，每支離心管中分別加入0.1 mg/L 的乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺混合標準溶液1.0 mL，渦旋1 min，靜置10 min 后，以12000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜于進樣瓶中，GC/MS 上機分析。試驗結果表明，納米型吸附凈化劑NANO 對3,5-二氯苯胺的吸附性較強，回收率損失較大，最高只有45.80%；中性氧化鋁粉（Al2O3）對乙烯菌核利的回收率稍偏高，最高達135.31%，GCB 用量為80 mg 和100 mg 時對3,5-二氯苯胺的影響較大回收率只有46.23%和37.27%。PSA、C18 和50 mg 的GCB 對3,5-二氯苯胺和乙烯菌核利的吸附回收率都在85.45～122.28%之間，結果見圖1。綜合考慮GCB 對樣品中極性和非極性的干擾物有極高的吸附能力，對去除植物中色素有十分顯著的效果；PSA 對植物源樣品基質中的有機酸、色素、糖類等都有較好的凈化作用。因此，選擇PSA、C18、GCB作為吸附凈化劑進行吸附劑用量的方法研究。

圖1 不同重量5 種吸附凈化劑的回收率 Fig.1 Recoveries (%) of vinclozolin and its metabolite treated with five different sorbents at a series of weights

2.1.2 吸附劑的用量確定

蔬菜水果種類多，有的品種顏色較深，有的有揮發(fā)性成分，所以使用QuEChERS法進行提取和凈化時還是要考慮兩種或多種吸附凈化劑組合使用，才可以較好的除去樣品中的色素、脂肪酸等干擾儀器分析的物質。在2.1.1的試驗結果基礎上確定了80 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18的吸附劑種類并對這幾種吸附劑進行組合Ⅰ（PSA 80 mg、GCB 50 mg），Ⅱ（PSA 80 mg、C18 50 mg），Ⅲ（GCB 50 mg、C18 50 mg），Ⅳ（PSA 80 mg、GCB 50 mg、C18 50 mg），進行加標回收實驗。實驗結果表明復配組合Ⅰ-Ⅳ都可以滿足實驗回收率的要求，四種復配凈化劑的回收率都在94.57%～112.57%之間，結果見圖2。并通過使用菜心提取液進行實際樣品的凈化，發(fā)現Ⅰ和Ⅳ吸附劑凈化效果良好，凈化后的提取液幾乎無顏色。綜合考慮凈化效果、成本、便捷性，選擇Ⅰ號80 mg PSA和50 mg GCB確定為最終實驗的復配吸附凈化劑的種類和用量。

圖2 復配吸附凈化劑的標準添加回收率 Fig.2 Average recoveries (%) of vinclozolin and its metabolite treated with four different sorbents

2.2 提取溶劑的篩選

原QuEChERS法使用的提取溶劑為乙腈，相對于多農殘檢測，乙腈是萃取范圍較寬的溶劑。通過比較乙腈和乙酸乙酯的提取效果，結果表明乙酸乙酯和乙腈的提取效果都很好，乙烯菌核利的回收率分別為98.30%和94.07%，3,5-二氯苯胺的回收率分別為82.79%和94.07%。綜合考慮，使用乙酸乙酯作為提取溶劑，簡化了試驗操作；如果用乙腈提取，上GC/MS儀器分析前還需用氮吹將轉換溶劑，增加了實驗步驟。因此，本方法使用乙酸乙酯作為水果蔬菜中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺殘留的提取溶劑。

2.3 基質效應的消除

由于蔬菜、水果在前處理中會帶入一些物質干擾儀器的分析，導致出現基質效應。用純乙酸乙酯配制標準工作曲線進行添加回收實驗進行定量時，發(fā)現乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺殘留測定值明顯偏高，出現正的基質效應，用空白樣品凈化后基質配制標準工作曲線進行定量，回收率在正常范圍之內。因此，為了消除基質效應的干擾，本方法使用樣品空白凈化后基體配制標準工作曲線進行定量。

2.4 優(yōu)化后的QuEChERS 法確定

通過上述實驗確定了QuEChERS方法中的提取溶劑，吸附凈化劑的種類和用量，本部分通過實際空白樣品的添加回收實驗再次確定了優(yōu)化后QuEChERS方法。優(yōu)化后的QuEChERS法確定為：以乙酸乙酯做為提取溶劑，以80 mg PSA和50 mg GCB為吸附劑做混合型分散固相萃取。為了進一步驗證前處理方法，稱取了10.0 g的菜心樣品，準確加入提取溶劑乙酸乙酯10 mL，加入萃取鹽包（4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉）；手動搖勻防止結塊，水平振蕩10～15 min，10000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL于裝有Ⅰ凈化劑的1.5 mL離心管中，渦旋2～5 min，12000 r/min高速離心，然后用0.22 μm有機濾膜過濾后裝于1.5 mL進樣瓶，上GC/MS分析。采用上述優(yōu)化后的QuEChERS方法對菜心基質做提取凈化的回收率實驗，3,5-二氯苯胺的平均加標回收率為98.77%，乙烯菌核利平均加標回收率為106.26%。實驗結果表明優(yōu)化后的QuEChERS方法提取、凈化效果優(yōu)良，完全可以滿足乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺殘留檢測；GC/MS色譜圖也表明該種前處理方法譜圖雜峰少，基線噪聲低，峰型好。

2.5 標準曲線及檢出限

采用空白基質溶液配制乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺殺菌劑混合標準工作液，配制成濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.25 mg/L 的標準工作溶液，按1.4 中GC/MS 條件進樣測定。以峰面積Y 為縱坐標，質量濃度X（mg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，得到其相關線性方程。結果表明，乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺在0.02～0.25 mg/L 范圍內線性關系良好，相關系數r2分別為0.997 和0.998，方法的檢出限（LOD，S/N=3）乙烯菌核利在4.2～15.5 μg/kg 之間，3,5-二氯苯胺在6.3～17.6 μg/kg 之間?，F以生菜空白基質配制的標準曲線線性方程和相關系數見表1，乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺標準的總離子流圖見圖3a。

表1 乙烯菌核利及其代謝物的保留時間、質譜參數、線性方程和相關系數 Table 1 Retention times,GC/MS parameters,linear equations and r2 of vinclozolin and its metabolite

圖3 乙烯菌核利及其代謝物標準（a，0.1 mg/kg）、番茄空白樣品(b)和添加0.1 mg/kg 標準的番茄樣品（c）總離子流圖 Fig.3 Total ion chromatograms of vinclozolin and its metabolite standards (a,0.1 mg/kg),tomato blank (b) and tomato spiked with standards (c,0.1 mg/kg)

2.6 方法的回收率及精密度

按照1.3 提取和凈化步驟，測定方法的回收率和精密度。選取黃瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄空白樣品中分別添加0.05、0.5、1.0 mg/kg（上機時根據線性方程范圍進行適當的稀釋）三個水平的標準，番茄添加水平為0.05、1.5、3.0 mg/kg，每個添加水平平行實驗6 次，計算其平均回收率和相對標準偏差，結果見表2。結果表明，乙烯菌核利及其代謝物的平均回收率均處于81.67%～113.33%之間，相對標準偏差均小于9.47%。選取番茄空白樣品和添加0.10 mg/kg 乙烯菌核利及其代謝物標準的番茄加標樣品總離子流圖見圖3b，3c。

表2 幾種蔬菜和水果中乙烯菌核利及其代謝物不同添加水平的實測值、回收率、相對標準偏差、最低檢出限（n=6）Table 2 Measured values,average recoveries,RSDs and LOD of vinclozolin and 3,5-dichloroaniline standards spiked in different vegetables and fruits (n=6)

2.7 實際樣品的測定

用改良后的QuEChERS 法檢測了在廣州市農貿市場上隨機購買的菠菜、芥藍、草莓等15 種蔬菜和水果樣品，檢測結果顯示這15 種蔬菜和水果中乙烯菌核利和3,5-二氯苯胺均未檢出。

3 結論

本文用改進的QuEChERS 方法結合GC/MS 法建立了果蔬中乙烯菌核利及其代謝物3,5-二氯苯胺殘留量的測定方法。樣品經乙酸乙酯提取，80 mg PSA 粉和50 mg GCB 粉吸附雜質凈化后，用GC/MS 外標法定量。結果表明乙烯菌核利及其代謝物3,5-二氯苯胺在番茄、黃瓜、生菜、芹菜、柑橘和葡萄中添加水平為0.050～3.00 mg/kg 時，平均回收率范圍均處于81.67%～113.33%之間，相對標準偏差（RSD）小于9.47%，檢出限（LOD，生菜）分別為4.2 和6.3 μg/kg。本方法具有靈敏、快速、簡便等特點，能滿足新鮮蔬菜和水果中乙烯菌核利及其代謝物3,5-二氯苯胺的殘留檢測要求。