羥自由基氧化對核桃蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響

張雪春,李如蕊，程群,楊曦,王嬌芳,劉江,孫健

1(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650224)2(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧，530007)

核桃是世界上主要堅果之一，其仁中含有55%～70%的油脂，18%～24%的蛋白質(zhì)，并富含礦物質(zhì)、維生素和天然抗氧化劑[1]。核桃蛋白中8種必需氨基酸比例合理，接近WHO和FAO的推薦范圍，是具有較大發(fā)展?jié)摿Φ闹参锏鞍住?/p>

研究發(fā)現(xiàn)，光、過渡金屬、自由基等物理化學(xué)因素可使蛋白質(zhì)氧化，其主鏈和氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生變化，進而使蛋白質(zhì)的感官、功能性質(zhì)、消化率和營養(yǎng)品質(zhì)降低[2]。蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后羰基化合物含量增加[3]，蛋白的分子間作用力被破壞，高級結(jié)構(gòu)改變并形成交聯(lián)聚集[4-6]，因此通過研究蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、光譜特征、反應(yīng)位點等可反映氧化對蛋白質(zhì)的作用規(guī)律。據(jù)文獻報道，羥自由基氧化可導(dǎo)致豬肉、魚肉的凝膠化改變，持水能力下降[7]；其中，胱氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸較易被氧化[8-9]；羥自由基氧化在一定程度上可提高大豆蛋白和卵清蛋白的界面性質(zhì)[10-11]，因此對改善富含蛋白質(zhì)食品的穩(wěn)定性有研究意義，但嚴重的氧化則會導(dǎo)致相反的結(jié)果，而一些植物提取物可起到抑制羥自由基氧化食物蛋白質(zhì)的作用[2，12]。此外，相關(guān)研究也證實，一些植物和動物蛋白經(jīng)氧化后，構(gòu)象和相關(guān)性質(zhì)均發(fā)生了相應(yīng)的改變[13-14]。

目前，蛋白質(zhì)的氧化研究主要集中于動物蛋白的貯藏和加工等方面，關(guān)于羥自由基氧化對核桃等植物蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生理活性等方面的研究還不夠全面和深入，而對蛋白質(zhì)氧化的基礎(chǔ)研究對于探明食物蛋白質(zhì)在貯藏、加工、消化等階段中的變化規(guī)律具有一定意義。因此，本文以核桃蛋白為研究對象，經(jīng)鐵/過氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)體系產(chǎn)生羥自由基，研究氧化修飾對核桃蛋白的主要基團、性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)等的影響規(guī)律，為核桃蛋白的基礎(chǔ)研究和開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

核桃餅粕，大理州巍山縣大倉鎮(zhèn)大理鑫淼農(nóng)業(yè)實業(yè)有限公司；福林酚試劑盒、2，4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、二硫代二硝基苯甲酸[5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、牛血清白蛋白等，北京索萊寶科技有限公司；三氯化鐵、抗壞血酸等，均為分析純試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano-ZS納米激光粒度儀，英國Malvem公司；S-3000 N掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司；3K15型高速冷凍離心機，美國Sigma 公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機，上海標本模型廠；UV-1000紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科技儀器有限公司；F50型酶標儀，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Lumina熒光分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；4.5 L真空冷凍干燥機，美國LABCONCO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 核桃蛋白的制備

核桃餅粕經(jīng)去雜、粉碎過60目篩后，加入25倍水調(diào)pH至8.7，于48 ℃攪拌提取1 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液調(diào)pH至5，于相同條件下離心，取沉淀水洗至中性，凍干為核桃蛋白(walnut protein, WP)。

1.3.2 羥自由基氧化核桃蛋白的制備

參照KONG等[15]方法并略做修改?？刂艶eCl3和抗壞血酸的濃度分別為0.01 mmol/L和0.1 mmol/L，分別調(diào)節(jié)H2O2濃度至0、0.1、1、5、10、15 mmol/L，核桃蛋白于上述氧化體系中4 ℃反應(yīng)24 h后，經(jīng)乙二胺四乙酸終止得到羥自由基氧化核桃蛋白(hydroxyl radical oxidized walnut protein, HRO-WP)。

1.3.3 羰基含量的測定

參照WANG等[16]方法并略做修改，采用DNPH顯色法測定HRO-WP中羰基含量。HRO-WP與DNPH反應(yīng)后，經(jīng)三氯乙酸沉淀，鹽酸胍溶解后，于370 nm測定吸光度值，采用22 000 L/(mol·cm)摩爾消光系數(shù)換算，羰基含量表示為nmol/mg蛋白。

1.3.4 游離巰基與總巰基的測定

參照KONG等[15]方法，采用DTNB顯色法測定HRO-WP中總巰基與游離巰基的含量。HRO-WP與DTNB水浴反應(yīng)1 h后，離心取上清液于412 nm處測定吸光度值，采用13 600 L/(mol·cm)摩爾消光系數(shù)換算，游離巰基含量表示為nmol/mg蛋白。

HRO-WP經(jīng)β-巰基乙醇和尿素-鹽酸胍處理后，按上述方法測定和計算HRO-WP的總巰基含量。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜分析

參考ZHANG等[17]的方法并略做修改。配制1 mg/mL HRO-WP磷酸鹽緩沖液，經(jīng)充分攪拌均勻后，于4 ℃，10 000 r/min離心30 min，取上清液以290 nm為激發(fā)波長，發(fā)射波長為300～500 nm熒光掃描。

1.3.6 HRO-WP粒徑分布的測定

HRO-WP經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋為1 mg/mL后，采用激光納米粒度分析儀測定其粒徑分布情況。

1.3.7 溶解度的測定

參考ZHANG等[18]的方法并略做修改。HRO-WP經(jīng)0.05 mol/L pH 7.9磷酸鹽緩沖液配制為1 mg/mL溶液，于8 000 r/min離心15 min，分別測定上清液和核桃蛋白樣品中的蛋白質(zhì)含量。核桃蛋白的溶解度按公式(1)計算：

(1)

1.3.8 持水性和持油性的測定

參考孫英杰[19]的方法并略做修改。取0.4 g的HRO-WP和8 mL的水于離心管中渦漩振蕩1 min后，于3 000 r/min離心20 min，傾出上清液，稱量離心管中核桃蛋白和殘留水的質(zhì)量，持水性表示為單位質(zhì)量核桃蛋白可結(jié)合水的質(zhì)量(g/g)。把水換成大豆油，以類似的方法測定和計算HRO-WP的持油性，持油性表示為單位質(zhì)量核桃蛋白可結(jié)合油的質(zhì)量(g/g)。

1.3.9 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定

參考盧巖[10]的方法并略修改，大豆油與1 mg/mL HRO-WP磷酸鹽緩沖溶液按體積比1∶4混合后，于10 000 r/min高速分散1 min，立即從底部吸取50 μL乳狀液與25 mL的0.1%(質(zhì)量分數(shù))SDS溶液混勻，于500 nm處測定吸光度值A(chǔ)0，靜置10 min后再測定吸光度值A(chǔ)10，按公式(2)和公式(3)計算HRO-WP的乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability index，ESI)：

(2)

(3)

式中：N，稀釋因子，500；c，核桃蛋白溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL；t，時間間隔，10 min；φ，乳狀液中油相的體積分數(shù)，0.25。

1.3.10 起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定

參考LI等[11]的測定方法并略做修改。HRO-WP經(jīng)pH 7磷酸鹽緩沖液配制為1 mg/mL溶液，于室溫攪拌1 h，取20 mL于10 000 r/min高速分散2 min，分別測定0 min和30 min時總體積，按公式(4)、公式(5)計算起泡性(foaming capacity, FC)和起泡穩(wěn)定性(foaming stability, FS)：

(4)

(5)

1.3.11 電鏡掃描分析

取少量HRO-WP樣品粘貼在掃描電鏡樣品臺上，以無水乙醇潤濕并分散均勻，干燥后經(jīng)噴金處理，采用500倍放大掃描觀察其微觀形貌。

1.3.12 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗操作均重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和Origin 2018 32Bit處理分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白羰基含量的變化情況

羥自由基氧化蛋白的過程復(fù)雜并伴隨著許多相應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中羰基是應(yīng)用最廣泛的初步評價蛋白氧化程度的指標，羥自由基對核桃蛋白羰基含量的影響如圖1所示，隨著氧化程度的增大，核桃蛋白的羰基含量呈濃度依賴性增加，當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時，羰基含量相比對照組顯著增加88.94%(P<0.05)。與楊曦等[20]的研究結(jié)果相似，說明在氧化體系中，羥自由基攻擊核桃蛋白的主肽鏈或側(cè)鏈，形成碳中心自由基，進而生成醛類和酮類等羰基衍生物[21-22]。

圖1 HRO對核桃蛋白羰基含量影響Fig.1 Effect of HRO on the carbonyl content of WP注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 核桃蛋白游離巰基和總巰基的變化情況

蛋白質(zhì)氧化首先導(dǎo)致巰基和蛋氨酸殘基的修飾，因此核桃蛋白氧化后的結(jié)構(gòu)變化可通過總巰基和游離巰基的含量反映。羥自由基氧化體系對核桃蛋白的總巰基和游離巰基的影響如圖2所示。隨著H2O2濃度的逐漸增大，核桃蛋白的總巰基和游離巰基呈顯著下降趨勢(P<0.05)，當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時，與對照組相比，總巰基和游離巰基含量分別下降28.2%和27.5%，表明核桃蛋白經(jīng)羥自由基氧化后，可能會發(fā)生可逆的氧化反應(yīng)，使巰基被氧化為二硫鍵和次磺酸狀態(tài)，同時也可能發(fā)生不可逆的氧化，導(dǎo)致核桃蛋白游離巰基和總巰基的下降，這與盧巖[10]對大豆蛋白進行氧化后研究結(jié)果相似。

圖2 HRO對核桃蛋白游離巰基和總巰基的影響Fig.2 Effect of HRO on free and total sulfydryl of WP

2.3 內(nèi)源熒光的變化情況

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光的產(chǎn)生是由于色氨酸殘基的存在，其相對位置可通過熒光峰位來反映，常用來表征蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。羥自由基對可溶性核桃蛋白內(nèi)源熒光強度和熒光最大發(fā)射波長的影響如圖3和圖4所示。隨著H2O2濃度的增大，可溶性核桃蛋白的熒光強度逐漸減小，在H2O2濃度為15 mmol/L時，熒光強度下降34.8%。這可能是由于羥自由基使可溶性核桃蛋白的三級結(jié)構(gòu)展開，色氨酸殘基被氧化為犬尿氨酸，從核桃蛋白分子的外部遷移至內(nèi)部，從而降低其內(nèi)源熒光強度。此外，經(jīng)羥自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的最大熒光峰位由原來的328.9 nm藍移到325.6 nm，這與李玲等[23]和LI等[24]的研究結(jié)果類似，說明經(jīng)羥自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的色氨酸殘基暴露于疏水環(huán)境中，且暴露出來的疏水基團通過相互作用形成聚集體[5]。

圖3 HRO對核桃蛋白內(nèi)源熒光強度的影響Fig.3 Effect of HRO on endogenous fluorescence intensity of WP

圖4 HRO對核桃蛋白最大發(fā)射波長的影響Fig.4 Effect of HRO on maximum emission wavelength of WP

2.4 核桃蛋白平均粒徑的變化情況

動態(tài)光散射可監(jiān)測蛋白質(zhì)的聚集情況。羥自由基氧化修飾對核桃蛋白平均粒徑的影響如圖5所示。隨著H2O2濃度的增大，核桃蛋白的平均粒徑逐漸增加，當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時，核桃蛋白的平均粒徑增大12.7%?？赡苁橇u自由基氧化使核桃蛋白分子的疏水基團暴露，在二硫鍵和次級鍵的作用下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生交聯(lián)，生成較大的蛋白質(zhì)聚集體，表現(xiàn)為核桃蛋白的平均粒徑增大。本研究的結(jié)果與王耀松等[25]的研究結(jié)果類似。

圖5 HRO對核桃蛋白平均粒徑的影響Fig.5 Effect of HRO on mean particle size of WP

2.5 核桃蛋白功能性質(zhì)的變化情況

羥自由基對核桃蛋白溶解度、持水性、持油性、起泡性質(zhì)和乳化性質(zhì)的影響如表1所示。核桃蛋白的溶解性與其粒徑大小有一定關(guān)系，可用于表征蛋白質(zhì)交聯(lián)及聚集的程度。因此溶解度也可作為核桃蛋白氧化程度的一個指標。隨著H2O2濃度的增加，核桃蛋白的溶解度呈下降趨勢，在H2O2濃度為15 mmol/L時最小，相比對照組下降了45.6%。這可能是在羥自由基的氧化作用下，核桃蛋白的構(gòu)象被破壞，一些疏水基團暴露，進一步發(fā)生聚合形成不可溶性大分子聚集體[26]，該結(jié)果也驗證了本研究中核桃蛋白平均粒徑隨氧化濃度增大的結(jié)果。

如表1所示，羥自由基氧化可不同程度地增大核桃蛋白的持水性和持油性。其中持水性在H2O2濃度為15 mmol/L時最大，相比對照組增大136.6%；持油性在H2O2濃度為0.1 mmol/L時最大，相比對照組增大146.0%?？赡苁且驗檠趸购颂业鞍滓徊糠质杷鶊F顯露，且?guī)€基被氧化成二硫鍵發(fā)生交聯(lián)，形成大分子蛋白聚集體，導(dǎo)致核桃蛋白的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與水或油的接觸面積增加，能夠吸收更多的水或油。此外，持水性和持油性還與核桃蛋白分子的聚集情況有關(guān)。這與大豆蛋白經(jīng)氧化后持水性和持油性增大的結(jié)果相似[27]。

表1 HRO對核桃蛋白加工性質(zhì)的影響Table 1 Effect of HRO on functional properties of WP

從表1可知，隨著H2O2濃度的逐漸增大，核桃蛋白的EAI和ESI呈先上升后下降的趨勢。EAI和ESI分別在H2O2濃度為10 mmol/L和1 mmol/L時最大，增幅分別為108.8%和53.4%，這是因為核桃蛋白的粒徑、溶解度、分子柔性等方面均可影響其乳化性能。經(jīng)低濃度H2O2氧化后，核桃蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其內(nèi)部疏水基團暴露，且氧化提高了核桃蛋白的分子柔韌性，更容易結(jié)合到油-水界面，形成更穩(wěn)定的蛋白膜。這與盧巖[10]報道的適度氧化可增加大豆蛋白乳液穩(wěn)定性的結(jié)果類似。而當(dāng)氧化程度較高時(>10 mmol/L)，由于核桃蛋白的聚集、絮凝等作用，使其溶解性和分子柔性變小，從而表現(xiàn)為乳化性能的降低。

如表1所示，核桃蛋白經(jīng)羥自由基氧化后，起泡性呈先上升后下降的趨勢，在H2O2濃度為1 mmol/L時最大，相比對照樣增大42.6%。這是因為在羥自由基氧化過程中，適宜的H2O2濃度可使維持核桃蛋白結(jié)構(gòu)的非共價鍵展開，導(dǎo)致核桃蛋白的柔韌性增強，從而可更快地吸附聚合更多蛋白，同時核桃蛋白分子間相互作用逐漸變強，形成相對穩(wěn)定的核桃蛋白分子結(jié)構(gòu)和界面膜；而當(dāng)過度氧化時，核桃蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)充分展開，疏水基團暴露到一定程度則導(dǎo)致其起泡能力的下降。該結(jié)果與LI等[11]和孫領(lǐng)鴿等[27]的研究結(jié)果類似。

2.6 核桃蛋白微觀形貌的變化情況

核桃蛋白經(jīng)羥自由基氧化的電鏡掃描結(jié)果如圖6所示。相比對照樣，經(jīng)0.1 mmol/L H2O2氧化后，核桃蛋白分子聚集變得更緊實；而當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時，核桃蛋白分子聚集為較大尺寸的形狀，表面孔隙率增加且分布不均勻，呈現(xiàn)類似于“蜂窩”的結(jié)構(gòu)?？赡苁荋2O2氧化使核桃蛋白分子的內(nèi)部構(gòu)象伸展，巰基和疏水基團暴露，并發(fā)生相互作用，從而改變核桃蛋白分子的聚集情況。這與核桃蛋白經(jīng)氧化后的粒度增大和溶解度降低的結(jié)果相對應(yīng)。同時，豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)氧化后的微觀形貌也顯示相似的結(jié)果[28]。

a-對照；b-0.1 mmol/L H2O2；c-15 mmol/L H2O2圖6 核桃蛋白的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of walnut protein

3 結(jié)論

本研究通過建立羥自由基氧化體系，分析其對核桃蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響。隨著氧化體系中H2O2濃度的增加，核桃蛋白的總巰基、游離巰基、溶解性和內(nèi)源熒光強度呈逐漸降低的趨勢；羰基、平均粒徑、起泡穩(wěn)定性和持水性呈逐漸上升的趨勢；乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和持油性呈先上升后下降的趨勢；核桃蛋白經(jīng)羥自由基氧化后的微觀結(jié)構(gòu)呈聚集狀態(tài)，孔隙率提高。羥自由基氧化對核桃蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有較大影響，適度氧化可改善其乳化性能和起泡性能。