紅球菌染料脫色過氧化物酶的異源表達及活性分析

皮倩，夏榮，唐蕾,*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

血紅素過氧化物酶屬于氧化還原酶類，通常使用過氧化氫作為電子受體催化底物的氧化[1]，這類酶需要結(jié)合血紅素作為輔基以全酶的形式才具有活性。染料脫色過氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase，DyP)屬于血紅素過氧化物酶超家族中新的一類，基因組分析顯示，DyP廣泛存在于真菌和細菌中，與植物來源的血紅素過氧化物酶類似,需要結(jié)合血紅素輔因子形成全酶[2]。然而結(jié)構(gòu)分析表明，DyP具有類似于亞氯酸鹽歧化酶的鐵氧還原蛋白折疊，因此屬于與植物型過氧化物酶不同的超家族[3]。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析可將DyP分為4個亞科(A～D)：A類酶含有Tat依賴的信號序列，表明其參與胞質(zhì)外或細胞外的生理活動[4-6]；B類和C類被推定為胞質(zhì)酶，參與細胞內(nèi)代謝[7]；D類主要包含真菌變體，具體功能還需進一步研究[8]。本研究使用的DyP(RhDypB)來自紅球菌(Rhodococcusjostii)，該酶在Mn2+存在下活性有所提高[9]，并且能夠催化木質(zhì)素模型分子的β-芳基醚的Cα—Cβ鍵的裂解[10]。為了更好地發(fā)揮DyP在工業(yè)中的應(yīng)用價值，通常采用基因工程的方法生產(chǎn)DyP重組蛋白。大腸桿菌由于其繁殖快、成本低、操作簡便、可大規(guī)模高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點是最常用的表達宿主之一。

大腸桿菌通常以C5途徑合成血紅素[12]。關(guān)于重組血紅蛋白最新研究表明，血紅素輔因子的充足供應(yīng)是血紅蛋白形成的重要因素，血紅素摻入到蛋白形成全酶對后續(xù)酶的溶解度及活性至關(guān)重要[13]。通常對大腸桿菌血紅素生物合成的調(diào)節(jié)是生產(chǎn)重組血紅素蛋白的最主要因素[14]。例如，顧鵬帥等[15]將來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)的染料脫色過氧化物酶基因(TfuDyP)與大腸桿菌(EscherichiacoliBL21)谷氨酰-tRNA還原酶基因(hemA)共表達，使酶活性提高了110%；RAMZI等[16]將來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的DyP與來自鼠傷寒沙門氏菌LT2(SalmonellatyphimuriumLT2)的hemA和來自E.coliBL21的hemL共表達使酶活性由39.0 U/mg增加至66.7 U/mg；朱竹兵等[17]在重組TfuDyP發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯高鐵血紅素、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)、谷氨酸、FeCl2發(fā)現(xiàn)均可提高酶活性，5-ALA添加量為400 μmol/L，酶活性最大達到65 U/L。目前DyP的晶體結(jié)構(gòu)有些已被解析出來，越來越多來自不同菌株的染料脫色過氧化物酶基因被克隆出來，在大腸桿菌中表達，性質(zhì)也被表征，同時該酶在處理染料廢水、造紙工業(yè)紙漿漂白以及農(nóng)業(yè)小麥秸稈的水解方面具有較好的潛能，雖然已經(jīng)有許多關(guān)于染料脫色過氧化物酶的研究，但是該酶的生理作用還尚不明確。

目前關(guān)于來自細菌紅球菌DypB的研究是比較具體和深入的，有研究表明用丙氨酸代替第246位的天冬酰胺，該酶的催化活性有所提高，氧化Mn2+的Kcat和Kcat/Km值分別提高80和15倍[9]，因此，本研究以第246位的天冬酰胺被丙氨酸替代后的DypB基因序列來克隆重組，pET-24b (+)為載體，將RhDypB基因在E.coliBL21(DE3)中進行了異源表達，并比較了外源添加5-ALA和內(nèi)源過表達5-ALA合成關(guān)鍵酶基因hemA對胞內(nèi)血紅素濃度以及RhDypB活性的影響，揭示了重組血紅素蛋白的可行性，同時為該酶進一步的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實驗中所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑和儀器

ABTS，Sigma 公司；活性藍19(reactive blue 19，RB19)，國藥集團；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate,Kan)，上海生工；質(zhì)粒提取、純化試劑盒，Bradford Protein Assay Kit，TaKaRa公司；5-氨基乙酰丙酸，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；AKTA avant 25蛋白純化儀，美國GE公司；蛋白電泳儀、凝膠成像儀，Bio-Rad公司；多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.2 方法 所有新生兒黃疸患兒均給予基礎(chǔ)治療，包括補充能量、補充體液、補充礦物質(zhì)和維生素；單面藍光照射，為避免照射對皮膚造成傷害，需要在進行12 h的照射后停歇12 h再繼續(xù)，患兒每天需要口服苯巴比妥片劑，劑量為1次/d，若患兒出現(xiàn)膽紅素上升過快的情況，則需要給患兒補充劑量為1 g·kg-1的白蛋白。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0。

TB液體培養(yǎng)基：酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，甘油8 mL/L，K2HPO49.4 g/L，KH2PO42.2 g/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

RhDypB(NCBI accession number MH292860)的全長核酸序列由南京金斯瑞有限公司優(yōu)化并合成，并將其插入對應(yīng)于NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)限制性酶切位點的質(zhì)粒pET-24b(+)，得到重組質(zhì)粒(pDypB)，將載體上的6個密碼子(編碼6個組氨酸)與RhDypB基因的3′-末端融合以進行后續(xù)純化。hemA基因利用NCBI 上已公開的序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)設(shè)計引物：hemAFGGATAACAATTCCCCTCTAGAATGACCCTTTTAGTAGCACTCGGTATC和hemARTTAAACAAAATTATTTCTAGACT-ACTCCAGCCCGAGGCTG進行PCR，使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit，將PCR純化后產(chǎn)物與XbaI酶切后的線性化載體，按照說明書上的操作步驟進行連接，得到重組質(zhì)粒(pHemA-DypB)(圖1)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，挑取卡那霉素抗性平板上的單菌落，經(jīng) LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并取適量菌液提取質(zhì)粒進行酶切驗證和基因測序(天霖生物科技無錫有限公司)。引物中的酶切位點用下劃線標出，斜體表示同源序列。

a-重組質(zhì)粒pDypB；b-重組質(zhì)粒pHemA-DypB圖1 重組質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmids

1.2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

將重組質(zhì)粒pDypB和pHemA-DyPB分別轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取卡那霉素抗性平板上的單菌落，菌落PCR驗證正確后，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以4%接種量接種于含有50 mg/L Kan的TB液體培養(yǎng)基中。當OD600達到1.0時，在培養(yǎng)基中添加0.25 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，在20 ℃下培養(yǎng)18 h后，離心收集菌體，將菌體懸浮在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，超聲破碎后，以8 000 r/min離心30 min收集上清液，用0.22 μm膜過濾，得到RhDypB的粗酶液。

1.2.3 染料脫色過氧化物酶的純化

使用HisTrap HP 鎳柱親和層析純化粗酶液，用含20 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)平衡后上樣，然后用含500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)進行線性洗脫。根據(jù)洗脫曲線，收集與洗脫峰相對應(yīng)的酶溶液，使用12% SDS-PAGE對酶液中的蛋白進行定性分析。

1.2.4 染料脫色過氧化物酶的光譜分析

利用熒光法分析重組菌株的胞內(nèi)血紅素濃度[14]。

通過多功能酶標儀分析所純化的酶在280～700 nm的吸收光譜，RhDypB在408 nm處有特征吸收峰，用A408/A280值來表征酶與血紅素的結(jié)合程度。

1.2.5 染料脫色過氧化物酶活性檢測

酶活性利用ABTS來檢測，反應(yīng)體系包括1 mmol/L ABTS，6 mmol/L MnCl2以及50 mmol/L丙二酸鈉緩沖液 (pH 5.0)，2 μL酶液在25 ℃溫育5 min后，加入1 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，反應(yīng)5 min后加入200 μL SDS終止反應(yīng)。利用紫外分光光度計檢測420 nm(ε=36 000 M-1cm-1)處的吸光值變化。1個酶活力單位定義為在25 ℃、pH 5.0 條件下，氧化1 μmol/L ABTS 所需要的酶量。蛋白質(zhì)濃度測定采用Bradford Protein Assay Kit試劑盒，對RhDypB蛋白濃度進行測定。比酶活性計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 染料脫色過氧化物酶對染料脫色率的測定

通過檢測在300～700 nm處的染料光譜吸收，確定RB19的最大吸收波長為620 nm, 為了評估酶處理的效率，建立了3 mL反應(yīng)體系包括0.1 mmol/L RB19，6 mmol/L MnCl2，0.2 mmol/L H2O2, 50 mmol/L醋酸緩沖液 (pH 4.0),10 μL RhDypB，在25 ℃處理24 h后檢測RB19在620 nm處的吸光度，利用染料的脫色率來反映染料的脫色情況，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為對照組吸光值，Ai為酶處理24 h后吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 pDypB重組菌株的構(gòu)建

將全長1 077 bp的目的基因RhDypB與載體pET-24b (+)連接得到重組質(zhì)粒pDypB，用NdeI與XhoI雙酶切并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證(圖2-a),雙酶切驗證得到2條條帶，分別為pET-24b (+)載體5 303 bp和RhDypB1 077 bp，由天霖生物科技無錫有限公司測序，結(jié)果正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pDypB。

2.1.2hemA與RhDypB共表達菌株的構(gòu)建

在大腸桿菌中，hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶催化谷氨酰-tRNA生成谷氨酰-1-半醛，該步驟會受到終產(chǎn)物血紅素的反饋抑制，是細菌血紅素合成中的限速步驟之一[18]，因此考慮將大腸桿菌的hemA基因與RhDypB共表達。以NCBI上獲得的E.coliBL21 基因組序列，利用XbaI酶切位點設(shè)計與載體具有同源序列的特異性引物，利用PCR擴增將hemA與pET-DypB進行連接，并進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖2-b所示。載體連接后進行酶切驗證得到2條條帶，分別為pET-DypB 6 302 bp和hemA1 257 bp，由天霖生物科技無錫有限公司測序，結(jié)果正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pHemA-DypB。

M-Marker;1-重組質(zhì)粒pDypB酶切驗證；2～3-重組質(zhì)粒pHemA-DypB酶切驗證圖2 重組質(zhì)粒構(gòu)建的凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis for recombinant plasmid

2.2 RhDypB的表達與純化

將含有全長1 077 bpRhDypB的pET24b-DypB在E.coliBL21 中進行異源表達，經(jīng) IPTG在20 ℃誘導(dǎo)18 h，收集菌體，超聲破碎后離心收集上清液，得到粗酶液，利用鎳柱親和層析，純化后用SDS-PAGE對蛋白進行分析，結(jié)果如圖3所示，在40 kDa處有明顯的目的條帶，與理論計算結(jié)果一致。以上結(jié)果表明重組表達載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中成功表達了染料脫色過氧化物酶基因。同時對蛋白濃度進行測定，純化后蛋白質(zhì)量濃度可達到100 mg/L。

插圖為收集液的 SDS-PAGE分析；M-蛋白Marker；A1～A4-收集的洗脫峰樣品圖3 DypB的色譜純化Fig.3 DypB purification by chromatography

2.3 重組菌株胞內(nèi)血紅素濃度測定

染料脫色過氧化物酶需要結(jié)合血紅素輔因子成為全酶，才具有催化活性，因此大腸桿菌胞內(nèi)血紅素濃度對酶活影響至關(guān)重要。血紅素濃度測定結(jié)果如圖4所示，單獨過表達RhDypB菌株pDypB血紅素濃度1.5 μmol/L，而共表達的pHemA-DyPB重組菌株血紅素濃度為2.4 μmol/L，相比于單獨表達RhDypB的菌株血紅素濃度增加了約1.6倍，在菌株pDypB培養(yǎng)基中添加400 μmol/L 5-ALA后，血紅素濃度增加至8.9 μmol/L，與未添加5-ALA的pDypB菌株相比增加了6倍，說明5-ALA的添加有利于血紅素的合成。

圖4 重組大腸桿菌胞內(nèi)血紅素含量Fig.4 Intracellular heme concentration in recombinant E.coli

2.4 RhDypB的光譜分析

重組血紅蛋白的血紅素和蛋白質(zhì)含量分別在408 nm(Soret峰)和280 nm處表示[6]。此外，Rz(Reinheit Zahl)值確定為A408/A280值[3]，以進一步表征血紅素在重組RhDypB中的摻入。將純化后的RhDypB進行光譜掃描，結(jié)果如圖5所示，所有重組RhDypB均在A408處顯示1個Soret峰，說明均有一定的血紅素摻入到RhDypB中。單獨表達的RhDypB菌株Rz值為0.15，pHemA-DyPB共表達重組菌株的Rz值約為0.31，可知將hemA與RhDypB共表達加強了血紅素與RhDypB的結(jié)合。此外，添加5-ALA后Rz值提高至0.37，根據(jù)圖4的結(jié)果，說明5-ALA的添加增加了血紅素的濃度，從而使RhDypB與血紅素結(jié)合度增加，與文獻[15]報道結(jié)果一致。

圖5 RhDypB的吸收光譜Fig.5 UV-Vis spectrum of recombinant RhDypB

2.5 RhDypB的過氧化物酶活性測定

RhDypB酶活性測定結(jié)果如圖6所示，共表達hemA后的菌株酶活性為3.24 U/mg，與pDypB菌株(1.68 U/mg)相比約提高了93%，pHemA-DypB菌株酶活性的提高可能是由于hemA基因的過表達，增加了血紅素與酶的結(jié)合度，繼而增加了酶對ABTS的氧化活性。與文獻[16]共表達血紅素合成途徑中的2個基因hemA與hemL相比，本研究共表達hemA基因后達到了相同的效果，即酶活性均得到約2倍的提高。添加5-ALA的菌株顯示出最高的過氧化物酶活性為3.40 U/mg，與pDypB菌株(1.68 U/mg)相比提高了約102%，說明5-ALA的添加促進了血紅素的合成，使RhDypB能夠結(jié)合更多血紅素形成全酶的形式，從而提高了酶活性。

圖6 不同重組菌株的RhDypB酶活性Fig.6 RhDypB enzyme activity of different recombinant strains

2.6 RhDypB對RB19脫色率測定

為了更好的表征過氧化物酶的活性，本研究測定了RhDypB對RB19的脫色情況，結(jié)果如圖7所示，RhDypB處理24 h后能有效的降解RB19，添加5-ALA 以及共表達hemA的菌株的脫色效果相近，曲線幾乎重合，脫色率分別為53%、51%，約是pDypB菌株(25%)的2倍。脫色效率與酶活性高低呈正相關(guān)，與RAMZI等[16]的研究結(jié)果一致。

a-吸收光譜；b-脫色率圖7 RhDypB對染料RB19脫色的吸收光譜與脫色率Fig.7 Spectrum of RB19 absorption and decolorization rate by RhDypB

3 結(jié)論

目前DyP已經(jīng)在染料脫色以及木質(zhì)素降解方面展現(xiàn)出良好的潛力[9, 19-21]。酶活性的高低仍然是后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)中一個重要因素。在本研究中，將來自紅球菌的DypB成功地在大腸桿菌中表達，并且通過共表達血紅素合成途徑關(guān)鍵基因hemA，以及外源添加5-ALA的方式均使酶活有所提高，且利用共表達的方式與外源添加5-ALA效果相近，考慮到成本問題，利用代謝工程策略在生產(chǎn)應(yīng)用中更經(jīng)濟有效，同時在處理蒽醌染料RB19時，脫色率達到了53%，揭示了代謝工程策略的可行性，為今后酶的催化活性以及生產(chǎn)應(yīng)用的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。