脂血標(biāo)本對(duì)兩種方法血小板計(jì)數(shù)及形態(tài)的影響分析

陳言偉，毋琦，楊曉鵬，丁金璽，佟建燁，李 浩，李啟萌，郭殊君

（1.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 平頂山 467000；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院，病理科；河南 平頂山 467000；3.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 平頂山 467000）

脂血既是生理現(xiàn)象也是病理現(xiàn)象，血常規(guī)是臨床常規(guī)檢測(cè)和急診檢測(cè)項(xiàng)目，標(biāo)本沒(méi)有要求空腹采集，其脂血發(fā)生率較高，我們更應(yīng)該關(guān)注脂血標(biāo)本對(duì)血常規(guī)結(jié)果的影響。脂血標(biāo)本對(duì)血小板計(jì)數(shù)特別是光學(xué)法血小板計(jì)數(shù)(platelet-Optical count,PLT-O)的影響罕見(jiàn)報(bào)道，更缺乏系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析。筆者工作中發(fā)現(xiàn)兩例血小板減少同時(shí)輸注脂肪乳注射液（C14-24）的患者，多次PLT-O、阻抗法血小板計(jì)數(shù)(platelet-Impedance count,PLT-I)檢驗(yàn)結(jié)果與臨床不符，且同一標(biāo)本PLT-O、PLT-I 結(jié)果相差甚大[1]，初步考慮脂類物質(zhì)輸入體內(nèi)后在某個(gè)時(shí)間段干擾了PLT-O、PLT-I的計(jì)數(shù)結(jié)果。為了進(jìn)一步深入研究，我們模擬脂肪乳注射液在體內(nèi)的代謝環(huán)境和濃度，分別于不同時(shí)間段對(duì)模擬脂血標(biāo)本進(jìn)行分析，觀察PLT-O、PLT-I計(jì)數(shù)結(jié)果隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化，同時(shí)與對(duì)照組比較，分析脂血對(duì)血小板計(jì)數(shù)及其形態(tài)的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取2019年5 月17 日本院體檢中心5 名血型相同的健康體檢人員。受試對(duì)象肝功能、腎功能、血脂及血糖等各指標(biāo)正常，血小板結(jié)果PLT-I和PLT-O 均在130～300×109/L 之間，血細(xì)胞計(jì)數(shù)參數(shù)均在參考區(qū)間。清晨空腹各采集EDTA-K2 抗凝血2ml。

1.2 儀器與試劑 血小板計(jì)數(shù)使用日本Sysmex 公司XT-4000i型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及原裝配套試劑、質(zhì)控物，血細(xì)胞分析儀每半年校準(zhǔn)1 次，且校準(zhǔn)合格，每日測(cè)定3 個(gè)水平原廠配套質(zhì)控品，室內(nèi)質(zhì)控在控。使用日本OLYMPUS CX-21 顯微鏡觀察血小板形態(tài)，ABO、RhD 血型定型檢測(cè)卡及抗人球蛋白檢測(cè)卡（交叉配血用）購(gòu)于長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司。瑞氏-姬姆薩染液按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4 版配制后備用[2]，由中級(jí)職稱以上形態(tài)學(xué)老師定期就染液對(duì)血涂片實(shí)際染色效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染液按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》 第1 版配制后備用[3],以腸系膜脂肪組織的冰凍切片做陽(yáng)性對(duì)照。脂肪乳注射液（C14-24）由安徽豐原藥業(yè)股份有限公司提供,國(guó)藥準(zhǔn)字H34023480,批號(hào)：2118120301。

1.3 方法 將符合要求的5例標(biāo)本混合均勻(混勻后排除脂血、溶血、黃疸對(duì)檢測(cè)的影響),共計(jì)10ml?；旌蠘颖窘徊媾溲z測(cè)無(wú)凝集、無(wú)溶血、相合。取1.8ml 混合標(biāo)本加入100μl 原裝稀釋液EPK，立即連續(xù)上機(jī)檢測(cè)3 次，記錄PLT-I、PLT-O 結(jié)果，分別取均值作為對(duì)照組I和對(duì)照組O 血小板計(jì)數(shù)結(jié)果。根據(jù)常永紅等[4]報(bào)道，血小板計(jì)數(shù)隨放置時(shí)間變化較小，故取此次計(jì)數(shù)結(jié)果作為所有時(shí)間點(diǎn)觀察組結(jié)果的對(duì)照。提取7.2ml 混合標(biāo)本按照說(shuō)明書(shū)配比添加400μl 脂肪乳注射液（C14-24）與其充分混合作為實(shí)驗(yàn)組。將實(shí)驗(yàn)組樣本37°水浴箱孵育，每60min 顛倒混勻5 次，每間隔2 小時(shí)分別以PLT-O和PLT-I 方法用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的CBC+DIFF+RET 模式計(jì)數(shù)血小板3 次并取均值，22h 內(nèi)共檢測(cè)12 次。記錄所有時(shí)間段PLT-I和PLT-O 數(shù)值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)后立即推兩張血片，選擇結(jié)果最高的時(shí)間點(diǎn)的血片染色，一張進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色，另一張甲醛固定后先用蘇丹Ⅲ初染，再用蘇木精-伊紅復(fù)染，分別鏡檢觀察。另用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的CBC+DIFF+RET 模式對(duì)脂肪乳注射液（C14-24）原液計(jì)數(shù)血小板3 次取均值并記錄PLT-I、PLT-O 數(shù)值，并分析其直方圖與散點(diǎn)圖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,使用OriginPro 9.0 進(jìn)行t-檢驗(yàn)單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 脂血標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的影響 結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)間段脂血標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)結(jié)果與對(duì)照組結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表1。其中PLTO 組各時(shí)間段之間的差異只有0h與2h 之間結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.285），其余各時(shí)間段之間的結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1A 所示。而PLT-I 組從0h 到8h 血小板計(jì)數(shù)逐漸升高，時(shí)間點(diǎn)間血小板計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，8h 到16h 時(shí)間段血小板計(jì)數(shù)無(wú)顯著變化（P>0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 脂血標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)隨時(shí)間變化

表1 不同時(shí)間段脂血標(biāo)本PLT-O、PLT-I結(jié)果與對(duì)照組結(jié)果比較（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 脂血標(biāo)本血小板鏡下形態(tài)觀察在血小板結(jié)果最高點(diǎn)PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L 時(shí)，即20h 進(jìn)行推片瑞氏-姬姆薩染色見(jiàn)圖2A，蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染色結(jié)果見(jiàn)圖2B。由圖片可見(jiàn)，雖然儀器報(bào)警有RBC 碎片、血小板聚集，但鏡下均未查見(jiàn)紅細(xì)胞溶解、碎片及白細(xì)胞碎片，血小板也未見(jiàn)聚集現(xiàn)象。圖2A 中可見(jiàn)大量大小不一的類血小板顆粒物質(zhì)，蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染色結(jié)果圖2B中可見(jiàn)脂類物質(zhì)著色良好，形態(tài)大小與血小板相似。

圖2 脂血標(biāo)本對(duì)血小板鏡下形態(tài)觀察

2.3 脂血標(biāo)本及脂肪乳注射液（C14-24）原液血小板計(jì)數(shù)直方圖及散點(diǎn)圖 脂血標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)的直方圖及散點(diǎn)圖如圖3A 所示（僅展示計(jì)數(shù)最高點(diǎn)圖形），脂血標(biāo)本PLT-O和PLT-I 血小板計(jì)數(shù)在第20h 時(shí)分別為1362×109/L和442×109/L，脂肪乳注射液（C14-24）原液PLT-O和PLT-I 血小板計(jì)數(shù)分別為170×109/L和102×109/L；此外，脂血標(biāo)本的“血小板”在圖形的橫坐標(biāo)上熒光強(qiáng)度較弱，且分布集中、偏左，其左側(cè)的熒光部分基本與脂肪乳散點(diǎn)圖的熒光部分重疊?？梢?jiàn)脂肪乳對(duì)PLT-O和PLT-I 血小板計(jì)數(shù)均有影響，并且對(duì)于PLT-O計(jì)數(shù)結(jié)果的影響要大于PLT-I計(jì)數(shù)結(jié)果。

圖3 脂血標(biāo)本(A)及脂肪乳注射液（C14-24）原液(B)血小板計(jì)數(shù)直方圖及散點(diǎn)圖

3 討論

我們?cè)诠ぷ髦袑?duì)低值血小板和假性血小板減少關(guān)注較多，而且常將PLT-O 作為異常PLT-I的復(fù)檢方法[5,6]。由于臨檢工作量大，有的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用了自動(dòng)審核系統(tǒng)，如果復(fù)檢規(guī)則設(shè)置的不全面，很難實(shí)現(xiàn)對(duì)散點(diǎn)圖和直方圖逐一審核。日常工作中對(duì)正常值血小板結(jié)果審核發(fā)送不是十分嚴(yán)謹(jǐn)，正常值也可能是個(gè)假象,低值血小板的假性正?；蛘呱邥?huì)帶來(lái)更加嚴(yán)重的后果,特別是手術(shù)患者出血風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[7,8]。所以我們?cè)陉P(guān)注低值血小板的同時(shí)更應(yīng)該關(guān)注低值血小板假性正常和假性增高的病例。表1 中可見(jiàn)脂肪乳加入后立即檢測(cè)PLT-O和PLT-I 均明顯增高，與對(duì)照組結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且兩者各個(gè)時(shí)間段結(jié)果與對(duì)照組結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖1A 中可知PLT-O 結(jié)果在0h 至2h 時(shí)間段較穩(wěn)定，結(jié)果增高不明顯，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)脂類物質(zhì)逐漸被代謝成類似血小板大小的顆粒物質(zhì)，計(jì)數(shù)結(jié)果顯著增高，于20h 到達(dá)峰值1362×109/L，是對(duì)照組結(jié)果的7.5 倍之多。圖1B 中可見(jiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)PLT-I結(jié)果增高幅度沒(méi)有PLT-O 明顯，同時(shí)也在20h 達(dá)到峰值PLT-I 442×109/L，也是對(duì)照組結(jié)果的2.3倍。兩種檢測(cè)原理對(duì)PLT 結(jié)果的影響都非常顯著，如果是低值血小板患者必定會(huì)誤導(dǎo)臨床造成嚴(yán)重的后果。

PLT-O 結(jié)果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)遠(yuǎn)高于PLT-I的結(jié)果，我們分析認(rèn)為：PLT-I 結(jié)果對(duì)血小板體積大小敏感，大血小板或者說(shuō)顆粒物質(zhì)平均體積大于12.1fl 時(shí)會(huì)造成結(jié)果偏低,另外SysmexXT-4000i 血細(xì)胞分析儀器檢測(cè)PLT的下限鑒別線浮動(dòng)界標(biāo)為2-6fl 之間，即小于6fl的顆粒物質(zhì)有可能也不會(huì)計(jì)數(shù)在內(nèi)[9]。而PLT-O的檢測(cè)原理是從血小板質(zhì)的角度對(duì)血小板進(jìn)行染色計(jì)數(shù)，彌補(bǔ)了阻抗法許多弊端[10]，而且近年來(lái)的研究報(bào)道證明了PLT-O在血細(xì)胞分析中的價(jià)值，已經(jīng)常規(guī)用于對(duì)PLT-I 檢測(cè)異常結(jié)果的復(fù)檢[11,12]。但是PLT-O的檢測(cè)原理的優(yōu)越性也決定了它的弊端[13]。比如圖3A 中PLT-O 散點(diǎn)圖與脂肪乳的散點(diǎn)圖圖3B對(duì)比可以得到驗(yàn)證，脂血標(biāo)本的“血小板”在圖形的橫坐標(biāo)上熒光強(qiáng)度較弱，且分布集中、偏左，其左側(cè)的熒光部分基本與脂肪乳散點(diǎn)圖的熒光部分重疊。進(jìn)而說(shuō)明這些沒(méi)有被PLT-I計(jì)數(shù)進(jìn)去的脂類顆粒被PLT-O 當(dāng)作血小板進(jìn)行了計(jì)數(shù)，從而造成脂血標(biāo)本中PLT-O比PLT-I 結(jié)果假性增高更加顯著。

圖3A 中可見(jiàn)儀器RBC/RET 報(bào)警區(qū)提示“碎片？”，同時(shí)也為了觀察假性增高是否由于隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，造成WBC 崩裂或/和RBC 破碎影響PLT計(jì)數(shù)[13,14]，于是在血小板結(jié)果最高點(diǎn)PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L，即20h 推片兩張染色鏡檢，瑞氏-姬姆薩染色如圖2A，紅細(xì)胞形態(tài)完整無(wú)紅細(xì)胞碎片、白細(xì)胞裂解物質(zhì)等著色的類血小板顆粒物質(zhì)。另外RBC計(jì)數(shù)并未減少，而且WBC計(jì)數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不但沒(méi)有降低反而有所增高，對(duì)照組WBC計(jì)數(shù)為6.37×109/L，實(shí)驗(yàn)組0 時(shí)WBC6.49×109/L，至血小板計(jì)數(shù)最高點(diǎn)20 時(shí)WBC計(jì)數(shù)為13.27×109/L，WBC Flag（s）提示“幼稚粒細(xì)胞？、難溶紅細(xì)胞？”等，散點(diǎn)圖異常（原因有待進(jìn)一步探討）?？梢哉f(shuō)明PLT-O和PLT-I的增高并非RBC和WBC的影響。同時(shí)圖2B 中可見(jiàn)大量不著色、形態(tài)大小類似血小板的顆粒物質(zhì)，疑似脂類物質(zhì)，且這些形態(tài)大小類血小板顆粒物質(zhì)被蘇丹Ⅲ染為紅色。由此推測(cè)RBC/RET 報(bào)警提示的“碎片？”也是由此類物質(zhì)所致。本文從金標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)上證實(shí)了脂血標(biāo)本對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響，尤其對(duì)PLT-O 結(jié)果影響更為顯著。由于PLT-O計(jì)數(shù)血小板原理主要是依據(jù)細(xì)胞通過(guò)核酸熒光染色后的光散射差異區(qū)別血小板和其他類血小板顆粒物質(zhì)，從而明確了PLT-O 增高的原因在于脂類物質(zhì)在體內(nèi)分解代謝成相當(dāng)于PLT 體積大小，經(jīng)核酸熒光染料RET-SEARCH(Ⅱ)染色呈現(xiàn)與血小板類似的熒光強(qiáng)度，因此被儀器誤認(rèn)成血小板進(jìn)行計(jì)數(shù)[15]。

綜上所述，血常規(guī)標(biāo)本沒(méi)有嚴(yán)格要求空腹采血而且不能離心，脂血標(biāo)本相對(duì)較多且不易發(fā)現(xiàn)，對(duì)結(jié)果的影響很容易被忽視。脂血標(biāo)本代謝的不同時(shí)間段對(duì)阻抗法和光學(xué)法均有顯著的影響，病情允許的情況下建議空腹采血，特別是對(duì)于既往血小板減少癥的患者強(qiáng)烈推薦空腹采血，需要長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)對(duì)照的患者盡量控制在同一時(shí)間采血。在審核儀器分析結(jié)果時(shí)懷疑有脂血等干擾的標(biāo)本，必要時(shí)行等量血細(xì)胞稀釋液置換，或者手工復(fù)核。