ω-3多不飽和脂肪酸調(diào)控Wnt/β-catenin通路預(yù)防神經(jīng)管畸形的機(jī)制研究

游雪云，劉艷秋，吳敏

（1.江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西 南昌 330006；2.臨川區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 撫州 344100）

神經(jīng)管畸形(NTD)是胚胎神經(jīng)管無(wú)法完成正常閉合而導(dǎo)致的一種先天畸形,其中多不飽和脂肪酸（PUFA）代謝調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致NTD 發(fā)生的最重要原因，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA）是神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)組分，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA），但其功能目前尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：ω-3-PUFA 代謝產(chǎn)生的類花生酸TXA2、PGl2 能夠參與調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由母親經(jīng)胎盤到胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn),同時(shí)促進(jìn)Hcy 代謝中一些關(guān)鍵基因；Hcy升高可以激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，可能在神經(jīng)管發(fā)育過程中發(fā)揮作用。鑒于此,筆者團(tuán)隊(duì)于2019年1 月至2020年9 月在江西省婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室以ω-3-PUFA 為切入點(diǎn),通過不同飼料喂養(yǎng)的孕鼠腹腔注射VPA 建立起VPA 鼠模型，探討ω-3-PUFA在Hcy 協(xié)同下調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路預(yù)防神經(jīng)管畸形中的功能和作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)6 周齡ICR 小鼠(雌鼠50 只，雄鼠25 只)由南昌樂悠生物科技有限公司提供，孕期所需的橄欖油強(qiáng)化飼料由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司加工。VPA:≥98%，Sigma-Aldrich Co.LLC.總蛋白測(cè)定試劑盒:A045-2，由南京建成生物工程研究所提供。Hcy 代謝通路中關(guān)鍵基因（CASC2c、MTHFR、CSE和CSCA2）mRNA表達(dá)檢測(cè)所需試劑為UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)通過Primer bank 搜索目的基因的引物，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast 比對(duì)后，由上海生物有限公司合成。取新鮮的胎盤組織約50mg，Trizol 法提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以表1 操作方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以表2 引物序列和表3 定量PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。950C 預(yù)變性5min,循環(huán)擴(kuò)增階段950C 變性15s,580C 退火30s,720C 延伸69s，32 個(gè)循環(huán)，720C 保溫10min。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表2 qPCR 引物序列

表3 SYBR Premix Ex Taq 配制熒光定量熒光定量PCR 反應(yīng)體系

1.2.2 Western blot 法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 取新鮮胎盤組織約50mg,用冷PBS 洗滌三次,加入500μl 裂解液，勻漿后12000rmp 離心10 min，收集上清液(總蛋白溶液)用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，于－80℃冰箱保存。10% 分離膠SDS-PAGE 電泳，120V轉(zhuǎn)膜75min，麗春紅染色，室溫下封閉1h，將轉(zhuǎn)印膜用預(yù)先稀釋好的—抗于40C 孵育過夜。然后用TBST 于室溫下脫色，搖床上洗三次，每次5min。用二抗(用TBST 稀釋3000 倍)孵育轉(zhuǎn)印膜30min(室溫)，然后在脫色搖床上用TBST 洗三次(室溫)，每次5min。ECL 化學(xué)發(fā)光1min，曝光顯示目的條帶，掃描儀掃描，保存數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用GraphPad Prism 5 軟件作圖。定量數(shù)據(jù)以表示，各組均數(shù)間比較，方差齊時(shí)采用t 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用近似t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)CASC2c及β-catenin mRNA的表達(dá)水平 ω-3 PUFA 組CASC2c mRNA 相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的1.166，P=0.0196，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；ω-3 PUFA 組β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的1.272，P=0.0110，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

2.2 Western blot 法檢測(cè)CASC2c和β-catenin蛋白表達(dá)水平 Western blot 分析可得，ω-3PUFAs 組CASC2c、β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量均較Control組顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。CASC2c蛋白高表達(dá)組明顯抑制β-catenin (*P<0.05)的表達(dá)，見圖2。

圖1 CASC2c和β-catenin mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

圖2 CASC2c對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的影響

3 討論

神經(jīng)管畸形(NTD)為胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的疾病，是一類嚴(yán)重的先天畸形，其發(fā)病率在新生兒中約占1/1000[1]。研究表明，NTD的發(fā)生與遺傳、環(huán)境均有關(guān)系。其中，多不飽和脂肪酸代謝調(diào)節(jié)紊亂是導(dǎo)致NTD 發(fā)生的最重要原因，尤其是ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA），但其功能目前尚不清楚[2]。Huang 等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ω-3-PUFA的攝入促進(jìn)了大鼠肝臟中Hcy 代謝通路關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)如CASC2c、MTHFR、MATla、CBS、GNMT、MTRR 等，并降低了血漿中Hcy的水平[3]。

本實(shí)驗(yàn)以ICR 小鼠為模型系統(tǒng)地研究了VPA及膳食脂肪酸的攝入對(duì)葉酸一Hcy 代謝通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)的影響。以往的研究表明，VPA對(duì)葉酸一Hcy 代謝具有抑制作用：Ubeda 等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明VPA 能夠升高血清中Hcy的水平，并能抑制MAT 酶(催化Met 轉(zhuǎn)化為SAM)的活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VPA 注射完成6h 或(和)24h 以后抑制了孕鼠肝臟中葉酸一Hcy的代謝中關(guān)鍵基因CASC2cm-RNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，這表明VPA的注射還可通過抑制葉酸-Hcy 代謝通路中以上基因的表達(dá)來阻礙Hcy的正常代謝。這些結(jié)果表明孕鼠腹腔注射VPA通過抑制孕鼠肝臟中葉酸Hcy 代謝通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)升高了胚胎中Hcy的水平進(jìn)而導(dǎo)致了胚胎NTD的發(fā)生。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明PUFA的攝入能夠顯著降低血液中Hcy的水平[4]。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)孕鼠橄欖油的攝入也能夠有效地阻止VPA對(duì)胚胎中Hcy的升高作用，ω-3-PUFA的攝入能夠升高葉酸-Hcy 代謝通路中關(guān)鍵基因(如CASC2c、CBS、MTRR 等)的mRNA和蛋白表達(dá)。以上研究結(jié)果表明ω-3-PUFA的攝入可能通過緩解VPA對(duì)孕鼠肝臟葉酸一Hcy 代謝通路中CASC2c、DHFR、MTRR、GAMT、CBS及CSE表達(dá)的抑制作用使胚胎中的Hcy水平維持正常水平進(jìn)而降低了胚胎中VPA 誘導(dǎo)的NTD的發(fā)病率。

近年的研究表明Hcy與胚胎的先天畸形密切相關(guān)。Felkner 等人在德克薩斯州一墨西哥邊境國(guó)家開展了一項(xiàng)病例對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血清中Hcy水平也與NTD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[5]。中國(guó)以及非洲國(guó)家的研究也觀察到了相似的結(jié)果[6,7]。然而關(guān)于Hcy是否能直接導(dǎo)致神經(jīng)管畸形的發(fā)生尚存在爭(zhēng)議。Greene 等人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明用Hcy 硫代內(nèi)酯培養(yǎng)小鼠胚胎并不能夠升高其NTD的發(fā)病率，這表明Hcy 可能不是直接誘導(dǎo)NTD的發(fā)生，生育NTD 胎兒的母親具有較高的Hcy水平可能只是Hcy 代謝紊亂的一種反映[8]。

誘發(fā)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡是高同型半胱氨酸血癥主要的致病機(jī)制之一,但其中的具體機(jī)制還不是非常清楚,有報(bào)道認(rèn)為高同型半胱氨酸血癥可以激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[9]。Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條在生物進(jìn)化中極為保守的通路。在正常的體細(xì)胞中,β-catenin 只是作為一種細(xì)胞骨架蛋白在胞膜處與E-cadherin 形成復(fù)合體對(duì)維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動(dòng)發(fā)揮作用。只有當(dāng)細(xì)胞外Wnt 信號(hào)分子與細(xì)胞膜上特異性受體Frizzled蛋白結(jié)合激活胞內(nèi)的dishevelled (散亂的)蛋白導(dǎo)致GSK3B 失活,使α-catenin 避免被磷酸化而遭降解的命運(yùn),β-catenin 才能在胞質(zhì)中積累起來。當(dāng)胞質(zhì)中β-catenin的濃度達(dá)到一定水平時(shí),就可向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。在胞核中β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子家族Tcf/Lefs 結(jié)合,可激活cyclinD1和cmyc 等原癌基因而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化、成熟。顯然，在這條信號(hào)通路中β-catenin 發(fā)揮了重要作用,其在胞質(zhì)中積累繼而向胞核的轉(zhuǎn)位,被認(rèn)為是該信號(hào)通路被激活的標(biāo)志。Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，該信號(hào)通路的失衡會(huì)導(dǎo)致許多疾病，如神經(jīng)管畸形，心臟發(fā)育畸形，神經(jīng)退行性疾病等。神經(jīng)管畸形是與高同型半胱氨酸血癥相關(guān)的一類出生缺陷，已有文獻(xiàn)報(bào)道高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致神經(jīng)管畸形的機(jī)制也誘發(fā)了氧化應(yīng)激，從而激活了在發(fā)育中起到重要作用的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路。近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。當(dāng)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，腦組織中NSCs 一直處于有絲分裂周期之內(nèi)，NSCs的數(shù)目也持續(xù)增加。Zhang 等對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠NSCs（NE-4C）進(jìn)行體外沖擊波治療（rESWT），后者激活了Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，隨后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過電刺激的小鼠NSCs 不斷增殖，并且一直處于未分化狀態(tài)[10]。Qi 等從SD 大鼠中分離NSCs，并且在含有0.3%氧氣的微氧培養(yǎng)系統(tǒng)中盡心培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在缺氧條件下，NSCs 內(nèi)β-catenin水平升高與NSCs 持續(xù)增殖呈正相關(guān)[11]。以上研究均證實(shí),Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可促進(jìn)NSCs 增殖,在NSCs 發(fā)育過程中扮演重要角色。最近又有研究報(bào)道提示該通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是作為神經(jīng)元細(xì)胞形成的開關(guān)，因此對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞的維持和增殖是重要的，特別是在神經(jīng)管畸形（NTD），預(yù)防出生缺陷的研究中具有重要意義[12,13]。

ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3-PUFA）屬于長(zhǎng)鏈脂肪酸的主要類別之一，是PPARs的潛在激活劑，Chang 等研究表明，肌肉中ω-3多不飽和脂肪酸富集增加了肌肉中的IMF 含量，影響脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)，還有證據(jù)表明ω-3多不飽和脂肪酸抑制細(xì)胞培養(yǎng)中的Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，誘導(dǎo)PPARs表達(dá)和Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)[14,15]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，VPA 能夠抑制孕鼠肝臟中PUFA的合成，并能造成肝臟及胚胎中葉酸一 Hcy 代謝通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的紊亂，進(jìn)而影響葉酸-Hcy的正常代謝。而ω-3-PUFA的攝入能有效緩解VPA 所引起的孕鼠肝臟及胚胎中葉酸-Hcy 代謝通路一系列基因mRNA和蛋白的表達(dá)紊亂，這表明PUFA的缺乏及葉酸一Hcy 代謝紊亂是導(dǎo)致NTD 發(fā)生的重要因素，而PUFA的攝入能夠通過彌補(bǔ)機(jī)體PUFA的不足及調(diào)控葉酸-Hcy的正常代謝預(yù)防NTD的發(fā)生。