核桃青皮提取物對(duì)非酒精性脂肪肝的作用

方瓊蓮，王蒙蒙，喬雪，李欣坪，黃豐，林玉萍，趙聲蘭

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明，650500)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種慢性進(jìn)行性肝臟疾病，病理過(guò)程始于肝脂肪沉積，可進(jìn)展為非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌等，已成為全球終末期肝病的主要病因，影響全球約25%的人群[1-2]。NAFLD常伴有高血脂、高血壓、冠心病等，增加心血管疾病發(fā)生率和死亡風(fēng)險(xiǎn)，已成為威脅人群健康和生命的重要疾病[3]。研究顯示，脂質(zhì)過(guò)氧化及炎癥因子失衡是NAFLD病情發(fā)展過(guò)程中致肝細(xì)胞損傷的重要原因[4]。

核桃青皮是胡桃科植物胡桃楸未成熟果實(shí)的青果皮，又名青龍衣，主要分布在河北、山東、云南等省[5-6]。核桃青皮味苦、澀，性平，微寒，有小毒，具有清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢等功效[7-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，核桃青皮提取物具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、治療皮膚病、殺蟲等藥理活性[9-11]。云南是我國(guó)著名的核桃主產(chǎn)區(qū)之一，核桃年產(chǎn)量居全國(guó)之首，但核桃青皮的利用價(jià)值低，大多丟棄在農(nóng)間地頭，不僅資源浪費(fèi)還會(huì)污染環(huán)境[12]。為促進(jìn)資源的綜合利用，本文研究核桃青皮不同溶劑提取物對(duì)NAFLD大鼠的體重變化、肝臟病理學(xué)改變及血清中甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamate aminotransferase，ALT)水平、肝臟丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性的影響，以期能揭示其對(duì)NAFLD損傷大鼠的作用活性部位，為資源開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃青皮(walnut green husk)為核桃未成熟的外果皮，采自云南省麗江市華坪縣；SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，6～8周齡，體重180～200 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002]),動(dòng)物倫理學(xué)審查編號(hào)R-0620170043。

膽酸鈉，深圳百晟精細(xì)化有限公司；膽固醇，廣州億寶萊生物科技有限公司；豬油，四川瑞洋油脂有限公司；蛋黃粉，實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買雞蛋后自制；0.9%氯化鈉注射液，廣西裕源有限公司；75%乙醇消毒液，昆明利健消毒制品有限公司；水飛薊賓膠囊，天津天力士圣特制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20040299)；TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST試劑盒，南京建成生物工程研究所；MDA(批號(hào)：120718190301)、GSH-Px(批號(hào)：112618190311)、SOD(批號(hào)：032219190408)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純，中國(guó)天津市化學(xué)試劑一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；INFINITE M200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；湘儀H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；先行者TM(OHAUS)分析天平，上海奧豪斯有限公司；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核桃青皮提取物的制備

核桃青皮干燥后粉碎成粗粉，取500 g用2 000 mL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇加熱回流提取3次，每次3 h；合并3次提取液，減壓蒸餾濃縮得乙醇浸膏(浸膏得率20.40%)，冷凍干燥，即得乙醇提取物(102 g)。取部分乙醇提取物，加適量水溶解，形成混懸溶液，再依次用乙酸乙酯、正丁醇各200 mL進(jìn)行萃取，分別萃取4次；合并相同萃取部分，回收溶劑濃縮成浸膏(浸膏得率分別為18.55%、21.89%)，冷凍干燥，得到乙酸乙酯萃取物(18.92 g)和正丁醇萃取物(22.33 g)。

1.3.2 大鼠肝損傷模型的建立與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

36只SPF級(jí)SD雄性大鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)室條件為室溫18～25 ℃、濕度(55±5)%，隨機(jī)選取6只為正常組，給予正常飼料；其余30只大鼠給予高脂飼料[13](82.5%普通飼料、2%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉)，連續(xù)喂養(yǎng)12周，建造NAFLD大鼠肝損傷模型。造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(水飛薊賓12.6 mg/kg)、核桃青皮乙醇提取物組(300 mg/kg)、核桃青皮乙酸乙酯萃取物組(300 mg/kg)、核桃青皮正丁醇萃取物組(300 mg/kg)，每組6只。各組大鼠自由飲水和進(jìn)食，晝夜交替周期12 h，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6周，給藥期間每周監(jiān)測(cè)大鼠體重、飲水量和進(jìn)食量。末次給藥后禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜止30 min后，低溫離心(3 000 r/min)15 min，分離得到血清[14]；迅速取出肝臟，用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水漂洗，部分按肝組織與生理鹽水1∶9(g∶mL)制備勻漿，于-4 ℃、3 500 r/min離心15 min，吸取上層勻漿清液[15]；部分用4%多聚甲醛固定，脫水制成石蠟切片，用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察[16]。

1.3.3 病理切片觀察

HE染色后的各組大鼠肝組織切片，置于顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像。

1.3.4 肝比重的測(cè)定

肝比重的測(cè)定如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 生化指標(biāo)的檢測(cè)

血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT和AST含量的測(cè)定:取上述制備各組大鼠的血清，按照試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量。

肝組織中的TG、TC、ALT、AST、MDA含量和SOD、GSH-Px活性的測(cè)定:取上述各組大鼠的肝組織勻漿上清液，按照試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)各組大鼠肝臟中TG、TC、ALT、AST、MDA的含量和SOD、GSH-Px的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃青皮提取物對(duì)NAFLD大鼠體重的影響

核桃青皮不同提取部位對(duì)大鼠體重的影響結(jié)果如表1所示。給藥前到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，正常組、模型組、水飛薊賓組、核桃青皮乙醇提取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組大鼠的體重均逐日增加。其中模型組體重上升趨勢(shì)較為明顯，而水飛薊賓組、核桃青皮乙醇提取物組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組大鼠的體重隨給藥周數(shù)的增加上升緩慢，特別是核桃青皮乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組大鼠體重在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)與正常組較為接近，說(shuō)明核桃青皮提取物具有降低NAFLD大鼠體重的作用。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠的體重變化Table 1 Body weight changes of rats in each experimental group after administration

2.2 肝損傷病理切片分析

各組大鼠肝損傷病理切片結(jié)果如圖1所示。正常組(圖1-a)中大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈叢呈放射狀分布、排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常；模型組(圖1-b)大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索和肝竇結(jié)構(gòu)不清晰，部分肝細(xì)胞壞死，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明肝損傷模型復(fù)制成功。水飛薊賓組(圖1-c)和核桃青皮不同極性部位(圖1-d～圖1-f)可改善肝細(xì)胞的損傷程度，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，病變情況有較大改善，其中核桃青皮正丁醇萃取物改善肝損傷病理組織的作用最為明顯。

a-正常組；b-模型組；c-水飛薊賓組；d-核桃青皮乙醇提取物組；e-核桃青皮乙酸乙酯萃取物組；f-核桃青皮正丁醇萃取物組圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of rat liver tissues in each experimentalgroup(×200)

2.3 肝損傷病理切片分析

核桃青皮不同提取物對(duì)大鼠肝比重的影響結(jié)果如圖2所示。與正常組比較，模型組肝比重急劇升高(P<0.001)。與模型組比較，水飛薊賓組和核桃青皮不同提取物顯著降低(P<0.001)，說(shuō)明核桃青皮不同提取物皆有較好降低肝比重的作用。

圖2 核桃青皮提取物對(duì)大鼠肝比重的影響Fig.2 Effects of the extract of walnut green husk on liver specific gravity of rats注：與正常組相比，###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001(下同)

2.4 核桃青皮提取物對(duì)肝損傷大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量的影響

核桃青皮不同提取物對(duì)肝損傷大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST含量的影響結(jié)果如圖3所示。與正常組比較，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量顯著升高(P<0.001)，HDL-C顯著降低(P<0.001)，表明肝損傷模型復(fù)制成功。與模型組比較，核桃青皮不同提取物組TG、TC含量顯著降低(P<0.001)，說(shuō)明核桃青皮具有較好的降脂作用。由于脂肪的過(guò)度沉積會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)中自由基增加和氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起線粒體和細(xì)胞膜損傷，增加通透性，從而使血清中AST和ALT的含量升高。

2.5 核桃青皮對(duì)肝損傷大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD活性的影響

核桃青皮提取物不同部位對(duì)大鼠肝組織中MDA、GSH-Px、SOD活性的影響結(jié)果如圖4所示。與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA的含量明顯升高(P<0.001)，GPS-Px、SOD活性顯著降低(P<0.001)，表明肝損傷模型復(fù)制成功。與模型組比較，水飛薊賓和核桃青皮不同提取物均可顯著降低肝勻漿中MDA含量(P<0.001，P<0.05)，顯著增強(qiáng)GPS-Px和SOD的活性(P<0.001)，其中核桃青皮正丁醇萃取物的效果更明顯。

a-TC；b-HDL-C；c-TG；d-LDL-C；e-AST；f-ALT圖3 核桃青皮提取物對(duì)大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST的影響Fig.3 Effects of the ethanol extract of walnut green husk on the level of TG, TC, HDL-C, LDL-C, ALT, AST in serum of rats

a-MDA含量；b-SOD活性；c-GSH-Px活性圖4 核桃青皮提取物對(duì)大鼠肝組織中MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響Fig.4 Effects of the extract of walnut green husk on the level of MDA and SOD, GSH-Px activity in liver of rats

3 結(jié)論

核桃(JuglansregiaL.)屬于胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)，目前中國(guó)是最大的核桃生產(chǎn)國(guó)(約170萬(wàn)t)[17-18]。研究報(bào)道，胡桃屬植物具有強(qiáng)勁的抗氧化、抗腫瘤、殺菌和止痛等功能[19]，核桃青皮乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力[20]，能有效減輕高果糖(high-fructose，HF)飲食引起的肝損傷[21]。而植物來(lái)源的抗氧化劑在預(yù)防代謝綜合征和由長(zhǎng)期高脂肪、高糖飲食引起的代謝疾病方面顯示出潛在的生物學(xué)效應(yīng)[22]。為明確核桃青皮對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD具有改善作用和抗氧化活性部位。本實(shí)驗(yàn)研究核桃青皮95%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD的作用。

水飛薊賓有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、消除自由基、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，對(duì)于各種原因引起的急慢性肝炎、脂肪肝的肝功能異常等均具有治療作用，是天然的保肝藥，所以選擇其為陽(yáng)性藥[23]。大鼠的體重、肝比重、TG、TC、HDL-C、LDL-C是反應(yīng)大鼠肥胖程度的重要指標(biāo)；ALT和AST是診斷肝功能障礙的重要指標(biāo)[24]，當(dāng)肝臟損傷時(shí)，ALT和AST從肝細(xì)胞進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中ALT和AST含量明顯升高[25]。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，可間接反映細(xì)胞膜脂損傷程度；當(dāng)肝細(xì)胞氧化損傷時(shí)，SOD、GSH-Px不斷消耗清除超氧化物、自由基及有害物質(zhì)等，其含量可反映肝組織過(guò)氧化損傷的程度[26-27]。

本研究結(jié)果顯示，核桃青皮乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物可減輕成年大鼠肝臟質(zhì)量，減少肝臟脂肪堆積，降低肝比重，降低大鼠血清中TG、TC、LDL-C、ALT、AST含量，升高HDL-C含量，且具有顯著性差異；能改善肝組織病理?yè)p傷；顯著性降低肝勻漿中MDA含量并升高GSH-Px、SOD含量；其中，正丁醇萃取物表現(xiàn)出更好的效果。因此，核桃青皮能調(diào)節(jié)高脂飼料誘導(dǎo)NAFLD模型大鼠的肝脂水平，改善肝損傷，其正丁醇部位有效活性成分需進(jìn)一步研究闡明。