食品中沙門氏菌恒溫隔絕式PCR檢測(cè)方法的建立

楊若璇，佟堯，趙燕英，湯承，劉驥，朱成林，曾英杰，于基成，唐俊妮*

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）（2.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）（3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）（4.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)大連 116600）

沙門氏菌（Salmonella）是一種革蘭氏陰性的桿狀細(xì)菌，屬腸桿菌科，是常見的食源性病原菌。自1885年首次被分離出來(lái)，沙門氏菌血清型已發(fā)展到2637種。沙門氏菌是一種嚴(yán)重危害動(dòng)物和人類健康的病原菌，在人類及畜禽中均曾有過沙門氏菌病爆發(fā)的記錄[1]。由沙門氏菌感染而引發(fā)的病癥有敗血癥、傷寒及腸胃炎等，嬰兒、老年人及免疫力低下者還可能出現(xiàn)菌血癥，少數(shù)還會(huì)伴隨腦膜炎或骨髓炎。全球每年有1600萬(wàn)沙門氏菌感染病例，其中約60萬(wàn)死亡，據(jù)相關(guān)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外沙門氏菌污染引起食物中毒的人數(shù)頻占首位[2]。近年來(lái)，許多分離菌株出現(xiàn)了抗生素高度耐藥，給公眾健康帶來(lái)了巨大健康威脅[3]。因此，對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)非常重要。

對(duì)食品中沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)是預(yù)防沙門氏菌感染的有效手段。目前，沙門氏菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)檢測(cè)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法以及生物傳感器檢測(cè)的方法等。傳統(tǒng)檢測(cè)方法依據(jù)GB 4789.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[4]的標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測(cè)步驟為預(yù)增菌、增菌、分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)以及血清學(xué)鑒定分型等，存在耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣等缺點(diǎn)[5]。近年來(lái)，學(xué)者們一直在尋找更快速的檢測(cè)方法，如李倩影等[6]利用pH響應(yīng)比色酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)牛奶中豬霍亂沙門氏菌，所構(gòu)建的比色ELISA方法適用于牛奶中不同濃度的豬霍亂沙門氏菌快速定量檢測(cè)。Li等[7]用熒光DNAzyme和通用封堵連接劑、超聚合酶鏈反應(yīng)形成視覺生物傳感器，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大來(lái)檢測(cè)沙門氏菌等。雖然這些方法快速，但也存在一定缺陷，如免疫學(xué)方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性，生物傳感器在穩(wěn)定性和精確度上還有待改善，并且對(duì)設(shè)備的要求非常高[8,9]。樂振竅等[10]用等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification，IMSA），建立了檢測(cè)沙門氏菌的IMSA法，適合用于食品中沙門氏菌快速檢測(cè)。相比較而言，分子生物學(xué)具有特異性好、靈敏度高、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)中[11,12]。但是目前存在最大問題是適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法還比較匱乏。因此，針對(duì)沙門氏菌探索適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法非常有必要。

恒溫隔絕式PCR技術(shù)（Insulated isothermal PCR，iiPCR）是一種新型的分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)，基于Rayleigh-Benard的對(duì)流原理，通過反應(yīng)管底部液體持續(xù)加熱產(chǎn)生上部液體與下部液體的溫度差，控制散熱的速率與對(duì)流的時(shí)間，在反應(yīng)管內(nèi)部形成穩(wěn)定溫度梯度，從而提供PCR擴(kuò)增所需的反應(yīng)條件[13]。該技術(shù)最早在2002年，由Krishnan[14]首次報(bào)道，結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測(cè)儀，體積小、自帶電源，加樣后一鍵操作，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，方便快捷，可達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的目的。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外報(bào)道iiPCR技術(shù)的文獻(xiàn)主要應(yīng)用于蝦白斑病病毒[15]、尖孢鐮刀菌[16]、滑膜支原體[17]、無(wú)乳鏈球菌[18]、豬流行性腹瀉病毒[19]、牛冠狀病毒[20]等。利用該技術(shù)對(duì)食源性病原菌的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)的目的是基于恒溫隔絕式PCR技術(shù)建立一種快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，并應(yīng)用于實(shí)際食品樣品檢測(cè)，為沙門氏菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)平臺(tái)建設(shè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究所用到的沙門氏菌H9812、單增李斯特菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌ATCC25922、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778 均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、緩沖蛋白胨水（BPW）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、1%亞碲酸鉀卵黃增菌液，青島海博生物技術(shù)有限公司；Premix Ex Taq（Probe qPCR）、TB Green Premix Ex TaqⅡ、核酸染料，GELVIEW 寶生物工程（大連）有限公司；50 bp DNA Ladder、Taq PCR Master Mix (2x，blue dye)，北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；G-10 電泳瓊脂糖凝膠，Biowest 公司；Tris-HCl、EDTA，北京博奧拓科技有限責(zé)任公司。

POCKITTM小型智能型核酸分析儀、R-tube（48），廈門金瑞鴻捷生物科技有限公司；CFX96 熒光定量PCR 儀、VerSaDoc2000 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad有限公司；PCR 儀，TSNENEN031445 基因（美國(guó)）有限公司；Galanz WD800B 型微波爐，順德市格蘭仕微波爐電器有限責(zé)任公司；SC-15 數(shù)控超級(jí)恒溫槽，寧波新芝生物科技股份有限公司；Eppendorf 5804R 型冷凍離心機(jī)，Eppendorf 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

選取沙門氏菌的invA基因作為目標(biāo)基因，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物及探針，并對(duì)引物與探針進(jìn)行BLAST 比對(duì)。另一對(duì)常規(guī)PCR 引物參考Chen 等[21]，詳細(xì)引物信息見表1。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 invA 特異性引物和探針基本信息 Table 1 invA specific primers and probes

1.4 模板DNA 的提取

本實(shí)驗(yàn)參考陳光麗等[22]水浴提取法提取細(xì)菌DNA。

1.5 引物及探針的驗(yàn)證

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX96）對(duì)沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌及陰性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，以驗(yàn)證引物和探針的可行性。反應(yīng)體系及條件：總反應(yīng)體積為20 μL：10 μL Premix Ex Taq，1.2 μL 探針(10 μmol/L)，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，1.0 μL DNA 模板，其余用無(wú)菌水補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：95℃變性1 min 30 s，以95℃ 5 s，55 30℃ s ，72 30℃ s 擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，在55℃結(jié)束開始收集熒光信號(hào)。

1.6 iiPCR 反應(yīng)體系的摸索

以李凡等[20]建立的牛冠狀病毒iiPCR 方法進(jìn)行參考，采25 μL 體系分別對(duì)已知濃度的Taq 酶（預(yù)混酶）5 U/μL（11～13.5 μL）上下游引物10 μmol/μL（0.5～2 μL）、探針10 μmol/μL（0.25～1 μL）、模板DNA（1～4 μL）、無(wú)菌水的用量進(jìn)行條件探索，確定各自用量的最佳值。

1.7 特異性試驗(yàn)

采用上述擴(kuò)增體系，結(jié)合POCKITTM手持式核酸分析儀對(duì)上述提取的沙門氏菌和其他細(xì)菌的DNA 作為模板進(jìn)行檢測(cè)，判定方法的特異性。

1.8 靈敏性試驗(yàn)

將純培養(yǎng)的沙門氏菌菌液，通過十倍梯度稀釋，稀釋成不同的濃度梯度（100～10-9），并同時(shí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。采用POCKITTM手持式核酸分析儀進(jìn)行樣品的檢測(cè)，確定最低檢出限。

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

參考劉健新等[23]熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，分別對(duì)過夜培養(yǎng)液的3 個(gè)稀釋度（10-6、10-7、10-8）提取的模板DNA 采用POCKITTM手持式核酸分析儀進(jìn)行三次重復(fù)性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

1.10 實(shí)際食物樣品的采集

市場(chǎng)上采集14份食品樣品，樣品采集信息見表2。

表2 樣品采集信息 Table 2 The sample collection information

1.11 食物樣品前增菌培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)探索

將食物樣品按照每份10 g直接分裝至緩沖蛋白胨水中富集培養(yǎng)，于培養(yǎng)第2 h 開始，平均每隔1 h 采集一次培養(yǎng)液，直至第8 h，采集前需靜置5 min，利用iiPCR 和傳統(tǒng)PCR 對(duì)上述采集點(diǎn)的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，探索實(shí)際樣品最小培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。

傳統(tǒng)PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、模板DNA1 μL、無(wú)菌超純水補(bǔ)足至20 μL體系；反應(yīng)擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物于4℃保存或進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。

產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測(cè)：配置的瓊脂糖凝膠的濃度為3%，取4.5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，90 V、72 A條件下電泳40 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.12 實(shí)際采集食物樣品檢測(cè)

針對(duì)市場(chǎng)上采集的14 份食品樣品，采用傳統(tǒng)PCR方法、iiPCR 方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較其檢出率，同時(shí)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。并將建立的iiPCR 方法，與國(guó)標(biāo)法、傳統(tǒng)PCR 方法和熒光定量PCR從樣品采集到結(jié)果檢出整個(gè)流程制作流程對(duì)比圖。

1.13 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel、SPSS 25 軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及探針驗(yàn)證結(jié)果

成功建立iiPCR 檢測(cè)方法的前提是選擇合適的靶基因和探針設(shè)計(jì)[24]，因此，本實(shí)驗(yàn)的引物和探針設(shè)計(jì)至關(guān)重要。腸侵襲蛋白與沙門氏菌的侵襲能力緊密相關(guān)[25]，其中invA是主要的毒力因子，可以作為沙門菌屬的特異性基因[26]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇invA基因作為研究的靶基因。通過本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)引物和探針，采用傳統(tǒng)PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分別對(duì)沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1，從圖中可以看出只有沙門氏菌能夠出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他4 株菌未見任何擴(kuò)增，證明設(shè)計(jì)的沙門氏菌引物與探針具有良好的特異性。

圖1 沙門氏菌的引物、探針驗(yàn)證結(jié)果 Fig.1 The primer and probe verification for Salmonella

2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化探索結(jié)果

通過對(duì)上、下游引物區(qū)間范圍用量、探針區(qū)間范圍用量、模板區(qū)間范圍用量進(jìn)行優(yōu)化篩選，摸索出沙門氏菌iiPCR 最終反應(yīng)體系為：5 U/μL Taq 酶（預(yù)混酶）12.5 μL，10 μmol/μL 上、下游引物各1 μL，10 μmol/μL 探針0.5 μL，模板2 μL，補(bǔ)足無(wú)菌水至25 μL。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步將沙門氏菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌的DNA 按上述程序進(jìn)行iiPCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，圖中POCKITTM手持式核酸分析儀界面上顯示只有沙門氏菌檢出為陽(yáng)性(+)，單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和陰性對(duì)照均檢出為陰性(-)，初步表明針對(duì)沙門氏菌建立的iiPCR 檢測(cè)方法特異性良好。

圖2 沙門氏菌特異性試驗(yàn) Fig.2 Specific test for Salmonella

2.4 靈敏度和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將純培養(yǎng)濃度為7.5×108CFU/mL 沙門氏菌菌液，通過梯度稀釋至不同的濃度，然后采用上述擴(kuò)增體系對(duì)不同稀釋濃度的培養(yǎng)液（7.5×102CFU/mL、7.5×101CFU/mL、7.5 CFU/mL）進(jìn)行檢測(cè)，從圖3 中可以看出，POCKITTM手持式核酸分析儀界面上3 號(hào)孔顯示為陰性(-)，1 號(hào)孔和2 號(hào)孔顯示為陽(yáng)性(+)，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，表明所建立的iiPCR 方法穩(wěn)定性良好，對(duì)沙門氏菌純培養(yǎng)液的最低檢出限為75 CFU/mL。

圖3 沙門氏菌穩(wěn)定性和靈敏度試驗(yàn) Fig.3 The stability and sensitivity test evaluation for Salmonella

進(jìn)一步將純培養(yǎng)濃度為7.5×108CFU/mL 的沙門氏菌菌液通過十倍梯度稀釋培養(yǎng)液，分別采用傳統(tǒng)PCR 方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果見圖4a 和4b。由圖4a 可得，傳統(tǒng)PCR方法對(duì)沙門氏菌的最低檢出限為泳道6 中的7.5×103CFU/mL；由圖4b 可得，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)沙門氏菌的最低檢出限為7.5×102CFU/mL；而本研究建立的iiPCR 方法對(duì)沙門氏菌的最低檢出限為75 CFU/mL，靈敏度比傳統(tǒng)PCR 靈敏100 倍，比實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏10 倍。

圖4 沙門氏菌的傳統(tǒng)PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 敏感性試驗(yàn) Fig.4 Sensitivity test by traditional PCR and real-time fluorescence quantitative PCR for Salmonella

2.4 食物樣品前增菌培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的探索結(jié)果

對(duì)實(shí)際采集的陽(yáng)性樣品在緩沖蛋白胨水（BPW）中進(jìn)行預(yù)增菌，通過對(duì)2、3、4、5、6、7 和8 h 時(shí)的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖5。由圖5a 可以看出，采用傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)，在8 h 預(yù)增菌的培養(yǎng)點(diǎn)上可以檢測(cè)出陽(yáng)性條帶。由圖5b 可以看出，iiPCR 在5 h、6 h、7 h 和8 h 的預(yù)增菌培養(yǎng)點(diǎn)上都可以檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，說明建立的iiPCR 方法檢測(cè)的靈敏度更高。

圖5 實(shí)際樣品前增菌培養(yǎng)時(shí)間探索 Fig.5 Exploring the pre-enrichment and cultivation time for actual samples detection

2.5 方法的初步應(yīng)用

采用建立的iiPCR方法對(duì)采集的14份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，在5 h 增菌培養(yǎng)點(diǎn)，iiPCR 方法擴(kuò)增結(jié)果見圖6，iiPCR 方法對(duì)2 份樣品檢出沙門氏菌呈陽(yáng)性結(jié)果，檢出率為14%（2/14）。

圖6 食品樣品iiPCR 在5 h 培養(yǎng)點(diǎn)的檢出結(jié)果 Fig.6 The iiPCR detection results for food samples at 5 h

2.6 三種檢出方法的比較及檢測(cè)流程對(duì)比

采用建立的iiPCR方法與傳統(tǒng)PCR方法以及傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法對(duì)采集樣品進(jìn)行檢出結(jié)果比較，結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3。在8 h 培養(yǎng)點(diǎn)時(shí)傳統(tǒng)PCR 方法擴(kuò)增結(jié)果見圖7，傳統(tǒng)PCR 方法也可對(duì)2 份樣品（11 號(hào)和12 號(hào)）檢出沙門氏菌陽(yáng)性結(jié)果，檢出率為14%（2/14）。根據(jù)GB 4789.4-2016 對(duì)18 h 培養(yǎng)點(diǎn)的樣品進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果見圖8a，發(fā)現(xiàn)所檢出的2 份陽(yáng)性樣品分離的菌落，可在BS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為圓形、呈黑色并帶有金屬光澤的菌落，在傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離的菌落進(jìn)行常規(guī)PCR 鑒定，檢測(cè)結(jié)果見圖8b，圖中也顯示只有11 號(hào)和12 號(hào)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其余均為陰性，與5 h 培養(yǎng)點(diǎn)時(shí)的iiPCR 方法檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果一致。

表3 三種檢測(cè)方法的比較 Table 3 The comparison of three detection methods

圖7 食品樣品經(jīng)過8 h 預(yù)增菌的PCR 檢出結(jié)果（沙門氏菌）Fig.7 Food sample detection results of traditional PCR by 8 h pre-enrichment culture (Salmonella)

圖8 傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離的菌落（a）和分離細(xì)菌的PCR 鑒定結(jié)果（b）Fig.8 The traditional culture method validation (a) and PCR identification results (b)

對(duì)建立的iiPCR 方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法、傳統(tǒng)PCR 方法、熒光定量PCR 進(jìn)行對(duì)比，從樣品的采集到結(jié)果的檢出，傳統(tǒng)培養(yǎng)法整個(gè)鑒定檢測(cè)流程至少需要4～6 d[27]，傳統(tǒng)PCR 方法檢測(cè)整個(gè)流程需12～16 h 甚至更久，熒光定量PCR 方法檢測(cè)整個(gè)流程需10～12 h 左右，而iiPCR 方法檢測(cè)整個(gè)流程可在6～8 h 完成，比其他檢測(cè)方法節(jié)省很多時(shí)間，并且可直接得出結(jié)果，操作更便捷，如圖9。

圖9 iiPCR 方法和其他檢測(cè)方法對(duì)比流程圖 Fig.9 The comparison flow chart of iiPCR and other detection methods

細(xì)菌在接種培養(yǎng)后，前1～4 h 生長(zhǎng)一般遲緩，繁殖數(shù)量較少，遲緩期后，進(jìn)入對(duì)數(shù)期，這個(gè)時(shí)期細(xì)菌開始大量繁殖。本研究通過探索對(duì)于食品樣品中沙門氏菌前增菌培養(yǎng)時(shí)間，只需在緩沖蛋白胨水中培養(yǎng)5 h后配合水浴法提取模板DNA，利用建立的iiPCR 方法即可檢測(cè)出樣品中是否含有沙門氏菌。研究結(jié)果和Tsen 等[28]及Du 等[29]探索結(jié)果相似，Tsen 等[28]針對(duì)雞肉中沙門氏菌檢測(cè)，驗(yàn)證雞肉樣品經(jīng)過富集以及DNA提取步驟，可利用iiPCR 在8 h 內(nèi)完成檢測(cè)結(jié)果。Du等[29]針對(duì)餐飲中的沙門氏菌和志賀氏菌進(jìn)行iiPCR 方法的開發(fā)和評(píng)估，說明該技術(shù)對(duì)食品污染致病菌的檢測(cè)應(yīng)用是可行的。本實(shí)驗(yàn)建立的iiPCR 方法靈敏度比Du 等建立的iiPCR（最低檢出限103CFU/mL）靈敏度高，本實(shí)驗(yàn)檢出限為75 CFU/mL。結(jié)合POCKITTM系列手持式核酸檢測(cè)儀42 min 的反應(yīng)和結(jié)果顯示，大大節(jié)省時(shí)間，從目標(biāo)細(xì)菌富集，細(xì)菌模板DNA 提取，靶特異性基因擴(kuò)增，到檢測(cè)結(jié)果顯示，整個(gè)檢測(cè)流程可在6～8 h 左右完成。

3 結(jié)論

3.1 本研究建立了檢測(cè)沙門氏菌的iiPCR 方法，克服了儀器昂貴、不方便攜帶、操作人員要求高等缺點(diǎn)。選擇沙門氏菌invA 基因作為本方法的靶基因，設(shè)計(jì)了引物和探針，對(duì)iiPCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出建立的iiPCR 方法靈敏度高，沙門氏菌的最低檢出限可達(dá)75 CFU/mL，采用iiPCR檢測(cè)其他細(xì)菌（單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌等）結(jié)果無(wú)交叉反應(yīng)，說明特異性良好。并分別對(duì)沙門氏菌培養(yǎng)液的三個(gè)稀釋度進(jìn)行了三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果完全一致，說明建立的iiPCR 方法穩(wěn)定性良好。

3.2 利用上述建立的方法對(duì)實(shí)際采集食品樣品進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè)，將采集的14 份食品樣品直接在緩沖蛋白胨水中富集培養(yǎng)，采集2、3、4、5、6、7、8 h 的培養(yǎng)液，同時(shí)采用建立的iiPCR 方法和傳統(tǒng)PCR 方法進(jìn)行樣品檢測(cè)和比對(duì)，結(jié)果表明在5 h 的培養(yǎng)點(diǎn)，建立的iiPCR 方法能對(duì)2 份樣品可檢測(cè)出沙門氏菌陽(yáng)性結(jié)果，檢測(cè)率為14%（2/14）；而采用傳統(tǒng)PCR 方法在8 h培養(yǎng)點(diǎn)時(shí)才能對(duì)這2 份樣品檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，檢出率為14%（2/14）。雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏度要高于傳統(tǒng)PCR 2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，但本研究建立的iiPCR 方法比實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的靈敏度高10 倍，且基于4通道POCKITTM 手持核酸分析儀，自帶電源，體型小，方便攜帶并且一鍵操作，加樣后直接反應(yīng)，檢測(cè)過程僅42 min，反應(yīng)后結(jié)果直接顯示于液晶屏，省去分析及凝膠電泳等繁瑣過程，整體耗時(shí)要遠(yuǎn)比傳統(tǒng)PCR 和熒光定量PCR 檢測(cè)方法少?？梢?，針對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，建立的iiPCR 更加快捷、靈敏和實(shí)用。但本研究也存在不足，特別是方法中涉及的陽(yáng)性菌株和陰性菌株數(shù)量不夠多，為更好地評(píng)價(jià)建立的iiPCR方法的特異性和靈敏度，我們會(huì)在后續(xù)的研究中進(jìn)一步增加食品樣品采集數(shù)量，并與傳統(tǒng)法和熒光實(shí)時(shí)定量PCR 方法進(jìn)行比較，以達(dá)到方法的推廣使用。

3.3 綜上，本研究建立的一種基于恒溫隔絕式PCR技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的方法，對(duì)方法進(jìn)行部分應(yīng)用，初步證明該方法靈敏度高，特異性好，穩(wěn)定性好。將該方法結(jié)合水浴法快速提取模板DNA 以及POCKIT?手持式核酸分析儀，通過設(shè)計(jì)特異性引物和探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。從目標(biāo)細(xì)菌富集，到模板DNA 提取，特異性基因擴(kuò)增到出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果，整個(gè)過程可在6～8 h 完成。相比其它檢測(cè)方法，至少節(jié)省6 h 檢測(cè)時(shí)間，省去凝膠電泳過程，操作更便捷。