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    高山松miR482a的鑒定及其表達分析

    2021-10-09 07:33:16王穩(wěn)利曾倩倩邱宗波
    湖北農業(yè)科學 2021年17期
    關鍵詞:前體高通量高山

    王穩(wěn)利,曾倩倩,劉 巖,邱宗波

    (河南師范大學生命科學學院/河南省農業(yè)微生物生態(tài)與技術國際聯(lián)合實驗室,河南 新鄉(xiāng) 453007)

    MicroRNA(miRNA)是一類由21~24個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼小分子RNA,主要是在轉錄和轉錄后水平指導靶miRNA的剪切或抑制翻譯來調控基因的表達[1],作為近年來一直研究的熱點調控分子,miRNAs在調控高山松(Pinusdensata)的生長發(fā)育[2]、落葉松的體胚發(fā)育[3]以及生物和非生物脅迫應答過程中起著重要的作用[4]。

    miR482作為植物體內一類重要的miRNA,近年來一直受到研究者們的廣泛關注。利用生物信息學技術,張玉娟等[5]從棉花中鑒定出miR395a、miR396a、miR397a、miR399a、miR414a、miR482b、miR7485等64個與棉花黃萎病抗性相關的miRNA,并對獲得的miRNA進行靶基因預測和功能分析。過表達馬鈴薯miR482e能夠增強植物對黃萎病菌的敏感性[6]。Zuo等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR482在番茄果實成熟軟化過程中顯示出不同的表達模式。利用高通量測序技術,Li等[8]從豌豆中鑒定出miR482,并發(fā)現(xiàn)miR482能夠明顯增加豌豆結莢數(shù)目。盡管miR482在多個植物中已有較為深入的研究,但目前在裸子植物高山松中,miR482的鑒定及其在高山松生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

    高山松是一種具有重要生態(tài)意義的針葉樹裸子植物[9]。本研究從課題組前期高山松小RNA高通量測序結果中獲得miR482a,并利用PCR技術進行miR482a前體序列的克隆與分析。通過在線預測網站獲得miR482a的靶基因,并利用RLM-5′RACE進行驗證。同時還對miR482a及其靶基因在高山松根、莖和針葉中的表達模式進行了分析,為進一步揭示miR482a在高山松生長發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    高山松幼苗于2020年9月在人工氣候室中進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為晝/夜溫度25℃/18℃,光周期16 h/8 h,相對濕度65%~70%。

    1.2 方法

    1.2.1 高山松miR482a前體序列的克隆及其二級結構預測 使用植物總RNA提取試劑盒RNAiso Plus Reagent(TaKaRa,大連)從高山松幼苗中提取高質量RNA。從課題組前期高山松miRNA高通量測序結果中得到高山松miR482a的前體序列:UGAGAAGU GAAGGGAUGUGUUUUGUGGAUGGGAGUCUUGAG GAGUGGGAGCAUAGGAUAAGGCUGCUUCAUAUC ACCAGUCUUUCCUACUCCUCCCAUUCCUAUUGCC UUCACCACACAUCCCUUCCCAA。用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR擴增(表1)。利用Clustalx 2.0軟件,將高山松pde-miR482a的成熟序列與玉米zma-miR482a、大豆gma-miR482a、火炬松pta-miR482a、毛果楊ptc-miR482a、歐洲云杉pabmiR482、葡萄vvi-miR482以及人參pgi-miR482的成熟序列進行序列比對。并利用MEGA 7.0軟件構建miR482a前體與其他物種miR482前體的系統(tǒng)進化樹。采用RNAfold web server在線軟件預測miR482a前體序列的二級結構。

    1.2.2 高山松miR482a靶基因的預測與切割位點驗證 高山松miR482a的成熟序列利用在線預測網站psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)進行靶基因的預測。在高山松的轉錄組數(shù)據(jù)庫中進行miR482a靶基因的預測,設置罰分小于3,其余參數(shù)為默認。依據(jù)靶基因的cDNA序列用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物(表1)。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等[10]的方法,將擴增出的特異產物進行克隆測序。

    1.2.3 實時熒光定量PCR 使用RNAiso Plus Reagent(TaKaRa,大連)分別提取高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。利用SuperscriptⅡreverse transcriptase(Invitrogen)進行反轉錄反應。熒光定量試驗使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa,大連)。高山松Actin作為miR482a和靶基因Unigenes45569的內參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測,每個樣品3次生物學重復?;虻南鄬Ρ磉_量采用2-ΔΔCt法[11],在根中的表達水平人為設成1。

    2 結果與分析

    2.1 pde-miR482a前體序列的擴增及二級結構的預測

    從前期高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR482a的前體序列,進行引物設計,以高山松基因組DNA為模板,進行PCR擴增,得到高山松miR482a的前體序列長為130 bp(圖1)。利用RNAfolder軟件在線分析其二級結構,發(fā)現(xiàn)高山松miR482a的前體序列能形成典型的莖環(huán)發(fā)夾結構(圖2),所預測的二級結構的最小折疊自由能(Mini?mal folding free energy,MFE)為-60.90 kcal/mol,最小折疊自由能指數(shù)(Minimal folding free energy index,MFEI)是0.98。miR482a的 成 熟 序 列 為5′-UCUU UCCUACUCCUCCCAUUC-3′,22 bp,位于前體序列的3′端莖結構上。

    表1 RT-PCR、RT-qPCR和RLM-5′RACE的引物

    2.2 高山松miR482a成熟序列和前體序列的分析

    對miRBase數(shù)據(jù)庫中不同植物的miR482a成熟序列與高山松miR482a(pde-miR482a)的成熟序列進行比對,發(fā)現(xiàn)除了葡萄vvi-miR482與pdemiR482a的成熟序列完全一致外,其他物種如歐洲云杉pab-miR482、人參pgi-miR482、火炬松ptamiR482a、毛 果楊ptc-miR482a、玉米zma-miR482a以及大豆gma-miR482a與高山松pde-miR482a的成熟序列有一個或多個堿基的差異(圖3),表明高山松pde-miR482a的成熟序列在不同物種中保守性不高。利用MEGA 7.0對毛果楊、玉米、人參、葡萄、火炬松、歐洲云杉、大豆、苜蓿和高山松的miR482共23個成員構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示不同物種的pre-miR482前體保守性不高(圖4),高山松與歐洲云杉的前體序列聚為一類,二者進化關系較近。

    2.3 高山松miR482a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證

    為了進一步了解高山松pde-miR482a的生物學功能,研究以高山松的轉錄組數(shù)據(jù)庫作為靶標,使用在線軟件psRNATarget預測高山松miR482的靶基因,共預測到2個靶基因,分別為組蛋白去乙?;福║nigenes7264)和NBS-LRR抗 性 蛋 白(Unigenes 45569),其中pde-miR482a與高山松NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569)匹配程度最高(表2)。

    為了進一步驗證高山松miR482a對潛在靶基因是否有剪切作用,利用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigenes45569mRNA的3′端剪切產物進行擴增。測序結果表明,高山松pde-miR482a對NBS-LRR抗性蛋白的剪切位點位于第10、第11個堿基之間(圖5),表明NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569)確實是miR482a的靶基因,miR482a可以在轉錄后水平調控NBS-LRR抗性蛋白基因的表達。

    表2 高山松miR482a靶基因及功能預測

    2.4 高山松pde-miR482a及其靶基因Unigenes 45569在不同組織中的表達分析

    通過qRT-PCR對pde-miR482a及其靶基因Unigenes45569在高山松根、莖和針葉中的表達情況進行分析,發(fā)現(xiàn)pde-miR482a和Unigenes45569在高山松不同組織的表達存在顯著差異,pde-miR482a在根中的表達量最高,其次在莖中,而靶基因Unige?nes45569在根中的表達量最低。靶基因Unige?nes45569的表達量與pde-miR482a的表達量呈負相關(圖6)。

    3 討論

    近年來,高通量測序技術的發(fā)展已在多個物種中被證實存在miR482。本研究對鑒定到的miR482前體基因Pre-miR482進行克隆,得到miR482a的前體序列長度為130 bp,可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結構,說明miR482a確實在高山松中存在并表達。采用熒光定量PCR技術對高山松pde-miR482a在根、莖和針葉中的表達量進行分析,發(fā)現(xiàn)在根、莖和針葉中均有表達,但在根中最高。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR482在大豆的種子、幼莢、根、莖、葉和花中也均有表達,但在莖中最高。miR482a在番茄的根、莖、葉中均有表達,但在葉中的表達最高[12]。高山松miR482a的靶基因Unigenes45569(NBS-LRR抗性蛋白)在根、莖和針葉中也有一定的表達,但在根中的表達最低,與pde-miR482a的表達模式呈負相關。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA與靶基因之間的表達模式為負相關。過表達和沉默miR482b的番茄植株中,Jiang等[13]發(fā)現(xiàn)miR482b和其靶基因表達水平之間存在負相關性。這些研究結果表明,miR482靶向NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569)可能參與了高山松生長發(fā)育的調控。

    自從在毛果楊中發(fā)現(xiàn)第一個miR482以來[14],研究者已從棉花[15]、馬鈴薯[6]、番茄[7]和豌豆[8]多個植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了miR482,并且在擬南芥、棉花和煙草等多種植物中證明miR482的靶基因是NBS-LRR基因[15]。而NBS-LRR編碼基因是抗病基因中的最大家族,在植物抵御非生物脅迫及病害防御過程中起著非常重要的作用[16]。棉花受黃萎病菌浸染時,miR482的表達下調,但其靶基因NBS-LRR抗性蛋白表達增加[15]。番茄miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白在番茄病害的防御和發(fā)生中起著重要的調控作用[16]。本研究中,利用RLM-5′RACE方法對預測的靶基因Unigenes45569(NBS-LRR抗性蛋白)進行驗證。結果顯示,高山松miR482介導靶基因Unige?nes45569(NBS-LRR抗性蛋白)的mRNA剪切降解,且剪切位點在第10和第11位堿基之間。利用5′RACE方法,Zhu等[15]在棉花中發(fā)現(xiàn)NBS-LRR抗性蛋白是miR482的靶基因,切割位點也在第10和11位堿基之間。這些結果表明,miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白(Unigenes45569),從而調控高山松的生長發(fā)育及抗病性。

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