超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定水稻中的13種植物激素含量

張慶，李誠(chéng)至，林鈺涓，于曉章

（桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西桂林 541006）

植物激素是植物產(chǎn)生的痕量的并對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起至關(guān)重要作用的信號(hào)分子物質(zhì)[1-3]。吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素3（GA3）參與了植物從種子休眠、萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)，以及成熟和衰老的整個(gè)生命過(guò)程，茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）是2 種主要的脅迫激素，受到脅迫的調(diào)控，在植物的脅迫耐受性和抗逆性中發(fā)揮著重要作用[4-6]。但是，植物激素在大多數(shù)組織中的含量很低[7,8]，通常在10-6～10-9g 之間，性質(zhì)不穩(wěn)定，與其共存的成分非常復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)容易受到干擾。同時(shí)有些植物材料非常珍貴，材料量少，因此要求檢測(cè)的方法必須簡(jiǎn)便、快速、靈敏、專(zhuān)一[9-11]。

目前植物激素的使用不當(dāng)或?yàn)E用現(xiàn)象導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題日益增多[3]，從食品安全的角度來(lái)看，建立一種實(shí)用準(zhǔn)確的水稻中植物激素殘留分析方法顯得非常必要。目前，植物激素的測(cè)定主要采用色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[12-18]。氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用在靈敏度問(wèn)題上能滿足植物激素的測(cè)定要求，但樣品需要純化、濃縮和衍生化處理，增加了樣品前處理步驟[19,20]。超高效液相色譜（UPLC）-串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）具有高靈敏度和高選擇性，可以滿足植物粗提液中植物激素的定量測(cè)定，同時(shí)還很大程度上簡(jiǎn)化了樣品前處理程序。

目前，基于液相色譜（LC）-串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）聯(lián)用方法對(duì)植物激素的分析，大多集中在生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素3（GA3）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）等幾種植物激素，存在可檢測(cè)的植物激素種類(lèi)偏少等問(wèn)題[2,4,7]。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立一種同時(shí)測(cè)定水稻中赤霉素3（GA3）、赤霉素1（GA1）、異戊烯基腺嘌呤（IPA）、水楊酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、赤霉素7（GA7）、赤霉素4（GA4）、茉莉酸異亮氨酸（JA-ILe）、油菜素甾酮（CS）、12 氧代植物二烯酸（12-OPDA）和香蒲甾醇（TY）等13 種植物激素含量的分析方法，為水稻中植物激素的分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 超高液相色譜儀串聯(lián)AB SCIEX 5500 Qtrap 質(zhì)譜儀。美國(guó)MET QL-866 渦旋混勻儀（13111-V-220）。冷凍離心機(jī)（H1650-W）。色譜柱Waters，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，i.d.1.7 μm）。甲酸購(gòu)自Fluka，乙腈、甲醇購(gòu)自Merck。所有植物激素的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自O(shè)lchemim。實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q plus 去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 mg 的赤霉素3、赤霉素1、異戊烯基腺嘌呤、水楊酸、吲哚乙酸、脫落酸、茉莉酸、赤霉素7、赤霉素4、茉莉酸異亮氨酸、油菜素甾酮、12氧代植物二烯酸和香蒲甾醇溶解在甲醇溶液中，配制成濃度為1 mg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液。取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。其中，各植物激素濃度為1 μg/mL。將上述溶液用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)糜诶L制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：流動(dòng)相，A 液為0.04%甲酸-水溶液，B 液為0.04%甲酸-乙腈溶液。樣品置于4℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，柱溫45℃，流速為400 μL/min，進(jìn)樣量4 μL。梯度洗脫設(shè)置如下：0～10 min，B 液從2%線性變化到98%，A 液相應(yīng)的從98%線性變化到2%；10～11.1 min，B 液從98%線性變化至2%，A 液相應(yīng)的從2%線性變化到98%；11.1～13 min，B 液維持在2%，A 液相應(yīng)的維持在98%。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離子源（ESI），掃描方式為負(fù)離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。ESI 條件如下：Source Temperature（離子源溫度）：500℃；Ion Source Gas1（輔助加熱氣1）：45；Ion Source Gas2（輔助加熱氣2）：45；Curtain Gas（氣簾氣）：30；Ion Sapary Voltage Floating（電噴霧電壓）：-4500 V。

1.4 植物激素的提取

植物激素的提取參考文獻(xiàn)[21,22]。具體實(shí)驗(yàn)方法如下，將水稻葉片組織樣品液氮研磨，取100 mg 樣品于2 mL 離心管中，加入1 mL 甲醇-乙腈-水溶液（40:40:20，V/V），震蕩混勻2 min；4℃避光抽提12 h，14000 r/min 離心10 min，取上清液800 μL，氮?dú)獯蹈?，?00 μL 甲醇-水溶液（50:50，V/V）定溶，14000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 定容溶劑選擇

實(shí)驗(yàn)比較了水、甲醇-水（50:50，V/V）、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（50:50，V/V）和乙腈-水（50:50，V/V）6 種定容溶液的對(duì)植物激素峰形、響應(yīng)強(qiáng)度以及出峰時(shí)間的影響[21,22]，結(jié)果分別如圖1a、1b、1c、1d、1e 和1f 所示。結(jié)果表明，純水作為定容溶劑，部分目標(biāo)分析物（3 號(hào)峰異戊烯基腺嘌呤和10 號(hào)峰茉莉酸異亮氨酸）響應(yīng)強(qiáng)度較低（圖1a）。甲醇作為定容溶劑，出峰時(shí)間較早的目標(biāo)分析物如赤霉素3、赤霉素1等的色譜峰出現(xiàn)明顯分叉（圖1c）。含有乙腈的溶液[乙腈-水（50:50，V/V）、乙腈和甲醇-乙腈（50:50，V/V）]，出峰時(shí)間普遍較長(zhǎng)（圖1d、1e 和1f），并且吲哚乙酸、12 氧代植物二烯酸、香蒲甾醇峰形拖尾嚴(yán)重。定容溶劑選擇甲醇-水（50:50，V/V）時(shí)目標(biāo)分析物的響應(yīng)強(qiáng)度較高，且目標(biāo)分析物峰形均較好（圖1b）。綜合考慮，本文以甲醇-水（50:50，V/V）為定容溶劑。

圖1 不同定容溶劑時(shí)13 種植物激素的總離子流圖 Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of thirteen plant hormones at different solvents

2.2 色譜柱的選擇

對(duì)于植物激素這類(lèi)弱極性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱。ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱具備pH=1～12 范圍內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠影響可電離化合物的保留性、選擇性和靈敏性，同時(shí)還能在低pH 和高pH 條件下保持優(yōu)異的柱穩(wěn)定性。

2.3 色譜條件優(yōu)化

考察了流動(dòng)相對(duì)分離的影響，直接以乙腈-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，13 種植物激素的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品不能完全分離，色譜峰拖尾嚴(yán)重。甲酸可以抑制樣品基質(zhì)的電離，改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象，因此流動(dòng)相中需要加入甲酸。

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相中甲酸的用量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)甲酸含量為0.04%時(shí)分離效果最佳，既保證了13 種植物激素混合標(biāo)樣的有效分離，又改善了拖尾現(xiàn)象。因此最終確定流動(dòng)相A 為甲酸-水溶液（0.04:99.6），B 為甲酸-乙腈溶液（0.04:99.6），并采用梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

植物激素的檢測(cè)有采用正離子模式，也有采用負(fù)離子模式[12,13]。在正離子模式下，部分物質(zhì)產(chǎn)生了[M+Na]+、[M+K]+的離子峰。其中，[M+Na]+和[M+K]+可能是水中的Na+，K+引起的。在負(fù)離子模式ESI(-)下，13 種植物激素都產(chǎn)生了響應(yīng)較強(qiáng)的[M-H]-。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)離子模式[ESI(-)]。其次，優(yōu)化化合物的子離子和碰撞能量，選擇豐度較高的兩個(gè)子離子作為化合物的特征離子對(duì)，并對(duì)電噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描駐留時(shí)間，去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)優(yōu)化，確定出最佳的質(zhì)譜參數(shù)。所有植物激素的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。最佳色譜質(zhì)譜條件下的13 種植物激素總離子流圖如圖1b 所示。

表1 13 種植物激素的質(zhì)譜參數(shù) Table 1 The mass spectrum of thirteen plant hormones

2.5 線性關(guān)系和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋配制成10 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再稀釋至ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。以上述色譜質(zhì)譜條件，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析，以植物激素濃度為x 軸，所對(duì)應(yīng)的峰面積為y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），以信噪比（S/N）為3 確定化合物的檢出限（LOD），具體見(jiàn)表2。線性范圍在1～500 ng/mL 之間，R2均大于0.9980，LOD 最低至0.310 ng/mL。

表2 13 種植物激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）Table 2 Linearity,correlation coefficient (R2) and detection limits of thirteen plant hormones

2.6 回收率和精密度

在處理的樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制備1、50、100 ng/mL 三個(gè)濃度加標(biāo)水平的樣品，每個(gè)濃度水平設(shè)3 個(gè)平行樣品。用本方法進(jìn)行測(cè)定，平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。添加3 個(gè)不同濃度（1、50、100 ng/mL）的植物激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，13 種植物激素的平均加標(biāo)回收率為81.90%～118.80%，RSD 均小于8.12%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合檢測(cè)要求。各植物激素在保留時(shí)間區(qū)域內(nèi)無(wú)干擾，故本方法具有較好的選擇性。

表3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗(yàn)結(jié)果 Table 3 Recovery and relative standard deviation (RSD) of thirteen plant hormones (n=3)

2.7 實(shí)際樣品分析

研究選取湘早秈45 號(hào)、汕優(yōu)63 號(hào)和桂朝2 號(hào)三個(gè)品種的水稻樣品。將測(cè)得的植物激素的峰面積代入上述工作曲線中，經(jīng)過(guò)換算，得到相應(yīng)的水稻中植物激素含量，如表4 所示。從表4 中可以看出，三個(gè)品 種水稻中GA3 和ABA 含量較多，研究表明GA3 和植物生長(zhǎng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)并且促進(jìn)代謝，而ABA 對(duì)植物成花的誘導(dǎo)和發(fā)育具有重要調(diào)控作用[21]。此外，GA4 是具有生物活性的赤霉素，能夠促進(jìn)莖的生長(zhǎng)[21]；GA7 可以打破某些種子的休眠，提高結(jié)實(shí)率[22]；JA-ILe 可以增強(qiáng)植物遭遇損傷或者蟲(chóng)鳥(niǎo)取食后產(chǎn)生局部防御反應(yīng)能力[22]；CS 是一種能促進(jìn)植物莖桿伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的高活性物質(zhì)，亦可防御環(huán)境脅迫[23,24]。最后，通過(guò)比較可以看出，不同品種的水稻中植物激素含量有些差異。

表4 水稻樣品中的13 種植物激素含量 Table 4 The content of thirteen plant hormones in rice samples

2.8 方法對(duì)比分析

將本研究所得的結(jié)果與文獻(xiàn)中的檢測(cè)方法檢出限進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果如表5 所示。從表5 中我們可以看出，本研究建立的多種激素測(cè)定方法大部分都比文獻(xiàn)中所報(bào)道的檢測(cè)方法檢出限更低，并且檢出的植物激素種類(lèi)更多。關(guān)于GA1、IPA、GA4、GA7、JA-ILe、CS、12-OPDA 和TY 含量測(cè)定的方法文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。本研究建立的測(cè)定方法，能夠很好地應(yīng)用于GA1、IPA、GA4、GA7、JA-ILe、CS、12-OPDA 和TY 等植物激素含量的檢測(cè)。

表5 植物激素測(cè)定方法的檢出限對(duì)比 Table 5 Detection limit comparsion of plant hormones

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水稻組織中赤霉素3，赤霉素1，異戊烯基腺嘌呤，水楊酸，吲哚乙酸，脫落酸，茉莉酸，赤霉素7，赤霉素4，茉莉酸異亮氨酸，油菜素甾酮，12 氧代植物二烯酸和香蒲甾醇的方法。該方法簡(jiǎn)便快速，能夠滿足水稻中植物激素含量的要求，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。這將對(duì)深入研究水稻生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程、揭示水稻響應(yīng)生物與非生物環(huán)境機(jī)制、提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)以及鑒定植物激素殘留限量等方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用與參考價(jià)值。