膽芩溫敏眼用凝膠的基質(zhì)處方優(yōu)化及其體外釋放性能*

郭俊國(guó)，郭新苗，王剛，宋繼科，畢宏生2，，田景振

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所藥學(xué)室，濟(jì)南 250002；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院，濟(jì)南 250355；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 250002)

葡萄膜炎為眼科難治性致盲性眼病，且該病多發(fā)于青壯年，社會(huì)危害極大，治療主要采用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑，易導(dǎo)致青光眼、向心性肥胖等眼部和全身并發(fā)癥，對(duì)患者造成二次傷害，且除糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑外，目前國(guó)內(nèi)外尚無改善患者癥狀的其他治療藥物[1]。葡萄膜炎中醫(yī)學(xué)屬瞳神緊小、瞳神干缺等范疇，大量臨床實(shí)踐表明，中醫(yī)治療葡萄膜炎優(yōu)勢(shì)明顯，可提高臨床療效，降低復(fù)發(fā)率，提高患者視覺質(zhì)量，但臨床缺乏安全有效的中藥制劑[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)不同濃度黃芩苷可明顯抑制大鼠白細(xì)胞介素17(IL-17)、γ干擾素(IFN-γ)水平，梔子苷和膽酸對(duì)IL-17、IFN-γ抑制作用呈濃度依賴性[4-5]。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冰片對(duì)黃芩苷、梔子苷在離體和在體角膜均具有明顯的促滲透作用，可增加有效成分的角膜通透率及生物利用度，且冰片具有良好的耐受性[6]。在大量基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，課題組根據(jù)葡萄膜炎中醫(yī)病機(jī)，在前期研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化精簡(jiǎn)處方，研制中藥組分配伍臨床協(xié)定方——膽芩方，已獲授權(quán)發(fā)明專利2項(xiàng)[7-8]。

膽芩方中膽酸清熱解毒，為君藥；黃芩提取物黃芩苷清熱瀉火解毒，加強(qiáng)膽酸清熱解毒之功，為臣藥；梔子苷清熱涼血，瀉火解毒，加強(qiáng)清熱明目之功，為佐藥；冰片可通諸竅，促進(jìn)藥物吸收，為佐使藥。全方諸藥相合，點(diǎn)眼外用，可直達(dá)病所，共奏清火、解毒、明目之功。臨床發(fā)現(xiàn)膽芩方“目浴法”治療葡萄膜炎可顯著提高治愈率和有效率，降低復(fù)發(fā)率和激素積分，不僅可減輕眼部炎癥反應(yīng)，且無激素樣毒副作用，療效顯著。此外研究發(fā)現(xiàn)，膽芩眼用凝膠中冰片可增加梔子苷前房?jī)?nèi)藥物濃度，無刺激性，可減輕葡萄膜炎大鼠的前房炎癥反應(yīng)，具有較好的治療作用[9]。

滴眼劑是眼部最常用劑型，但其流失嚴(yán)重、生物利用度低，如何提高生物利用度是制劑研究的關(guān)鍵[10]。原位凝膠以溶液狀態(tài)給藥，給藥后形成凝膠狀態(tài)或半固體狀，有助于延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，成為研究熱點(diǎn)溫度敏感型凝膠與黏膜具有良好生物相容性，外觀清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，適宜外用治療[12]。溫度敏感型凝膠在生理溫度下吸熱發(fā)生膠凝，形成透明、柔軟、潤(rùn)滑的凝膠，且制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、使用便利，在淚液的沖刷下緩慢溶解后排出體外，避免眼膏黏附、滴眼劑滯留時(shí)間短等弊端[13]。因此，本研究將膽芩方制為凝膠，并考察體外溶蝕性和釋藥性，為葡萄膜炎治療提供一種創(chuàng)新藥物，有助于提升眼用中藥新藥創(chuàng)制水平。

1 儀器與試藥

1.1儀器 U-3000液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛公司)，MS205DU電子天平(德國(guó)梅特勒托利多公司，感量：0.01 mg)，EL204電子天平(德國(guó)梅特勒托利多公司，感量：0.1 mg)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SIM-F140AY65-PC制冰機(jī)(松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)，78-1型磁力攪拌器(常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)，CRYOBASICIS滲透壓分析儀(意大利ASTORI公司)，PHS-3CW酸度計(jì)(上海般特儀器有限公司)，RC-6溶出度測(cè)定儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司)，SHZ-82A恒溫振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，GMP中試車間(沈陽興齊眼藥股份有限公司)。

1.2試藥 黃芩苷和梔子苷提取物(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，含量≥95.0%，批號(hào)：HQG090417和ZZG090625)，天然冰片(濟(jì)南建聯(lián)中藥店，批號(hào)：100078-200414)，黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201016)，梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品檢定研究院，批號(hào)：110749-200714)，泊洛沙姆407(P407，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：62035)，泊洛沙姆188(P188，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：P4894)，丙二醇(PGI)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190516)，色譜乙腈和甲醇(Tedia of United States America)，其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溫敏凝膠的制備 采用冷溶法制備膽芩溫敏眼用凝膠。稱取膽酸5.0 g、黃芩苷提取物3.0 g、梔子苷提取物2.0 g，加入注射用水250 mL，攪拌下加入40%氫氧化鈉溶液3 mL使其完全溶解(pH值9.0±0.5)，緩慢加入P188(pH值8.5±0.5)后，取P407，加入注射用水620 mL，室溫溶脹24 h。另稱取冰片1.0 g加入PGI溶液，研磨溶解完全。將上述溶液加入到溶脹液中，加水至1000 g，孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，灌裝。

2.2相變溫度的測(cè)定

2.2.1凝膠相變溫度測(cè)定 采用傾斜法測(cè)定相變溫度[14]。具體為：取凝膠樣品5 mL，置10 mL西林瓶，蓋上中間打孔的橡膠塞，插入溫度計(jì)(精度0.1 ℃)，并保證溫度計(jì)感應(yīng)端浸入溶液。水浴中平衡20 min，按照0.5 ℃·min-1緩慢升高溫度，每間隔20 s傾斜西林瓶60°，記錄溶液凝固時(shí)的溫度即為相變溫度(Tgel)，平行測(cè)定3次。

2.2.2淚液稀釋后凝膠相變溫度的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]，精密稱取氯化鈉(NaCl)6.78 g、氯化鉀(KCl)1.38 g、碳酸氫鈉(NaHCO2)2.18 g、二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.084 g，加水配制成人工模擬淚液1 L。取凝膠樣品5 mL，加入人工模擬淚液(40：7)875 μL，按上述“2.2.1”方法測(cè)定人工淚液稀釋后的相變溫度(Tatd gel)，平行測(cè)定3次。

2.3凝膠基質(zhì)單因素考察

2.3.1P407對(duì)相變溫度的影響 固定P188(3%)和PGI(10%)濃度，設(shè)置7個(gè)P407濃度，分別為17%、19%、21%、23%、25%、27%及29%。按上述“2.1”方法制備眼用凝膠，測(cè)定其Tgel和Tatd gel。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P407濃度增加，Tgel和Tatd gel逐漸下降，Tgel擬合方程為Y=-2.408X+36.77(R2=0.982)；Tatd gel擬合方程為Y=-2.058X+45.87(R2=0.948)。當(dāng)P407濃度>23%時(shí)，Tatd gel低于35 ℃，選擇23%，25%和27%作為-1，0和+1水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)。

2.3.2P188對(duì)相變溫度的影響 固定P407(25%)和PGI(10%)濃度，設(shè)置5個(gè)P188濃度，分別為1%，3%，5%，7%及9%。按 “2.1”項(xiàng)方法制備眼用凝膠，測(cè)定其Tgel和Tatd gel。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P188濃度增加，Tgel和Tatd gel升高，Tgel擬合方程為Y=1.0286X+21.600(R2=0.907 6)；Tatd gel擬合方程為Y=1.9657X+27.52(R2=0.962 7)。當(dāng)P188濃度<5%時(shí)，室溫(25 ℃)條件下為液體，Tatd gel低于35℃，選擇3%、5%和7%作為-1、0和+1水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)。

2.3.3PGI對(duì)溫度的影響 固定P407(25%)和P188(3%)，設(shè)置5個(gè)PGI濃度，分別為2%，6%，10%，14%及18%。按“2.1”項(xiàng)方法制備眼用凝膠，測(cè)定其Tgel和Tatd gel。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度PGI，可增加Tgel和Tatd gel，PGI濃度>6%相變溫度下降，但溫度變化幅度不明顯。由于PGI可作為保濕劑、促滲劑和增溶劑，且對(duì)溫敏眼用凝膠的相變溫度存在雙向影響，選擇4%，6%和8%作為-1，0和+1水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)。

2.4星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素研究結(jié)果，確定P407(X1)、P188(X2)和PGI(X3)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察因素，各因素設(shè)5個(gè)水平，代碼為±α(1.682)、±1和0，以Tgel和Tatd gel為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件進(jìn)行3因素5水平星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法(CCD-RSM)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，見表1，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 各因素水平的代碼值及實(shí)際處方量

表2 DQTOG基質(zhì)優(yōu)選的星點(diǎn)設(shè)計(jì)安排

表3 多種模型方差分析表

表4 方差分析結(jié)果

2.4.3效應(yīng)面預(yù)測(cè)分析與處方優(yōu)化 根據(jù)二項(xiàng)式方程繪制Tgel和Tatd gel效應(yīng)指標(biāo)與考察因素的等高線圖及三維效應(yīng)面圖，見圖1和圖2。結(jié)果表明固定P407濃度，P188濃度增大，Tgel值先降低后增高；PGI濃度增大，Tgel值逐漸升高。固定P188濃度，P407濃度增大，Tgel值增加到24.6 ℃后不再增加；PGI濃度增大，Tgel值逐漸升高。固定P407濃度，P188濃度增大，Tatd gel值先降低再增高；PGI濃度增大，Tatd gel值逐漸升高。固定P188濃度，P407濃度增大，Tatd gel值降低；PGI濃度增大，Tatd gel值先降低再增高。

理想眼用凝膠約25 ℃應(yīng)為液體，當(dāng)?shù)稳虢Y(jié)膜囊內(nèi)約34 ℃迅速形成凝膠，根據(jù)圖1和圖2，Design Expert軟件給出最優(yōu)基質(zhì)處方：P407濃度為24.5%，P188濃度為6%，PGI濃度為6%，預(yù)測(cè)Tgel值為24.7 ℃，Tatd gel值為34.4 ℃。

圖1 各因素對(duì)Tgel的等高線圖及三維效應(yīng)面圖

圖2 各因素對(duì)Tatd gel的等高線圖及三維效應(yīng)面圖

2.4.4凝膠基質(zhì)處方驗(yàn)證 按照優(yōu)選基質(zhì)配比，GMP中試車間進(jìn)行3批產(chǎn)品驗(yàn)證，測(cè)定Tgel和Tatd gel值，實(shí)驗(yàn)實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值比較接近，結(jié)果見表5。Tgel的RSD值為2.30%，Tatd gel的RSD值為0.81%，偏差絕對(duì)值均<3%，說明該模型可較好地預(yù)測(cè)各因素和凝膠相變溫度的關(guān)系。

表5 優(yōu)選基質(zhì)處方驗(yàn)證結(jié)果

2.5含量測(cè)定方法 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇為流動(dòng)相A，0.1%甲酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0 min，88.0% B；0～3 min，88.0%B；>3～20 min，88.0%→60.0% B；>20～21 min，60.0%→88.0%B；>21～25 min，88.0% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10 min為240 nm；>10～25 min為276 nm。理論板數(shù)不低于6000。

對(duì)照品溶液制備：精密稱定黃芩苷、梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含黃芩苷0.3 mg、梔子苷0.2 mg的混合溶液，即得。

供試品溶液制備：精密稱定樣品1 g，加甲醇稀釋至10 mL，濾過，取上清液，即得。

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.6體外溶蝕動(dòng)力學(xué)考察 在4 ℃條件將2 g自制DQTOG加入平底試管中，35 ℃恒溫恒濕箱預(yù)熱30 min，液面平整狀態(tài)下形成凝膠。加入預(yù)熱釋放介質(zhì)(人工模擬淚液)2 mL，35 ℃固定頻率，振蕩30 min，倒出釋放介質(zhì)，并用濾紙吸干，迅速稱量，再次加入預(yù)熱釋放介質(zhì)2 mL，重復(fù)上述操作[16]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定90 Hz震蕩頻率，累積溶蝕量隨截面面積增加而增大，見圖3；固定1.76 cm2截面面積，累積溶蝕量隨震蕩頻率的增加而增大，震蕩頻率為150 Hz時(shí)，在120 min累積溶蝕量已達(dá)1.87 g，而震蕩頻率為0 Hz時(shí)，在180 min累積溶蝕量?jī)H為0.33 g，見圖4。表明制備的DQTOG溶蝕量與截面面積和震蕩頻率密切相關(guān)。

圖3 截面面積對(duì)體外溶蝕量的影響

圖4 震蕩頻率對(duì)體外溶蝕量的影響

2.7體外釋藥性考察 采用第二槳法考察體外釋藥性[17]。稱取2.0 g制備的DQTOG于西林瓶中，35 ℃恒溫恒濕箱預(yù)熱30 min，將西林瓶置于溶出杯底部，加入人工模擬淚液500 mL，35 ℃，定時(shí)取樣量10 mL，孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DQTOG在300 min基本能夠釋藥完全，不同轉(zhuǎn)速對(duì)梔子苷和黃芩苷的釋藥曲線略有差異，轉(zhuǎn)速越快，釋藥時(shí)間越短，轉(zhuǎn)速為75 r·min-1時(shí)，黃芩苷和梔子苷在90 min內(nèi)釋放速度較快，累積釋放率分別為(55.12±4.01)%和(45.67±3.19)%。結(jié)果見圖5和圖6。結(jié)果表明制備的凝膠具有良好的緩釋作用。將黃芩苷和梔子苷累積釋藥量與時(shí)間進(jìn)行零級(jí)、一級(jí)、Higuchi 模型擬合，見表6。結(jié)果顯示黃芩苷的體外釋放符合一級(jí)方程，梔子苷的體外釋放符合零級(jí)方程。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)黃芩苷體外釋放曲線的影響

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)梔子苷體外釋放曲線的影響

表6 黃芩苷和梔子苷外釋放擬合方程

3 討論

原位凝膠給藥后形成凝膠狀態(tài)或半固體狀，有助于延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，根據(jù)相變機(jī)制分為溫度敏感型、離子敏感型和 pH 敏感型原位凝膠，其中溫度敏感型凝膠與黏膜具有良好生物相容性，外觀清澈透明，涂展性好，易于透皮吸收和清洗，安全性良好，適宜眼部治療。目前溫敏凝膠基質(zhì)主要有N-異丙基丙烯酰胺、泊洛沙姆、殼聚糖等聚合物，由于N-異丙基丙烯酰胺結(jié)構(gòu)中存在酰氨基和異丙基，其凝膠質(zhì)地較硬，會(huì)與角膜產(chǎn)生摩擦，眼科較少應(yīng)用，泊洛沙姆為類聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具有較好的生物相容性，是一種理想的藥用輔料，可用于口服、局部給藥和注射等，殼聚糖化學(xué)活性較強(qiáng)，生物黏膜黏性強(qiáng)，在眼睛局部可產(chǎn)生輕微的刺激性，因此本研究選取泊洛沙姆進(jìn)行研究[18]。本研究采用傾斜法測(cè)定Tgel和Tatd gel，可避免攪拌子法攪拌速率和攪拌子大小影響測(cè)量結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)P407濃度<20%時(shí)，其Tgel值>30 ℃，Tatd gel值>40 ℃，難以形成凝膠，這是因?yàn)榈蜐舛鹊腜407溶液中聚氧丙烯的比例相對(duì)較低，P407具有溫度敏感性質(zhì)，較低黏度難以形成凝膠。在P407溶液中加入水溶性較好的P188，可增加聚氧丙烯相對(duì)含量，當(dāng)P188>3%時(shí)，在35 ℃即可形成凝膠。另外本研究發(fā)現(xiàn)，PGI濃度<6%時(shí)，可增加凝膠的相變溫度，但當(dāng)PGI濃度>6%時(shí)其相變溫度成下降趨勢(shì)，由于丙二醇具有良好的互溶性、保濕性等，在溫敏眼用凝膠的制備中加入一定比例的PGI可增加凝膠制劑的穩(wěn)定性、保濕性和潤(rùn)滑作用。通過3個(gè)單因素考察研究，確定P407、P188和PGI的3個(gè)水平進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)。

眼用凝膠在角膜表面的鋪展?fàn)顟B(tài)會(huì)在很大程度上影響到藥物的釋放速率，而鋪展?fàn)顟B(tài)受到眨眼剪切作用的影響，因此考察釋放面積對(duì)凝膠溶蝕和藥物釋放的影響，應(yīng)用振蕩頻率來模擬眨眼的頻率。本研究通過體外溶蝕動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn)，固定震蕩頻率累積溶蝕量隨截面面積增加而增大，固定截面面積，累積溶蝕量隨震蕩頻率的增加而增大，表明制備的DQTOG溶蝕量與截面面積和震蕩頻率密切相關(guān)。溫敏眼用凝膠劑在非生理狀態(tài)下為液體，在結(jié)膜囊內(nèi)受到溫度的影響而發(fā)生溶膠-凝膠相變，轉(zhuǎn)變?yōu)轲こ砟z，顯著延長(zhǎng)藥物與角膜的滯留時(shí)間，提高生物利用度體。淚液分泌和眨眼反射會(huì)使眼瞼不斷混合凝膠與淚液造成凝膠溶蝕，藥物釋放入淚液，人工淚液在振蕩條件下凝膠表面產(chǎn)生類似眨眼的剪切作用，因此采用類似研究片劑或經(jīng)皮給藥凝膠藥物釋放行為的方法，模擬眼用凝膠在體內(nèi)過程[17]。外釋藥性考察發(fā)現(xiàn)DQTOG中黃芩苷和梔子苷的釋放規(guī)律不同，黃芩苷的體外釋放符合一級(jí)方程，梔子苷的體外釋放符合零級(jí)方程，初步說明該凝膠中的有效成分可以持續(xù)、穩(wěn)定地從體系中釋放出來，具有一定的緩釋作用。