基于三維熒光光譜及模式識別技術(shù)對當(dāng)歸質(zhì)量的分析與鑒別

郭晴茹，劉紅，石振萍，楊扶德，石曉峰，邵士俊*

（1.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000）（2.中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院，北京 100093）（3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000）（4.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州 730050）

三維熒光光譜提供了熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長和發(fā)射波長同時(shí)變化的熒光信息，也稱為全掃描熒光光譜，它能夠完整地描述物質(zhì)的熒光特征，具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，且獲得的三維熒光等高線圖具有指紋性[1,2]。三維熒光光譜分析技術(shù)已在石油化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3-5]。針對植物鑒別與質(zhì)量評價(jià)，三維熒光指紋圖譜具有能夠反映多組分復(fù)雜體系整體化學(xué)特征的獨(dú)特優(yōu)勢，極具應(yīng)用潛力[6]。

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis(Oliv.) Diels]的干燥根，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效[7]，有“補(bǔ)血圣藥”之稱，在調(diào)節(jié)人體血液功能、保肝強(qiáng)腎健體等方面具有重要的藥理作用。在我國傳統(tǒng)飲食文化中，當(dāng)歸作為香辛料和調(diào)味品被廣泛食用，美國、歐盟、日本也將當(dāng)歸作為香辛料食用。作為一種常用的大宗藥食同源物質(zhì)，當(dāng)歸的食品安全與質(zhì)量控制至關(guān)重要[8-14]。當(dāng)歸的化學(xué)成分可分為苯酞類、香豆素類、有機(jī)酸類，以及氨基酸、多糖、維生素和微量元素等多種類別，目前，主要采用紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜、高效液相色譜等方法對當(dāng)歸的化學(xué)成分/組分進(jìn)行定性定量分析，用于當(dāng)歸質(zhì)量控制與評價(jià)，將三維熒光光譜分析擠模式識別技術(shù)應(yīng)用于當(dāng)歸質(zhì)量分析與鑒別的研究鮮有報(bào)道[15-19]。本工作結(jié)合當(dāng)歸所含化學(xué)成分，如苯酞類、黃酮類、生物堿類、氨基酸和蛋白質(zhì)等所具有的光譜性質(zhì)，研究建立當(dāng)歸水溶性、醇溶性和脂溶性提取物的三維熒光光譜分析方法，并將三維熒光光譜信息與計(jì)算機(jī)模式識別技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于當(dāng)歸質(zhì)量一致性評價(jià)和真?zhèn)舞b別，為當(dāng)歸快速鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Lambda 35 紫外可見分光光度計(jì)，PerkinElmer 公司；Fluorolog-3 熒光光譜儀，HORIBA 公司；PB-10/C標(biāo)準(zhǔn)型pH 計(jì)，Sartorius 公司；JB-040S 潔盟牌超聲波清洗機(jī)，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.2 材料

當(dāng)歸、歐當(dāng)歸樣本分別采集于甘肅岷縣、漳縣、渭源、隴西、宕昌、天祝、臨潭和青海湟源等種植基地（見表1），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis(Oliv.) Diels]的干燥根、傘形科植物歐當(dāng)歸（Levisticum officinalisKoch）的干燥根。傘形科植物川穹、獨(dú)活、北沙參、蛇床子和小茴香購買于蘭州市藥店，水為超純水，其它試劑均為分析純。

表1 不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸樣品 Table 1 Angelica sinensis samples from different producing areas

1.3 方法

以采自甘肅岷縣的當(dāng)歸藥材為樣本，進(jìn)行當(dāng)歸特征提取物制備條件和光譜分析條件的篩選優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)考察影響因素，建立供試品溶液制備及三維熒光光譜分析方法。

1.3.1 供試品溶液制備

1.3.1.1 水提取物

當(dāng)歸粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱取5.00 g，加入100 mL水，浸泡30 min后，油浴磁力攪拌回流提取30 min，冷卻后，補(bǔ)齊重量，經(jīng)離心分離，取上清液作為母液備用（濃度50.00 mg/mL，即每毫升相當(dāng)于50.00 mg藥材）。用超純水稀釋，配制成適當(dāng)濃度的供試品溶液，用于光譜分析。

1.3.1.2 甲醇-水提取物

當(dāng)歸粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱取2.00 g 于具塞三角瓶中，加入甲醇-水（V:V，1:1）40 mL，超聲提取45 min，離心分離，取上清液作母液備用（濃度50.00 mg/mL，即每毫升相當(dāng)于50.00 mg 藥材）。用50%甲醇-水溶劑稀釋，配制成適當(dāng)濃度的供試品溶液，用于光譜分析。

1.3.1.3 乙酸乙酯提取物

當(dāng)歸粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱取5.00 g 于索氏提取器中，加入100 mL 乙酸乙酯，加熱回流2 h，抽提至抽取筒內(nèi)溶劑無色，提取液轉(zhuǎn)移至圓底瓶中，冷卻后補(bǔ)齊重量，作為母液備用（濃度50.00 mg/mL，即每毫升相當(dāng)于50.00 mg 藥材）。用乙酸乙酯稀釋，配制成適當(dāng)濃度的供試品溶液，用于光譜分析。

1.3.2 緩沖溶液配制

稱取磷酸氫二鈉9.47 g 和磷酸二氫鉀9.07 g 分別加入1000 mL 的容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，貯存在4℃的冰箱中，用時(shí)分別按不同比例混合，利用酸度計(jì)調(diào)控pH 值，配制pH 4.0～pH 9.0 一系列溶液。強(qiáng)酸（pH 2.0）或強(qiáng)堿pH（pH 11.0）分別用1.2 mol/L HCl 溶液或1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)配。

1.3.3 吸收和熒光光譜測試

室溫下測定供試品溶液的紫外可見吸收光譜和熒光光譜。三維熒光光譜測試條件為：激發(fā)波長（λex）范圍250～400 nm，采樣間隔10 nm，激發(fā)狹縫2 nm；發(fā)射波長（λem）范圍270 nm～600 nm，采樣間隔10 nm，發(fā)射狹縫2 nm；積分時(shí)間0.2 s。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

為減小實(shí)驗(yàn)誤差每個(gè)樣品測定2～5 次，采用Origin 整理各次測定得到的三維熒光光譜圖中相對應(yīng)的數(shù)據(jù)，建立判別函數(shù)，采用SPSS 22 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和判別分析，差異顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 當(dāng)歸提取物的三維熒光光譜

在優(yōu)化的供試品制備方法和光譜測試條件下，當(dāng)歸水提取物、50%甲醇-水提取物和乙酸乙酯提取物的紫外吸收光譜和三維熒光光譜分析結(jié)果如圖1 所示。

圖1 當(dāng)歸提取物的紫外吸收光譜和三維熒光光譜 Fig.1 Absorption spectra and three-dimensional fluorescence spectra of Angelica sinensis extracts

當(dāng)歸水提取物（1.00 mg/mL）的最大吸收峰出現(xiàn)在270 nm，并有325 nm 的肩峰；三維熒光光譜呈現(xiàn)出3 個(gè)特征激發(fā)/發(fā)射（λex/λem）峰，即270 nm/350 nm（Peak 1）、330 nm/470 nm（Peak 2）和280 nm/470 nm（Peak 3）熒光峰。50%甲醇-水提取物（濃度0.50 mg/mL）的紫外吸收光譜和三維熒光光譜特征與水提取物類似，但吸收光譜的325 nm 吸收明顯增強(qiáng)；三維熒光光譜的3 個(gè)特征激發(fā)/發(fā)射峰中，Peak 2 和Peak 3 的熒光強(qiáng)度相對于Peak 1 顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，當(dāng)歸水提取物與50%甲醇-水提取物的熒光物質(zhì)成分組成相近，但后者形成475 nm 發(fā)射峰（Peak 2 和Peak 3）的熒光物質(zhì)成分含量較高。當(dāng)歸乙酸乙酯提取物具有完全不同于水提取物和甲醇-水提取物的吸收和發(fā)射光譜，三維熒光光譜呈現(xiàn)出2 個(gè)激發(fā)/發(fā)射特征峰，分別是265 nm/295 nm（Peak 4）和325 nm/425 nm（Peak 5）熒光峰，吸收和發(fā)射光譜的差異反映了脂溶性提取物具有不同的熒光物質(zhì)成分。

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 水提取物

考察提取溶劑水的用量（固液比分別為1:5、1:10、1:20、1:40），提取時(shí)間（15 min、30 min、45 min）對熒光光譜影響，結(jié)果如圖2 所示。以濃度1.00 mg/mL供試品溶液三維熒光光譜特征峰的相對強(qiáng)度來判定，確定固液比1:20，提取時(shí)間30 min為最佳的提取條件。

圖2 不同溶劑用量和提取時(shí)間的當(dāng)歸水提取物三維熒光光譜特征峰強(qiáng)度變化 Fig.2 Fluorescence intensity changes of the three-dimensional fluorescence spectral characteristic peaks of Angelica sinensiswater extract with different solvent dosage and extraction time

2.2.2 甲醇-水提取物

考察提取溶劑甲醇-水的配比（0:1、1:1、1:0）、用量（固液比1:10、1:20、1:40）和提取時(shí)間（30 min、45 min、60 min）的影響，結(jié)果如圖3 所示。以濃度0.50 mg/mL 供試品溶液三維熒光光譜特征峰的相對強(qiáng)度來判定，確定甲醇-水體積比1:1，固液比1:20，提取時(shí)間45 min 為最佳的提取條件。

圖3 不同甲醇-水配比、溶劑用量和提取時(shí)間的當(dāng)歸提取物三維熒光光譜特征峰強(qiáng)度變化 Fig.3 Fluorescence intensity changes of the three-dimensional fluorescence spectral characteristic peaks of Angelica sinensis extracts with different methanol-water ratio,solvent dosage and extraction time

2.2.3 脂溶性提取物

考察提取溶劑（石油醚、正己烷、乙酸乙酯）和提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h）的影響，結(jié)果如圖4 所示。以濃度1.00 mg/mL 供試品溶液三維熒光光譜特征峰的相對強(qiáng)度來判定，確定乙酸乙酯抽提2 h 為最佳的提取條件。

圖4 不同提取溶劑和提取時(shí)間的當(dāng)歸脂溶性提取物三維熒光光譜特征峰強(qiáng)度變化 Fig.4 Fluorescence intensity changes of the three-dimensional fluorescence spectral characteristic peaks of Angelica sinensisfat-soluble extracts with different extraction solvent and extraction time

2.3 供試品溶液濃度的影響

根據(jù)熒光分析的一般規(guī)律，稀溶液中熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，熒光物質(zhì)濃度較大時(shí)會發(fā)生自猝滅，使熒光強(qiáng)度降低。將當(dāng)歸提取物的母液配制成不同濃度的供試品溶液，考察濃度對體系紫外吸收光譜和三維熒光光譜特征峰的影響。

不同濃度的水提取物紫外吸收光譜和三維熒光光譜特征峰熒光強(qiáng)度變化見圖5。結(jié)果表明，在考察的濃度范圍內(nèi)（0.50～4.50 mg/mL），當(dāng)歸水提物紫外吸收強(qiáng)度隨濃度升高而增強(qiáng)；三維熒光光譜中Peak l、Peak 3 特征峰的熒光強(qiáng)度受濃度影響較小，Peak 2 熒光強(qiáng)度隨濃度升高而逐漸增強(qiáng)并趨于平穩(wěn)，考慮到特征峰之間熒光強(qiáng)度的差異以及所得三維熒光光譜圖應(yīng)最大限度總體反映熒光物質(zhì)信息，確定供試品溶液最佳檢測濃度為1.00 mg/mL。50%甲醇提取物的紫外吸收與三維熒光光譜特征峰發(fā)射強(qiáng)度隨供試品溶液濃度的變化與水提取物的類似，供試品溶液最佳檢測濃度為0.50 mg/mL。

圖5 不同濃度水提取物和乙酸乙酯提取物的紫外吸收光譜和熒光光譜變化 Fig.5 Absorption and fluorescence spectral changes of Angelica sinensis extracts under different concentration conditions

乙酸乙酯提取物的紫外吸收強(qiáng)度隨供試品溶液濃度升高而增大；三維熒光光譜特征峰Peak 4 的熒光強(qiáng)度隨濃度升高而降低，特征峰Peak 5 的熒光強(qiáng)度隨濃度升高先增強(qiáng)再降低，激發(fā)波長輕微紅移而發(fā)射波長位置保持不變，供試品溶液最佳檢測濃度為1.00 mg/mL。

2.4 供試品溶液酸堿度的影響

重點(diǎn)考察了當(dāng)歸水提取物供試品溶液（1.00 mg/mL）的pH 值變化對三維熒光光譜的影響，結(jié)果如圖6 所示。在pH 2.0～7.0 范圍內(nèi)，Peak l、Peak 2 和Peak 3 特征峰的峰位置基本沒有變化，熒光強(qiáng)度隨pH值增加輕微增強(qiáng)。在pH 7.0～12.0 范圍內(nèi)隨pH 的增加，Peak 1熒光強(qiáng)度明顯增加且發(fā)射波長輕微紅移，Peak 2和Peak 3 的峰位置基本不變但熒光強(qiáng)度明顯減小，尤其在pH 11.20 時(shí)的熒光光譜發(fā)生顯著變化。不同pH條件下的三維熒光光譜變化表明，水提取物中的熒光組分，特別是形成475 nm 發(fā)射峰的熒光組分的分子結(jié)構(gòu)中可能存在易于質(zhì)子化和去質(zhì)子化的基團(tuán)，強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件對其熒光光譜有較大影響。當(dāng)歸水提取物供試品溶液在中性條件下呈現(xiàn)良好的三維熒光光譜特征。

圖6 不同pH 條件下的當(dāng)歸水提取物三維熒光光譜 Fig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of Angelica sinensiswater extract (1.00 mg/mL) under different pH conditions

2.5 當(dāng)歸三維熒光光譜的專屬性

采用“1.3.1.1”的供試品制備方法，制備當(dāng)歸同科屬植物川穹、獨(dú)活、北沙參、蛇床子、小茴香的水提取物，并在相同的供試品濃度和熒光光譜分析條件下分別測定三維熒光光譜，結(jié)果如圖7 所示。當(dāng)歸與川芎的水提取物三維熒光光譜形貌非常相似，但與其他同屬科中藥材水提取物的三維熒光光譜在特征熒光峰的個(gè)數(shù)、位置及熒光強(qiáng)度等方面都存在明顯差異，當(dāng)歸與獨(dú)活、北沙參、蛇床子、茴香可以通過水提取物的三維熒光圖譜進(jìn)行快速鑒別，但不能有效區(qū)分當(dāng)歸與川穹。這一結(jié)果表明當(dāng)歸與川穹的水溶性提取物的物質(zhì)組成和成分含量具有高度相似性。

圖7 當(dāng)歸與同科屬中藥材的水提取物三維熒光光譜(1.0 mg/mL) Fig.7 Three-dimensional fluorescence spectra of the water extracts from Angelica sinensisand other umbelliferae plant (1.0 mg/mL)

采用“1.3.1.3”的供試品制備方法，制備當(dāng)歸同科屬植物川穹、獨(dú)活、北沙參、蛇床子、小茴香的乙酸乙酯提取物。在相同的供試品濃度和熒光光譜分析條件下分別測定三維熒光光譜，結(jié)果如圖8 所示。當(dāng)歸與同科屬植物的乙酸乙酯提取物的三維熒光光譜呈現(xiàn)不同的圖譜形貌，特別是當(dāng)歸與川芎的特征熒光峰形貌及其位置和熒光強(qiáng)度具有顯著差異，該結(jié)果表明當(dāng)歸與川穹的脂溶性成分存在較大差異，能夠通過乙酸乙酯提取物的三維熒光圖譜進(jìn)行快速鑒別。

圖8 當(dāng)歸與同科屬中藥材乙酸乙酯提取物的三維熒光光譜(1.0 mg/mL) Fig.8 Three-dimensional fluorescence spectra of the ethyl acetate extracts from Angelica sinensis and other umbelliferae plant (1.0 mg/ mL)

2.6 不同產(chǎn)地當(dāng)歸三維熒光光譜判別分析

采用“1.3.1.1”制備方法，制備不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣本的水提取物供試品溶液（平行制備3 份），并在相同的光譜分析條件下，分別測定三維熒光光譜，見圖9。

圖9 不同產(chǎn)地當(dāng)歸的三維熒光光譜圖 Fig.9 Three-dimensional fluorescence spectra of water extract ofdifferent Angelica sinensis samples from different producing areas

當(dāng)歸水提物三維熒光光譜圖是提取物中所有熒光組分的光譜疊加，其圖譜特征是各熒光物質(zhì)的總體反映，直觀表現(xiàn)為熒光光譜的最大激發(fā)波長（λex）、最大發(fā)射波長（λem）以及對應(yīng)的最大發(fā)射強(qiáng)度（Iem）同時(shí)變化的信息。不同當(dāng)歸樣品水提取物三維熒光光譜呈現(xiàn)的三個(gè)特征峰Peak 1、Peak 2 和Peak 3 的位置（λex/λem）基本一致，但發(fā)射強(qiáng)度（Iem）以及特征峰之間的相對強(qiáng)度存在差異。提取熒光光譜圖的特征信息λex、λem和Iem，以各當(dāng)歸樣品特征峰Peak 1、Peak 2 和Peak 3 對應(yīng)的熒光強(qiáng)度Iem（三次平行測定的平均值）為變量，建立判別函數(shù)，采用SPSS 22 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和判別分析。判別分析結(jié)果見表2。

表2 判別分析結(jié)果 Table 2 Discriminant analysis results

表中dis_1 為執(zhí)行判別分析后系統(tǒng)對樣品的分類，dis1_2、dis2_2、dis3_2、dis4_2 分別對應(yīng)于各個(gè)數(shù)據(jù)被判定為第1 類、第2 類、第3 類、第4 類的概率，用于評價(jià)判別結(jié)果的準(zhǔn)確性。判別分析結(jié)果將實(shí)驗(yàn)的當(dāng)歸樣本分為四類，甘肅岷縣、漳縣、渭源縣、隴西縣、宕昌縣和臨潭縣的當(dāng)歸樣本判別為第1 類；甘肅天祝當(dāng)歸、青海湟源當(dāng)歸和歐當(dāng)歸分別被判別為第2、3 和4 類。表明采用熒光光譜特征值結(jié)合此判別方法可以快速有效的區(qū)分不同當(dāng)歸樣品，分類結(jié)果反映了當(dāng)歸種植環(huán)境和品種對品質(zhì)的影響。其中，甘肅岷縣、漳縣、渭源縣、隴西縣、宕昌縣和臨潭縣的地理位置和氣候條件最相近，也是中藥當(dāng)歸的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)，質(zhì)量具有一致性。此外，盲樣X1 和X2 加入上述數(shù)據(jù)系統(tǒng)中進(jìn)行判別分析，分別被歸類為第3 類和第4 類，即青海湟源當(dāng)歸和歐當(dāng)歸，與實(shí)際樣品情況完全一致。

3 結(jié)論

3.1 研究建立的當(dāng)歸特征提取物的三維熒光光譜呈現(xiàn)出特征光譜形貌，能夠總體反映提取物中熒光物質(zhì)信息。當(dāng)歸水提取物與50%甲醇提取物的三維熒光光譜具有相同的特征熒光峰，但特征熒光峰相對強(qiáng)度存在明顯差異，表明了這兩種提取物中熒光組分含量存在差異。脂溶性提取物具有完全不同于水提取物和50%甲醇提取物的三維熒光光譜特征，表明其不同的熒光物質(zhì)組成。當(dāng)歸水提物和乙酸乙酯提取物的三維熒光光譜具有良好的專屬性，能夠?qū)崿F(xiàn)當(dāng)歸與其同科屬常用中藥材的快速有效鑒別。與紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜等分析方法相比較，在最佳提取條件下，當(dāng)歸提取物三維熒光光譜反映了當(dāng)歸藥材中熒光物質(zhì)成分的整體信息，所需樣品量少，方便快捷。

3.2 利用建立的當(dāng)歸水提取物三維熒光光譜并結(jié)合計(jì)算機(jī)模式識別方法，對不同當(dāng)歸樣本進(jìn)行檢測和判別分析，實(shí)現(xiàn)了對不同產(chǎn)區(qū)和品種當(dāng)歸的判別分類和質(zhì)量一致性評價(jià)，為深入研究和建立當(dāng)歸三維熒光光譜指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)提供參考。