乳酸菌B2-1發(fā)酵產(chǎn)物中雙功能活性肽組分研究

郭皓，丁琳，樊磊，楊文欽，靳瑾健，藏傳剛，劉宇超，關宏*

1(齊齊哈爾醫(yī)學院科研處，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省農(nóng)墾齊齊哈爾管理局中心醫(yī)院藥劑科，黑龍江 齊齊哈爾，161000)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的日益提高，心血管疾病、癌癥等與機體氧化傷害有關的疾病發(fā)病率不斷提高[1-2]，如何有效維護人體健康，防止心血管疾病、腫瘤已成為人們普遍關注的社會問題。許多疾病可稱為“自由基”疾病，據(jù)統(tǒng)計，心臟病、腫瘤、衰老、糖尿病等數(shù)百種疾病都與自由基有關，能否有效地清除自由基成為解決各類疾病的關鍵問題[3-5]。近年來生物活性肽受到廣泛的重視，開發(fā)既具有抗氧化又具有抗腫瘤活性的雙功能活性肽用以預防和治療自由基引發(fā)的疾病[6]，減少心腦血管疾病以及腫瘤、機體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義。

乳清蛋白是一類利用現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術從牛奶中提取出來的蛋白質，乳清蛋白具有高蛋白、低脂肪、易于消化吸收、含有豐富必需氨基酸、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點, 被稱為“蛋白之王”[7]。乳清蛋白生物活性成分中含有豐富的半胱氨酸，使其可以影響機體的抗氧化能力。本研究前期已證實乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性和抗腫瘤活性[8-9]。而在活性肽的制備過程中，其分離純化技術一直是研究的熱點。由于發(fā)酵液具有成分復雜、分子質量小等特點，其分離純化過程變得相對較難，想要分離純化出單一肽段難度大，而且目前對多肽的研究大多僅集中于單一活性的評價[10]，而雙功能或多功能的多肽研究較少，可參考性較低，缺乏試驗數(shù)據(jù)，但是因其安全性高、無副作用等優(yōu)點[11-12]，以抗氧化、抗腫瘤為主的雙功能活性肽具有很好的開發(fā)前景[13-14]。

因此，本課題的研究目的是通過對乳酸菌的乳清蛋白代謝發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)大孔吸附樹脂及凝膠過濾層析方法進行分離純化，以獲得雙功能活性肽組分，通過體外實驗評價抗氧化、抗腫瘤活性，從而為開發(fā)抗氧化、抗腫瘤的雙功能活性肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，生工生物工程股份有限公司；ABTS、水溶性維生素E(Trolox)，Sigma-Aldric公司；噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，Amersco公司；鄰苯二甲醛(O-phthaldialdehyde，OPA)，國藥集團化學試劑有限公司；彩色預染蛋白質分子量標準(Marker)，北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。色譜柱填料：大孔吸附樹脂D101，艾美科健中國生物醫(yī)藥有限公司；葡聚糖凝膠G15，美國GE公司。

1.2 培養(yǎng)基

乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基：根據(jù)改良MRS培養(yǎng)基作出調整，具體組成成分如下，脫鹽乳清粉10 g、牛肉提取物10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、醋酸鈉5 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，加水至1 L，121 ℃，滅菌15 min。

1.3 儀器與設備

冷凍干燥機(6 L)，美國Labconco公司；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；Safire2酶標儀，奧地利Tecan公司；IS09001恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Z36HK大容量高速冷凍離心機，德國Hermle公司；Sepacore中壓制備色譜(中壓色譜柱 25 mm×460 mm)，瑞士BUCHI公司；AKTA Explorer100全自動蛋白層析系統(tǒng)(蛋白層析柱16 mm×100 mm)，美國GE公司。

1.4 乳酸菌B2-1發(fā)酵液的制備

乳酸菌B2-1是由玉米浸泡液中分離純化獲得的，現(xiàn)保存在齊齊哈爾醫(yī)學院微生態(tài)工程技術研究中心。挑取B2-1菌種接種于1 mL滅菌的乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h，連續(xù)擴培2次后，取培養(yǎng)物按體積分數(shù)5%的接種量接種于乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5周后，6 000 r/min離心10 min，取上清液凍干，此為乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液凍干粉，存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 乳酸菌B2-1發(fā)酵乳清蛋白代謝產(chǎn)物的分離純化

1.5.1 大孔吸附樹脂D101柱層析分離

對乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液凍干粉采用大孔吸附樹脂D101層析柱分離純化，取凍干粉3 g溶解于20 mL純凈水離心后上樣，先用2～3個柱體積純凈水洗脫，再采用梯度乙醇溶液和無水乙醇洗脫，流速為2.5 mL/min，采用自動收集器收集分離組分，每管收集時間為2 min，每隔3管測定餾分的214、254、280 nm處的吸光度值、多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率，以體積為橫坐標，以吸光度、多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率為縱坐標，分別繪制曲線，綜合上述實驗結果收集3個組分，分別命名為F1、F2及F3，備用待測。

1.5.2 葡聚糖凝膠G15柱層析分離

將大孔吸附樹脂D101分離出的組分中具有較高抗氧化活性和抗腫瘤活性的F3組分采用葡聚糖凝膠G15柱進行分離純化，采用超純水洗脫，F(xiàn)3組分上樣量為5 mL(0.07 g/mL)，流速為0.7 mL/min，每管收集體積為8 mL，采用自動收集器收集分離組分，根據(jù)出峰位置收集2個組分，命名為F3-1及F3-2，備用待測。

1.5.3 多肽含量的測定

采用OPA法進行測定[15]。取20 μL樣品加入到150 μL的OPA試劑中，混勻后于室溫下反應2 min，在340 nm下測定吸光度值，以水為空白對照，絲氨酸為標準品對照，計算樣品多肽含量。

1.5.4 SDS-PAGE

取各樣品10 μL，加入10 μL上樣緩沖液后，煮沸3 min，待其冷卻后備用。配制分離膠，待聚合完成后，配制濃縮膠，按順序加樣后，預電泳電壓75 V電泳至分離膠處，改用120 V恒壓電泳至溴酚藍指示劑遷移到距前沿1～2 cm處停止電泳。將電泳結束后的凝膠取出，適當剪切，在考馬斯亮藍R250染色液中置于搖床上室溫緩慢振蕩，染色2 h，脫色液脫色后拍照[16]。

1.6 抗氧化活性的測定

抗氧化活性測定采用ABTS陽離子自由基清除能力進行測定[17]。利用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液配制待測樣品溶液，經(jīng)稀釋后制備不同濃度的工作液。ABTS陽離子自由基工作液，使用前以0.01 mol/L Tris-HCl(pH 7.4)適當稀釋，使OD值在0.8左右。將40 μL質量濃度為1 g/L的樣品與160 μL ABTS 試劑混勻，室溫條件下避光反應6 min。利用酶標儀在734 nm處測定吸光度值。將50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液作為空白對照，Trolox作為陽性對照。計算如公式(1)所示：

(1)

1.7 抗腫瘤活性檢測

抗腫瘤活性測定采用MTT法[16]。將消化好的人結腸癌細胞系LoVo細胞、人口腔癌細胞系Cal-27細胞和KB細胞分別接種于96孔板，接種細胞的起始濃度為1×104個/孔，樣品作用細胞的時間為48 h，每個處理組設立3個復孔。48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后終止培養(yǎng)，2 000 r/min離心10 min后吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。酶標儀檢測波長為570 nm，細胞的抑制率計算公式如(2)所示：

(2)

1.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌B2-1的形態(tài)

將26種菌株接種到乳清蛋白-MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用ABTS陽離子自由基清除實驗及MTT實驗進行評價篩選，最終得到菌株B2-1，其菌體形態(tài)如圖1所示，菌株B2-1菌體呈雙桿狀，短小的桿菌，兩端圓形。菌體成單、成對或成鏈，不形成芽孢。

圖1 乳酸菌B2-1的形態(tài)示意圖Fig.1 Morphological diagram of Lactobacillus B2-1

2.2 乳酸菌B2-1發(fā)酵乳清蛋白代謝產(chǎn)物的分離純化

2.2.1 大孔吸附樹脂D101層析柱分離純化

對乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液的凍干粉經(jīng)大孔吸附樹脂D101層析柱分離，通過紫外檢測器檢測其洗脫情況，結果如圖2所示。大孔吸附樹脂D101層析柱依次分離出來3個峰，分別為F1、F2和F3。對分離物進行多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率的跟蹤檢測，結果顯示多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率較高的部分主要分布在峰F1、F2和F3上，因此綜合上述實驗，收集了3個大孔吸附樹脂D101層析柱分離組分，經(jīng)冷凍干燥分別命名為F1、F2和F3，每個組分的得率分別為25.72%、11.75%和3.29%。

a-大孔吸附樹脂柱D101層析圖譜示意圖;b-大孔吸附樹脂柱D101層析餾分多肽含量和ABTS陽離子自由基清除率曲線圖2 大孔吸附樹脂D101層析圖譜及餾分多肽含量和ABTS陽離子自由基清除率曲線Fig.2 Chromatogram of macroporous adsorption resin D101, polypeptide content and ABTS cationic free radical scavenging curve

對收集的3個組分F1、F2和F3進行多肽含量、ABTS陽離子自由基清除率、MTT實驗檢測，實驗結果如表1和圖3所示。多肽含量和ABTS陽離子自由基清除率的均最高的組分是F3，相比于乳酸菌B2-1 乳清蛋白代謝產(chǎn)物發(fā)酵液的凍干粉，經(jīng)過大孔吸附樹脂D101分離后組分的ABTS陽離子自由基清除率提高近2倍，因此認為F3組分是具有抗氧化活性的組分。抗腫瘤活性的初步篩選實驗選擇了3種細胞，分別為人結腸癌LoVo細胞，人口腔癌KB細胞和Cal-27細胞，每個組分作用時間為48 h。由圖3可知，F(xiàn)1組分對3種細胞增殖的抑制作用不明顯；F2組分對3種細胞增殖的抑制作用的順序是LoVo細胞>KB細胞>Cal-27細胞，其中質量濃度8 g/L的F2組分對LoVo細胞增殖的抑制率已達到50%；F3組分對3種細胞增殖的抑制作用的順序是LoVo細胞>KB細胞>Cal-27細胞，是3種組分中抗腫瘤效果最好的，質量濃度8 g/L的F3組分對LoVo細胞增殖的抑制率接近70%。

圖3 大孔吸附樹脂D101柱層析各組分對腫瘤細胞增殖的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of each component of macroporous adsorption resin D101 column chromatography on tumor cell proliferation注：與空白組相比，a表示P<0.01，b表示P<0.05(下同)

表1 大孔吸附樹脂D101柱層析各組分收率、多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率Table 1 The yield, polypeptide content, and ABTS cationic free radical scavenging rate of each component of macroporous adsorption resin D101 column chromatography

對各組分的樣品進行SDS-PAGE實驗,結果如圖4所示。結果顯示F1組分在10、20 kD左右有微弱條帶，在F2組分的蛋白電泳未顯示出條帶，而F3組分在70 kDa及10～20 kDa附近均呈現(xiàn)較明顯的條帶，而各個組分在凝膠底部均出現(xiàn)條帶，說明F1、F2和F3組分均有較小分子質量的多肽，因此，綜合各組分的實驗結果，從抗腫瘤實驗和抗氧化實驗初步篩選得到的結論是F3組分最優(yōu)，是同時具有抗氧化和抗腫瘤雙功能的組分，因此，后續(xù)的實驗選擇F3進行繼續(xù)分離。

M-Marker圖4 大孔吸附樹脂D101分離組分SDS-PAGE實驗結果示意圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis results of components separated by macroporous adsorption resin D101 column chromatography

2.2.2 葡聚糖凝膠G15層析柱分離純化

經(jīng)大孔吸附樹脂D101柱層析分離后，洗脫組分F3經(jīng)葡聚糖凝膠G15層析柱進行分離純化，洗脫曲線如圖5所示，洗脫后得到2個組分，分別命名為F3-1和F3-2。

圖5 F3的葡聚糖凝膠G15柱層析圖譜Fig.5 Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component

對收集的2個組分進行多肽含量、ABTS陽離子自由基清除率及MTT實驗檢測，實驗結果如表2和圖6所示。相比于F3-2組分，F(xiàn)3-1的多肽含量為0.353 g/L，ABTS陽離子自由基清除率為69.29%。在MTT試驗中，F(xiàn)3-1對3種腫瘤細胞的抑制率更顯著，其中，對LoVo細胞的增殖的抑制率最高，當F3-1的質量濃度為8 g/L時，抑制率達到75.36%，因此，可以認為F3-1組分是具備雙功能活性肽組分。

表2 F3的葡聚糖凝膠G15柱層析組分的多肽含量及ABTS陽離子自由基清除率Table 2 The polypeptide content and ABTS free radical scavenging rate of Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component

圖6 G15層析柱分離后組分各組分對腫瘤細胞增殖的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of each component of Sephadex G15 gel column chromatography of F3 component on tumor cell proliferation

3 結論

生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有生物活性的肽類化合物，它屬于蛋白質片段，起著調節(jié)機體功能平衡的作用[18]。隨著乳源生物活性肽研究的興起與產(chǎn)品的開發(fā)，開發(fā)既具有抗氧化又具有抗腫瘤活性的雙功能活性肽用以預防和治療氧化及自由基引發(fā)的疾病，減少心腦血管疾病、腫瘤及機體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義[19]。但由于目前中國整體乳清蛋白處理技術不發(fā)達，造成了大量產(chǎn)生的乳清蛋白無可用之地，其傾瀉也對自然環(huán)境造成了一定的壓力[20]。因此，開發(fā)以抗氧化、抗腫瘤為主的乳源雙功能活性肽有很好的發(fā)展前景。

本研究通過大孔吸附樹脂和凝膠過濾層析對乳酸菌B2-1的乳清蛋白代謝發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化，提供一種抗氧化、抗腫瘤的雙功能活性肽組分的制備方法。此種方法既有效的利用了乳清蛋白，又可以得到具有生物功能的活性肽成分，同時項目中的原料價格低廉，因此具有巨大的社會效益及經(jīng)濟效益。