健脾益氣口服液對小鼠小腸推進功能的影響及其作用機制分析

劉巧明，謝 勝，奉建芳，王力寧，陳雅璐，林國彪，黃曉燕，梁健欽

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

功能消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床常見的胃腸道疾病，發(fā)病率高達40%，且具有難治性、反復(fù)性和慢性遷延等特點［1，2］，影響患者生活質(zhì)量，臨床上對治療FD的藥物需求大。FD的致病機理仍未完全清楚［3］，中醫(yī)理論認為，F(xiàn)D是飲食不節(jié)與七情所傷導(dǎo)致，表現(xiàn)為脾胃虛弱、氣機不暢、運化功能失調(diào)［4］。健脾益氣口服液是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)臨床需要，對院內(nèi)制劑健脾益氣合劑按照中藥1.1類新藥要求開發(fā)得到的，由黨參、陳皮、黃芪、白術(shù)、雞內(nèi)金、浮小麥、制何首烏、麥冬組成，具有健脾、益氣的功效，臨床治療肺脾氣虛型消化不良療效良好，但其作用機制尚未清楚。本研究通過動物試驗考察健脾益氣口服液對小鼠小腸推進功能的影響，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析FD發(fā)病機理，通過分子對接挖掘健脾益氣口服液中活性成分及潛在有效靶點，預(yù)測健脾益氣口服液治療FD的作用機制，為闡明健脾益氣口服液治療FD以及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 健脾益氣口服液（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，規(guī)格：10 mL/支，批號：20180131），復(fù)方地芬諾酯片（安陽市華安藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：2.5 mg/片，批號：161016）。

1.1.2 儀器 JJ200型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），ST16R型臺式低溫離心機（Thermo公司），DW-HL388型-80℃超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）。

1.1.3 動物 KM小鼠60只，SPF級，雌雄各半，18～22 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK桂2014-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)，試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫25～28℃，相對濕度60%～80%，標準飼料飼養(yǎng)，自由飲用去離子水。

1.1.4 數(shù)據(jù)庫和軟件 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）、PubChem Compound數(shù) 據(jù) 庫（https：//pub?chem.ncbi.nlm.nih.gov/）、String數(shù)據(jù)庫（version 11.0，https：//string-db.org/）、Drugbank數(shù) 據(jù) 庫（version 5.1.1，https：//www.drugbank.ca/）、UniProt數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.uniprot.org/）、CNKI數(shù)據(jù)庫（http：//www.cnki.net）、Cytoscape（version 3.7.2）、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、Swiss數(shù) 據(jù) 庫（http：//old.swisstargetprediction.ch/）、Venn（version2.1.0，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/ven?ny/index.html）、Discovery Studio（2016版）、RCSB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 取小鼠，隨機分為空白組、模型組（生理鹽水，7.8 mL/kg）和健脾益氣口服液組（分為高、中、低、極低劑量組，給藥劑量分別是31.2、15.6、7.8、3.9 mL/kg，相應(yīng)地為人劑量的4.0、2.0、1.0、0.5倍），每組10只。灌胃給藥，每日1次，連續(xù)4周。

1.2.2 墨汁推進率的測定［5］試驗結(jié)束前各組小鼠禁食不禁水20 h后，藥物組灌胃再給予一次相應(yīng)的藥液，模型組、空白組給予生理鹽水。30 min后空白組給予生理鹽水，其余各組給予復(fù)方地芬諾酯溶液（取復(fù)方地芬諾酯片20片，用乳缽研磨后，加去離子水至100 mL）10 mL/kg，30 min后各組再給予指示劑（墨汁：稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，加入活性碳粉100 g，煮沸3次，冷卻后定容至1 000 mL），給藥25 min后脫頸椎處死小鼠，剖開腹腔，用鑷子不加牽引將腸管剝離，平鋪于墊有干凈白紙的手術(shù)臺上，測量小鼠腸總長度（幽門至回盲部）及墨水推進長度（幽門至墨水最前沿），按“墨汁推進率=［墨汁在小腸中的推進距離（cm）/小鼠腸總長度（cm）］×100%”計算墨汁推進百分率。

1.2.3 統(tǒng)計分析 計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)進行正態(tài)性和方差齊性檢驗符合方差齊性，采用t檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.4 化學(xué)成分篩選及其作用靶點分析 以“DANGSHEN（黨參）、HUANGQI（黃芪）、ZHIHESHOU?WU（制何首烏）、CHENPI（陳皮）、BAIZHU（白術(shù)）、MAIDONG（麥冬）、JINEIJIN（雞內(nèi)金）、FUXIAOMAI（浮小麥）”以及拉丁名為關(guān)鍵詞，通過BATMANTCM（參數(shù)設(shè)定：score>25、P<0.05，其他參數(shù)為默認值）數(shù)據(jù)庫、NCBI、CNKI數(shù)據(jù)庫檢索和篩選方中各藥材的化學(xué)成分。通過PubChem Compound數(shù)據(jù)庫檢索獲得化合物的3D結(jié)構(gòu)，并保存為mol格式文件，導(dǎo)入Swiss數(shù)據(jù)庫（選擇物種為“Homo sapiens”，“Probability”>0.5）預(yù)測化學(xué)成分的作用靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正靶點名稱，并以來源是人類為條件尋找靶點的基因名。去除重復(fù)的化學(xué)成分作用靶點后，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置參數(shù)（選擇“Multiple protein”，研究對象“Homo sapiens”，最低互作置信度為“medium confidence（0.4）”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無相互作用的靶點），進行靶點互作分析。

1.2.5 疾病靶點分析 以“functional dyspepsia”為關(guān)鍵詞，檢索TTD、Drugbank、GeneCards數(shù)據(jù)庫FD的疾病靶點，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫的靶點篩選條件設(shè)置為score值>10，其余的均為默認值。同法使用Uniprot數(shù)據(jù)庫校正靶點名稱，刪除重復(fù)靶點后，將疾病靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲取蛋白互作信息，并保存為TSV文件格式，導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖，挖掘與FD發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點。

1.2.6 GO、KEGG富集分析 靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作分析和GO、KEGG富集分析。

1.2.7 分子對接 從PDB數(shù)據(jù)庫下載對接蛋白的pdb格式文件。采用Discovery Studio 2016軟件中Receptor-Ligand Interactions模塊對靶點（受體）及化學(xué)成分（mol格式文件）分別進行預(yù)處理，包括去水、加氫、加力場、去除原配體等。以原配體的區(qū)域為對接位點，通過LibDock進行分子對接，參數(shù)設(shè)置為默認值。配體與受體的對接pose按Libdockscore排序，篩選出排名前3的pose，通過Calculate Binding Energies計算結(jié)合能（Binding Energy），按結(jié)合能大小排序。最后通過View Interactions可視化對接結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 健脾益氣口服液對小鼠小腸推進功能的影響

由表1所示，與空白組相比，模型組的墨汁推進率顯著降低，表明抑制小腸運動模型建立成功。與模型組相比，健脾益氣口服液高、中、低劑量組的小鼠小腸推進率顯著增加（P<0.01），推進率與劑量正相關(guān)。

表1 健脾益氣口服液對小鼠小腸推進的影響（±s，n=10）

表1 健脾益氣口服液對小鼠小腸推進的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，“Δ”表示P<0.05；與模型組比較，“**”表示P<0.01

組別空白組模型組健脾益氣口服液高劑量組健脾益氣口服液中劑量組健脾益氣口服液低劑量組健脾益氣口服液極低劑量組給藥劑量//mL/kg 10.0 31.2 15.6 7.8 3.9推進率//%67.42±8.66 54.68±9.74Δ 96.13±6.81**89.32±12.70**81.43±16.15**71.02±9.10**

2.2 化學(xué)成分及其作用靶點

共收集到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、槲皮素、谷甾醇、山奈酚、柚皮素、川陳皮素、黨參炔苷、芒柄花苷、薯蕷皂苷元、辛弗林、亞油酸、二苯乙烯苷、黃芪甲苷、甜菜堿、蒼術(shù)內(nèi)酯、橙皮苷等194個化合物及703個化學(xué)成分作用靶點。如圖1所示，黨參、陳皮對應(yīng)的作用靶點排前2位。對703個靶點進行富集分析，GO分析結(jié)果顯示，健脾益氣口服液參與小分子代謝、cGMP代謝、離子跨膜轉(zhuǎn)運、氮化合物反應(yīng)、激素水平調(diào)節(jié)、cAMP介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分解代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、磷酸核苷分解代謝、調(diào)節(jié)肽運輸、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)、前列素分泌、食欲調(diào)節(jié)等1 290個生物過程，以及影響膽汁酸、NO結(jié)合、cAMP介導(dǎo)環(huán)核苷酸磷酸二酯酶、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等472個分子功能，細胞成分富集在質(zhì)膜及其組成部分、突觸部分、神經(jīng)元、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等部位。由圖2所示，健脾益氣口服液介導(dǎo)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、代謝途徑、cAMP信號通路、多巴胺能突觸、cGMP-PKG信號通路、Ca2+信號通路、味覺轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路對機體發(fā)揮作用。

2.3 FD疾病靶點預(yù)測及發(fā)病機制的分析

共篩選得到601個FD疾病靶點。Degree值排名前30的靶點（括號中是該靶點的Degree值）分別為INS（312）、GAPDH（287）、TP53（286）、AKT1（285）、IL6（282）、ALB（280）、VEGFA（258）、TNF（250）、EGFR（249）、MYC（247）、EGF（237）、MAPK3（236）、STAT3（228）、SRC（218）、CASP3（211）、JUN（210）、IGF1（208）、MAPK1（207）、HRAS（204）、MAPK8（203）、CXCL8（201）、NOTCH1（197）、CCND1（194）、PTEN（194）、FOS（189）、ESR1（189）、IL10（188）、MMP9（183）、IL1B（182）、TLR4（180）。Degree值的大小體現(xiàn)靶點與疾病相關(guān)性［6］，以上提示，上述靶點及其所涉及的通路與FD疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系。進一步通過GO、KEGG分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D的發(fā)病過程涉及3 822個生物過程（主要有細胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、高分子代謝過程的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程、激酶活性的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控、對炎癥的反應(yīng)等）、399個分子功能（包括蛋白質(zhì)、酶、信號受體等的結(jié)合，跨膜受體蛋白酪氨酸激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、受體配體、激素等的活性）、265個細胞成分（富集在細胞表面及外區(qū)域、囊泡、質(zhì)膜、內(nèi)膜系統(tǒng)、受體復(fù)合體、細胞質(zhì)核周區(qū)域等部位），參與白介素信號、免疫系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導(dǎo)、受體酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胃泌素-CREB介導(dǎo)PKC-MAPK信號通路等595條信號途徑。其中，癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌信號通路、癌癥MicroRNA信號通路、乙型肝炎通路、內(nèi)分泌抵抗通路、結(jié)腸癌通路、MAPK信號通路、胰腺癌、胃癌等通路的異常與FD發(fā)病密切相關(guān)。

2.4 健脾益氣口服液干預(yù)FD機制

由圖3所示，疾病靶點與健脾益氣口服液靶點的共同靶點有104個（即核心靶點）。通過靶點網(wǎng)絡(luò)互作分析，獲得1個由104個節(jié)點、972條邊、平均節(jié)點度為18.7、網(wǎng)絡(luò)密度為0.57的網(wǎng)絡(luò)。通過GO和KEGG富集分析可知，核心靶點主要富集在多細胞生物過程的調(diào)控、對有機氮化合物的響應(yīng)、調(diào)節(jié)肽激素分泌、蛋白質(zhì)磷酸化及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控等1 438個生物過程，富集在細胞外圍、質(zhì)膜、神經(jīng)元、軸突、膜蛋白復(fù)合物等細胞組成，富集在受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、激素結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、磷酸酶結(jié)合、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶活性等166個分子功能，參與調(diào)控癌癥途徑、TNF信號通路、IL-17信號通路、cAMP信號通路、cGMP-PKG信號通路、Ca2+信號通路等171條信號通路。藥材-化學(xué)成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。

2.5 活性成分和作用靶點的虛擬篩選

Ca2+信號通路、cAMP信號通路異常均可導(dǎo)致胃腸道運動障礙［7］。因此，本文選擇cAMP信號通路、Ca2+信號通路的排名前2的靶點（即對接的受體）以及與Degree值排名前20的化合物（即對接配體）進行分子對接，受體與配體的結(jié)合能越小越穩(wěn)定，最終篩選活性化合物與作用靶點。靶點分別為FOS（PDB∶1FOS）、EGFR（PDB∶2GS2）、CREB1（PDB∶5ZK1）、NOS3（PDB∶3EAH）。從分子對接模擬圖（圖5）可以看出，化合物以常規(guī)氫鍵、碳氫鍵、疏水作用、范德華力等作用方式與各靶點中對接位點氨基酸作用。其中，F(xiàn)OS、EGFR、CREB1、NOS3與煙酸（Nicotin?ic Acid）的結(jié)合能分別為-137.32、-130.05、-112.09、-143.99 kcal/mol，與苯丙氨酸（Phenylalanine）的結(jié)合能分別為-156.65、-130.18、-134.91、-112.91 kcal/mol，能量較低，表明化合物與靶點穩(wěn)定結(jié)合。以上提示，煙酸和苯丙氨酸可能是與胃腸運動密切相關(guān)的活性成分，作用靶點極可能是FOS、EGFR、CREB1、NOS3。

3 小結(jié)與討論

從中醫(yī)角度辯證，F(xiàn)D與飲食不節(jié)、七情所傷有關(guān)，表現(xiàn)為脾胃虛弱、氣機不暢、運化功能失調(diào)［4］。陳皮是理氣、健脾之要藥，能疏理氣機健脾胃，黨參則可補中、益氣、健脾，兩者相合具有補脾益氣，增強胃腸道運化消脹功能，在治療FD中起到重要作用。從本文建立“藥材-化學(xué)成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)可見，104個核心靶點及20個主要化合物歸屬于黨參與陳皮，說明這兩味藥材在治療FD中起關(guān)鍵作用，是方中君藥。

研究表明，導(dǎo)致胃腸道運動障礙的機制有多個方面。一方面，線粒體功能的異?；驍?shù)目、結(jié)構(gòu)的改變［8，9］可導(dǎo)致胃腸道運動障礙。本文靶點互作分析發(fā)現(xiàn)，16.9%（119/703）的藥物靶點富集在線粒體，包括線粒體呼吸體、線粒體外膜、線粒體呼吸鏈等11個線粒體部位，提示健脾益氣口服液可以改善FD的線粒體異常。

另一方面，5-羥色胺（5-HT）、C-型鈉尿肽（CNP）、多巴胺（DA）水平［10，11］異?？蓪?dǎo)致胃腸道運動障礙。國內(nèi)外均有研究認為FD與焦慮、抑郁及免疫系統(tǒng)等因素緊密相關(guān)［12-14］。雌激素可作用于神經(jīng)中樞調(diào)控情緒反應(yīng)，還可在一定程度上對5-HT作用而影響情緒調(diào)控功能［15］；其水平波動較大時對胃功能有抑制作用，減緩胃排空速率和減少胃酸分泌［16］。5-HT在整個腸道中含量豐富，是大腦和胃腸道中的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)運動性和感覺方面起著關(guān)鍵作用［17］，過度表達會引起胃腸道敏感性增加，使得患者對胃腸的反應(yīng)感到明顯不適（如飽腹感、腹脹、腹痛等），還可帶來一系列免疫反應(yīng)，肥大細胞及脫顆粒增加、胃黏膜中腸嗜鉻細胞增多等［18］。從核心靶點的互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示，EGFR、FOS、CREB1、MAPK1、NOS3、PIK3CA、JUN、TNF等屬于健脾益氣口服液的核心靶點，它們與雌激素信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清能突觸、TNF信號通路、內(nèi)分泌等通路調(diào)節(jié)有關(guān)，最終可能調(diào)節(jié)雌激素、5-HT的水平。

再一方面，Ca2+信號通路、cAMP信號通路［7］異常可導(dǎo)致胃腸道運動障礙。Ca2+幾乎涉及細胞內(nèi)所有的生理活動［19］，其可介導(dǎo)信號通路，調(diào)節(jié)腸道細胞內(nèi)Ca2+濃度，影響腸道運動；線粒體通過攝取Ca2+活化丙酮酸脫氫酶、IDH和α-酮戊二酸脫氫酶生成ATP［20］。本文發(fā)現(xiàn)，①化合物作用靶點參與機體的三羧酸循環(huán)及呼吸鏈的運轉(zhuǎn)，提示化合物上調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ與異檸檬酸脫氫酶（IDH）的表達，促進ATP合成，從而加強胃腸道平滑肌的收縮力促進胃腸運動；②KEGG富集分析表明FD的確與Ca2+信號通路、cAMP信號通路有關(guān)，排名前2位的靶點分別是FOS、EGFR、CREB1、NOS3，推測這些靶點與疾病的發(fā)生或治療存在緊密的聯(lián)系。酪氨酸蛋白激酶活性的細胞表面受體（EGFR）在胃腸道上皮組織中表達，其所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)胃黏膜上皮更新和修復(fù)過程；NOS3在一定條件下可釋放NO抑制胃腸道運動。經(jīng)分子模擬對接驗證，煙酸、苯丙氨酸可與FOS、EGFR、CREB1、NOS3在活性位點穩(wěn)定結(jié)合。

綜上，健脾益氣口服液對小鼠小腸運動功能有促進作用，藥物靶點富集在線粒體，預(yù)測它們參與Ca2+信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、多巴胺能突觸和cAMP信號通路、血清能突觸、TNF信號通路、內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號通路等多條信號通路調(diào)控，合成ATP為腸道蠕動提供動力，調(diào)控雌激素與5-HT的表達水平，增加胃酸分泌，加快胃排空速度以治療FD。健脾益氣口服液通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮療效，需通過進一步試驗驗證靶點和活性成分。