調(diào)控質(zhì)膜穩(wěn)態(tài)提高枯草芽孢桿菌積累四烯甲萘醌MK-4

原攀紅，呂雪芹，劉延峰，李江華，劉龍，堵國(guó)成*

1(江南大學(xué)，未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122)2 (糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)) 江蘇 無錫，214122)

甲基萘醌類是一類廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的化合物，在孢子形成、氧化磷酸化和電子傳遞等方面起著重要的作用[1]。甲基萘醌類又被稱為維生素K2[2]，它們是維生素K依賴蛋白谷氨酸殘基翻譯后轉(zhuǎn)化的重要輔助因子。目前，存在有14種menaquinone-n(MK-n)，其中n為側(cè)鏈上的異戊二烯單位數(shù)，這條尾巴的長(zhǎng)度因微生物的不同而不同[3]。MK-4在凝血、預(yù)防骨質(zhì)疏松、緩解心血管鈣化、預(yù)防糖尿病和抑制炎癥[4-5]等方面具有重要作用。

MK-4的合成方法包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)MK-4具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)槿词綐?gòu)型的MK-4才具有生物活性[6]。微生物發(fā)酵法具有選擇性生產(chǎn)全反式異構(gòu)體的優(yōu)勢(shì)[7]。目前研究者已經(jīng)在野生型Bacillussubtilisnatto[8]、Flavobacteriumsp.238-7-K3-15[9]、Pichiapastoris[10]菌株中對(duì)MK-4的合成進(jìn)行研究。但是，這些菌株的代謝途徑復(fù)雜，改造相對(duì)困難。然而，B.subtilis168被普遍認(rèn)為是食品安全級(jí)模式菌株，且具有生長(zhǎng)速度快、遺傳特性良好等優(yōu)點(diǎn)，還具有合成生物學(xué)工具和專門的文庫[11-12]，因此，我們選擇B.subtilis168進(jìn)行代謝途徑的合成和調(diào)控。在前期研究中，我們通過采用模塊途徑工程策略提高了B.subtilis168中MK-4的產(chǎn)量，但由于代謝途徑固有的局限性，MK-4的產(chǎn)量仍然較低[13]?；谌后w感應(yīng)(quorum sensing,QS)的動(dòng)態(tài)調(diào)控已被廣泛應(yīng)用[14]，作為一種基本工具，在細(xì)胞密度變化的反應(yīng)中微調(diào)基因表達(dá)，而無需添加昂貴的誘導(dǎo)物[15]。采用PhrQ-RapQ-ComA QS系統(tǒng)來動(dòng)態(tài)控制枯草芽孢桿菌中MK-4的合成，提高M(jìn)K-4的產(chǎn)量[16]。目前，關(guān)于微生物發(fā)酵法主要通過基因工程手段激活或改善胞內(nèi)途徑基因的表達(dá)以強(qiáng)化MK-4的生產(chǎn)，有關(guān)質(zhì)膜穩(wěn)態(tài)調(diào)控的報(bào)道相對(duì)較少。微生物的質(zhì)膜起著保護(hù)屏障的作用，將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外環(huán)境分開。在工業(yè)發(fā)酵條件下，菌株的生存在很大程度上取決于膜穩(wěn)態(tài)，它涉及許多重要的生理功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗壓力、能量代謝、溶質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)[17]。因此，維持膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)是提高工業(yè)生物過程生產(chǎn)力的有效途徑。

工業(yè)發(fā)酵條件下，細(xì)胞面臨各種壓力條件，如pH值、極端溫度、氧化、滲透壓變化、溶劑和有毒代謝物[17]，會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響并限制代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。膜損傷經(jīng)常被認(rèn)為是這種應(yīng)力誘導(dǎo)的主要機(jī)制之一[18]。因此，本研究對(duì)B.subtilisBC04進(jìn)行細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)優(yōu)化，通過整合分析改善細(xì)胞膜的完整性相關(guān)基因srfAD、pssA、clsA、groESL、tagO、guaA和dacA，流動(dòng)性相關(guān)基因fabD、ypkP，滲透性相關(guān)基因fadR的缺失，提高M(jìn)K-4的積累。在此基礎(chǔ)上，在3 L發(fā)酵罐上分析MK-4的發(fā)酵過程，為進(jìn)一步提升工業(yè)水平MK-4發(fā)酵性能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

枯草芽孢桿菌B.subtilis168為本實(shí)驗(yàn)室保存，BC04是經(jīng)過基因改造獲得的高產(chǎn)菌株[13, 16]。質(zhì)粒pHT-XCR6和pcrF17 NM為本實(shí)驗(yàn)室保存[19]。

1.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pcrF17 NM為模板PCR擴(kuò)增載體獲得pcrF17 NM-crRNA，整合基因融合片段與載體,運(yùn)用一步克隆的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒[19]。所用引物如表1所示。

表1 本文使用的引物Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1

1.1.3 主要試劑

大豆蛋白胨、蛋白粉、酵母粉，Oxoid公司；MK-4標(biāo)品，Sigma-Aldrich公司；其他試劑來自國(guó)藥試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 10。加入15～20 g/L瓊脂制作固體培養(yǎng)基，于121 ℃ 下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 50，大豆蛋白胨 50，甘油50，KH2PO40.6。于115 ℃下滅菌20 min。

上罐發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：大豆蛋白胨 50，甘油50，KH2PO40.6，補(bǔ)料瓶中葡萄糖 500。于115 ℃下滅菌20 min。

1.1.5 儀器與設(shè)備

恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；722 s可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀，深圳西爾曼科技有限公司；3 L發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；安捷倫1260液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：挑取活化的單菌落于液體種子培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)好的種子液以10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在40 ℃，220 r/min的搖床上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到3 L發(fā)酵罐中，總裝液量為1.5 L，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量2 g/(L·h)，500 g/L葡萄糖溶液調(diào)節(jié)控制葡萄糖質(zhì)量濃度在4～10 g/L，40 ℃下培養(yǎng)。發(fā)酵過程中多次取樣測(cè)定菌株的發(fā)酵參數(shù)。

1.2.2 分析方法

取適當(dāng)體積的發(fā)酵液，加入2 mL萃取劑，萃取劑為V(2-丙醇)∶V(正丁烷)=1∶2[20]。加入去離子水將菌液稀釋至合適的倍數(shù)，測(cè)定OD600值。細(xì)胞干重(dry cell weight,DCW)與吸光度之間的關(guān)系為DCW=0.35×OD600；利用葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定；利用高效液相色譜對(duì)MK-4含量進(jìn)行檢測(cè)分析。其色譜檢測(cè)條件為：有機(jī)酸柱型號(hào)為C18ODS column (5 μm，250 mm×4.6 mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫箱溫度為40 ℃，進(jìn)液量為10 μL，流速為1 mL/min，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=9∶1，吸取萃取上清液用于樣品分析；采用Graph Pad Prism 8對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，統(tǒng)計(jì)顯著性表示如下，*為P<0.05,**為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 增強(qiáng)細(xì)胞膜的完整性對(duì)MK-4合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

膜完整性的喪失與生存能力的降低有關(guān)，它可以作為一個(gè)標(biāo)記區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞[21]。膜的完整性受飽和、不飽和脂?；湵壤齕22]、磷脂頭基團(tuán)的分布、麥角甾醇和鞘脂含量、膜蛋白的活性等因素的影響[23]。因此，膜的完整性的提高可通過膜脂組成、膜蛋白、脅迫耐受性等方面采取措施。由于合成MK-4發(fā)酵周期長(zhǎng)，細(xì)胞容易裂解，因此加強(qiáng)細(xì)胞膜完整性相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)MK-4的合成尤為重要[24-25]。膜蛋白相關(guān)基因srfAD，膜脂質(zhì)相關(guān)基因pssA和clsA，細(xì)胞抵抗不良外界環(huán)境的相關(guān)基因groESL、tagO、guaA和dacA，加強(qiáng)這些基因的表達(dá)(圖1-a)，并通過HPLC對(duì)菌株BF01～BF07的MK-4產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，分析比較MK-4生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量變化。

由圖1-b可知，7株不同菌株BF01～BF07的MK-4最終產(chǎn)量有所差異。其中，BF01的MK-4產(chǎn)量相對(duì)最高，達(dá)到(203.11±3.23) mg/L，MK-4生產(chǎn)強(qiáng)度為1.21 mg/(L·h)(表2)。說明膜蛋白相關(guān)基因srfAD對(duì)于膜的完整性和MK-4的合成有一定的影響。膜蛋白包括轉(zhuǎn)運(yùn)、通道、受體、酶和結(jié)構(gòu)域-錨定域等蛋白，參與積累和傳遞能量，膜蛋白的表達(dá)可以增強(qiáng)膜的完整性[26]。因此，膜蛋白SrfAD的表達(dá)有助于加強(qiáng)膜的完整性和強(qiáng)化MK-4的生產(chǎn)。

a-整合基因獲得對(duì)應(yīng)的菌株BF01～BF07；b-菌株BF01～BF07的MK-4產(chǎn)量的變化圖1 膜完整性相關(guān)基因的整合及對(duì)MK-4產(chǎn)量的影響Fig.1 Integration of membrane integrity-related genes and its effect on MK-4 production

表2 不同菌株發(fā)酵參數(shù)的對(duì)比Table 2 Comparison of fermentation parameters of different strains

2.2 增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性對(duì)MK-4合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

微擾膜的流動(dòng)性是影響工業(yè)菌株生存能力的一個(gè)常見問題和挑戰(zhàn)[27]。膜流動(dòng)性是由膜上直鏈不飽和脂肪酸的長(zhǎng)度和程度決定，因此，調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性可通過調(diào)節(jié)直鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)、鞘脂和甾醇含量、非直鏈脂肪酸的合成?；騠abD的表達(dá)可以調(diào)節(jié)脂肪酸鏈的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)膜脂?；湹拈L(zhǎng)度?；騳pkP的表達(dá)可以上調(diào)膜鞘脂含量，以適應(yīng)不良環(huán)境。如圖2-a所示，分別加強(qiáng)這2個(gè)基因的表達(dá)，并通過HPLC對(duì)菌株MK-4的最終產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，分析BF08和BF09菌株產(chǎn)量的變化。

由圖2-b可知，在以上2株不同菌株中，MK-4最終產(chǎn)量有所差異。BF08的MK-4產(chǎn)量達(dá)到(197.23±1.26) mg/L，MK-4生產(chǎn)強(qiáng)度為1.17 mg/(L·h)。BF09的MK-4產(chǎn)量相對(duì)最高，達(dá)到(200.85±1.6) mg/L，MK-4生產(chǎn)強(qiáng)度為1.19 mg/(L·h)。因此，基因fabD和ypkP的表達(dá)，有利于MK-4產(chǎn)量的積累，且基因ypkP的表達(dá)更有利于MK-4產(chǎn)量的提高。

a-整合基因獲得對(duì)應(yīng)的菌株BF08～BF09；b-菌株BF08～BF09的MK-4產(chǎn)量的變化圖2 膜流動(dòng)性相關(guān)基因的整合及對(duì)MK-4產(chǎn)量的影響Fig.2 Integration of membrane fluidity-related genes and its effect on MK-4 production

2.3 調(diào)節(jié)膜的滲透性對(duì)MK-4合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

調(diào)節(jié)膜的滲透性包括調(diào)節(jié)離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)的跨膜[28]。微生物維持膜的滲透性通過膜脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，膜蛋白的作用，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量系統(tǒng)用于膜組裝和允許底物跨膜移動(dòng)。脂肪酸降解調(diào)節(jié)因子的缺失，可增加膜不飽和脂肪酸的含量，進(jìn)而使膜對(duì)有機(jī)溶劑滲透性下降，從而提高菌株的耐受性[29]。

基因fadR的缺失，可以使菌株耐溶性增強(qiáng)，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例提高[29]。由圖3可知，基因fadR缺失后，BF10菌株的產(chǎn)量上升，達(dá)到(183.35±1.66) mg/L，MK-4生產(chǎn)強(qiáng)度為1.09 mg/(L·h)。因此，調(diào)節(jié)B.subtilisBC04脂肪酸的比例，可實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的滲透性，促進(jìn)MK-4的產(chǎn)量的提高。

圖3 基因fadR對(duì)菌體MK-4產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of gene fadR on the MK-4 production

2.4 脂膜穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的組合對(duì)MK-4合成和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

近年來膜穩(wěn)態(tài)工程的發(fā)展表明，膜穩(wěn)態(tài)工程方法提高工業(yè)菌株的生理功能，是一種提高生產(chǎn)效率的有效方式。通過對(duì)上述影響B(tài).subtilis細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性和滲透性相關(guān)基因的分析，我們將上述較優(yōu)的特征進(jìn)行組合，如圖4所示，并通過發(fā)酵分析找出能合成MK-4 產(chǎn)物的最優(yōu)菌株。

圖4 基因組裝獲得對(duì)應(yīng)的菌株BF11～BF14Fig.4 The corresponding strains BF11～BF14 obtained by assembly of genes

由圖5可知，在以上4株不同菌株中，MK-4最終產(chǎn)量有所差異。其中，BF14的MK-4產(chǎn)量相對(duì)最高，達(dá)到(213.80±2.16) mg/L，MK-4生產(chǎn)強(qiáng)度為1.26 mg/(L·h)。因此，BF14可作為最優(yōu)菌株用于進(jìn)一步的分析。

圖5 基因的組裝對(duì)菌體MK-4產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of gene assembly on the MK-4 production注：**表示差異極顯著(P<0.01)

2.5 重組枯草芽孢桿菌的3 L罐連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵

在搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將工程菌株BF14在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。由圖6-a可知，在發(fā)酵第1天，發(fā)酵液中檢測(cè)到MK-4，且上清液中MK-4的含量高于細(xì)胞內(nèi)的含量。在分批補(bǔ)料培養(yǎng)條件下，葡萄糖質(zhì)量濃度控制在4～10 g/L，培養(yǎng)第2天和第4 天分別在發(fā)酵罐中添加1%(體積分?jǐn)?shù))甘油和2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大豆蛋白胨。細(xì)胞培養(yǎng)30 h時(shí)密度達(dá)到29.5(OD600)，之后下降。在pH自然狀態(tài)下，第5天MK-4的最大產(chǎn)量達(dá)到(249.65±2.34) mg/L(圖6-b)，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2.08 mg/(L·h)。上述結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度控制的補(bǔ)料分批培養(yǎng)有利于菌株BF14生產(chǎn)MK-4，為MK-4的規(guī)?；a(chǎn)提供了依據(jù)。

a-3 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程圖；b-MK-4產(chǎn)量分析圖圖6 BF14在3 L罐中補(bǔ)料分批發(fā)酵Fig.6 Batch fermentation of BF14 in 3 L fermentor

3 結(jié)論

MK-4作為一種重要的維生素，廣泛應(yīng)用于制藥、日化、食品以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[5]。目前主要通過基因工程手段改善細(xì)胞中分支代謝途徑、群體響應(yīng)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成，有關(guān)脂膜穩(wěn)態(tài)的優(yōu)化與控制的報(bào)道相對(duì)較少。本文從細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)方面進(jìn)行分析，首先分析了細(xì)胞膜的完整性，包括膜蛋白相關(guān)基因srfAD，膜脂質(zhì)相關(guān)基因pssA和clsA，細(xì)胞抵抗不良外界環(huán)境的相關(guān)基因groESL、tagO、tuaA和dacA。加強(qiáng)這些基因的表達(dá)，搖瓶水平發(fā)酵7 d MK-4最高產(chǎn)量為(203.11±3.23) mg/L。膜流動(dòng)性相關(guān)基因ypkP的表達(dá)上調(diào)膜鞘脂含量，MK-4產(chǎn)量達(dá)到(200.85±1.6) mg/L。調(diào)控脂質(zhì)介導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子fadR的缺失，提高了菌株MK-4的產(chǎn)量，達(dá)到(183.35±1.66) mg/L。較未優(yōu)化前分別提高了13.53%、12.27%和2.49%。通過組合優(yōu)化，MK-4最高產(chǎn)量為(213.80±2.16) mg/L，較BC04提高了19.51%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵并對(duì)過程中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了分析。維持葡萄糖質(zhì)量濃度為4～10 g/L，最終MK-4產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到(249.65±2.34) mg/L、2.08 mg/(L·h)。已有的研究表明，枯草芽孢桿菌有害物質(zhì)的積累是影響MK-4代謝合成的原因之一。近年來，關(guān)于CRISPRI的基因編輯方法日趨成熟[30]。在后續(xù)研究中，通過建立CRISPRI系統(tǒng)并弱化潛在的代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達(dá)，有望進(jìn)一步提升MK-4積累水平。本研究相關(guān)脂膜優(yōu)化與補(bǔ)料策略為利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)MK-4的放大實(shí)驗(yàn)提供了理論與技術(shù)參考。