白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價方法的建立*

梁浩明，高永堅(jiān)，陳盛君，區(qū)淑蘊(yùn)，陳錦霞，陳偉鋼，陳科成，林碧珊

(1.國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司研發(fā)中心，佛山 528303；2.江陰天江藥業(yè)有限公司研究院，江陰 214400)

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水湯劑，用于標(biāo)化臨床用藥，保障用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性[1]。國家藥典委員會在2016年發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》提出，中藥配方顆粒以標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為與臨床湯劑療效基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

白術(shù)為菊科植物白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安[2]。白術(shù)主要成分為內(nèi)酯、糖和有機(jī)酸等[3]。目前《中華人民共和國藥典》2020版一部中僅從性狀、鑒別、檢查等項(xiàng)目對白術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制，并未規(guī)定含量測定項(xiàng)。脂溶性組分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ是其主要活性物質(zhì)，但由于水溶性差、轉(zhuǎn)移率低，不足以表征物質(zhì)基礎(chǔ)的一致性[4]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，水溶性成分綠原酸和果糖在白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量較白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ更高。因此，研究和探討上述3個成分是否均可作為白術(shù)的質(zhì)量標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)收集6個產(chǎn)區(qū)共19批白術(shù)，建立白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和果糖的含量測定方法，計算出膏率和轉(zhuǎn)移率，為白術(shù)飲片及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 H-class型超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)(包括二元泵，柱溫箱，自動進(jìn)樣器和PDA檢測器，Waters公司)；ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech公司)；BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)均購自Waters公司； MS105DU型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)；電控溫煎藥壺(深圳市一枚王電子商務(wù)有限公司)；TRL-0.5型真空冷凍干燥機(jī)(大連雙瑞科技有限公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水儀(Millipore公司)。

1.2試藥與藥材 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品(批號：11978-201501，含量：99.9%)和綠原酸對照品(批號：110753-201716，含量：99.3%)均購自中國食品藥品檢定研究院，D-果糖對照品(批號：5964，純度：98.8%)購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙腈和磷酸均為色譜純，超純水由MILLIPORE純水儀制備，其余試劑均為分析純。

19批白術(shù)藥材分別采集于浙江、安徽等不同種植產(chǎn)地，詳細(xì)信息見表1，經(jīng)國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司質(zhì)管部陳志榮主管中藥師鑒定均為白術(shù)(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根莖。由本實(shí)驗(yàn)室按照《中華人民共和國藥典》2015年版一部炮制項(xiàng)要求制成對應(yīng)批次白術(shù)飲片。

表1 15批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1供試品的制備

2.1.1飲片供試品溶液的制備 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ：取本品粉末(篩孔內(nèi)徑355 μm，過三號篩)約2 g，精密稱定，置離心管中，加入70%乙醇10 mL，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，8 000 r· min-1(離心半徑r=9.8 cm)離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，再重復(fù)提取2次，合并上清液，加入70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

綠原酸：取本品粉末(篩孔內(nèi)徑355 μm，過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加入30%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min ，放冷，再稱定質(zhì)量，加30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

果糖：取本品粉末(篩孔內(nèi)徑355 μm，過三號篩)約1.0 g，精密稱定，置燒瓶中，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，再重復(fù)提取1次，合并濾液，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取濾液6 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備 取白術(shù)藥材，按《中華人民共和國藥典》2015年版白術(shù)項(xiàng)下飲片炮制方法，去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，得白術(shù)飲片[2]。取白術(shù)飲片100 g，置5 L電控溫煎藥壺中，加 9 倍量水浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，趁熱濾過，藥渣再加7倍量水，武火煮沸后文火煎煮20 min，趁熱濾過，2次濾液合并，65 ℃減壓濃縮至約250 mL，-50 ℃預(yù)冷3 h后冷凍干燥24 h，得白術(shù)凍干粉，即白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ：取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

綠原酸：取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入超純水10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)5 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，用超純水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

果糖：取本品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入40%乙腈10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，用40%乙腈補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2對照品溶液制備 ①取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含8.52 μg的對照品溶液，即得。②取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.100 mg的對照品溶液，即得。③取D-果糖對照品適量，精密稱定，加40%乙腈制成每毫升含1.06 mg的對照品溶液，即得。

2.3色譜條件 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ：色譜柱BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～7 min，50%A；>7～8 min，50%→90%A；>8～10 min，90%A)；柱溫30 ℃；流速0.20 mL·min-1；檢測波長220 nm；進(jìn)樣量1 μL。

綠原酸：色譜柱BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，1%→6%A；>4～10 min，6%→9%A；>10～20 min，9%→90%A)；柱溫25 ℃；流速0.25 mL·min-1；檢測波長325 nm；進(jìn)樣量1 μL。

果糖：色譜柱BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為含0.2%三乙胺的乙腈-水(80：20)；柱溫40 ℃；流速0.20 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；ELSD檢測器檢測，漂移管溫度75 ℃，氣體流速1.5 L·min-1。

對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1—圖3。

1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。

1.綠原酸。

1.D-果糖。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制成質(zhì)量濃度分別為53.2 μg·mL-1，0.197 mg·mL-1，2.12 mg·mL-1的對照品溶液，逐步稀釋成不同濃度梯度，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和綠原酸以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為Y=20.389X+3.125 3(r=1.000)和Y=12 999X+1 353.1(r=1.000)。D-果糖以對照品溶液濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=1.706 8X+6.793 9(r=0.999 3)。三者分別在0.266～53.2 μg·mL-1、0.004～0.197 mg·mL-1和0.021～2.12 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn) 取白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品溶液適量，分別按“2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計算得到峰面積的RSD值均小于0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取飲片供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，于0，4，8，12，18和24 h，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積RSD分別為1.79%和0.96%，綠原酸峰面積的RSD值分別為1.33%和0.20%，果糖峰面積的RSD值分別為0.78%和0.83%，表明供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分別按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各6份。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ峰面積RSD分別為2.09%和1.42%，綠原酸峰面積的RSD值分別為0.60%和0.51%，果糖峰面積的RSD值分別為0.64%和1.64%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率 精密稱取已知含量的飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑，各6份，按1：1分別加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和D-果糖對照品，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均回收率分別為96.5%和97.0%，綠原酸的平均回收率分別為99.2%和103.6%，果糖的平均回收率分別為98.7%和97.8%，RSD值均小于3.0%。

2.5含量測定 取19批白術(shù)飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和果糖含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示19批白術(shù)飲片中，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量為0.004%～0.096%，綠原酸含量為0.009%～0.120%，果糖含量為1.59%～17.3%；標(biāo)準(zhǔn)湯劑中，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量為0.002%～0.059%，綠原酸含量為0.011%～0.131%，果糖含量為1.79%～30.7%。

2.6白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝參數(shù)測定

2.6.1出膏率 白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率以冷凍干燥所得干膏粉質(zhì)量(m)與投料量(m0)的比值計算，出膏率=m/m0，結(jié)果見表2。白術(shù)19批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為48.5%～65.5%，平均出膏率為(56.8±5.7)%。不同批次的出膏率差異較小，范圍位于均值的±30%。

2.6.2轉(zhuǎn)移率 白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和果糖的轉(zhuǎn)移率分別以每克飲片經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取出該成分的量(W)與每克飲片含該成分的量(M)的比值計算，轉(zhuǎn)移率(%)=W/M×100%，結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)移率以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計算為13.6%～54.5%，平均為(30.7±12.5)%；以綠原酸計算為36.0%～94.9%，平均為(69.2±12.0)%；以果糖計算為68.7%～99.1%，平值為(84.5±9.0)%。

表2 白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率和轉(zhuǎn)移率

3 討論

3.1含量分析方法考察 前期研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和綠原酸在白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中為主要的色譜峰，而果糖在白術(shù)水煎液中含量較高。本實(shí)驗(yàn)建立3種成分的含量測定方法，分別對檢測器、檢測波長、流動相組成、色譜柱、提取溶劑、提取方法等因素進(jìn)行考察，確定本文所用色譜條件。研究期間發(fā)現(xiàn)，部分批次白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和綠原酸的含量、峰響應(yīng)差異較大，且極性存在一定差異，不利于同時測定兩種成分的含量。另外，硅膠氨基柱分析果糖時容易產(chǎn)生希夫堿，造成蒸發(fā)光散射檢測器的基線噪音較大[5]，選用BEH Amide色譜柱可避免上述情況，提高定量準(zhǔn)確性和兼容性。

3.2不同產(chǎn)地白術(shù)成分含量比較 為保證標(biāo)準(zhǔn)湯劑的代表性，本實(shí)驗(yàn)白術(shù)藥材來源于多個主產(chǎn)區(qū)，包括湖南、河北、河南、重慶、安徽、浙江。計算各產(chǎn)區(qū)成分的平均含量，河北保定、浙江金華和重慶秀山的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均含量較接近，為0.018%～0.033%，河南焦作和安徽約為0.008%，湖南隆回為0.087%。河北保定、湖南隆回和浙江金華的綠原酸平均含量為0.052%～0.065%，而河南焦作、重慶秀山和安徽為0.014%～0.019%。湖南隆回、河南焦作和安徽的果糖平均含量為2.24%～3.00%，浙江金華和重慶秀山為4.18%～5.40%，河北保定為11.3%。因此，與白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和綠原酸相比，果糖的含量較高且不同產(chǎn)地之中含量差異相對較小。

3.3轉(zhuǎn)移率考察 白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸和果糖的轉(zhuǎn)移率分別為(30.7±12.5)%，(69.2±12.0)%和(84.5±9.0)%。果糖的含量高于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和綠原酸，且果糖比白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、綠原酸的轉(zhuǎn)移率高且穩(wěn)定。因此，白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率，建議選用果糖作為指標(biāo)成分進(jìn)行計算。

綜上所述，果糖在白術(shù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中含量高、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定。果糖在臨床上常用于機(jī)體能量補(bǔ)充及體液調(diào)節(jié)[6]，而近年研究表明果糖等低分子糖口服后能影響人體腸道運(yùn)動，調(diào)節(jié)益生菌群，調(diào)控腸道糖類攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)，治療慢性腹瀉和腹部疼痛等胃腸道癥狀[7-9]，其胃腸道活性或與白術(shù)益氣健脾功效密切相關(guān)。因此，果糖可作為白術(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制標(biāo)志物。