奧貝膽酸關(guān)鍵中間體雜質(zhì)的設(shè)計(jì)與合成

魏 霞, 文小清, 母慧聰, 黃晴菲, 張 燕*, 王啟衛(wèi)1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.西華大學(xué) 理學(xué)院，四川 成都 610039)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)已成為全球第一大慢性肝臟疾病[1-6]。奧貝膽酸(商標(biāo)為Ocaliva)是一流的法尼類X受體(FXR)激動(dòng)劑，用于治療原發(fā)性膽汁肝硬化非酒精性脂肪性肝病的有效藥物，其市場(chǎng)價(jià)值巨大[7-9]。

化學(xué)藥物的雜質(zhì)是指存在于原料藥中，但化學(xué)結(jié)構(gòu)與原料藥不同的任何一種成分。藥品質(zhì)量的高低與人們的生命健康安全有著密切的關(guān)系。因此雜質(zhì)合成研究在藥物質(zhì)量研究控制中占有重要地位，需對(duì)原料藥進(jìn)行全面的雜質(zhì)譜研究和控制[10-15]。

本文以易得的3-α-乙?；?6-β-乙烯基-7-酮石膽酸甲酯為原料，先氫化制得中間體3-α-乙?；?6-β-乙基-7-酮石膽酸甲酯(6)[16]；在堿性條件下脫保護(hù)，同時(shí)6位乙基發(fā)生構(gòu)型翻轉(zhuǎn)得到中間體6-α-乙基-7-酮石膽酸(7)；如6-位不發(fā)生翻轉(zhuǎn)，產(chǎn)生中間體7的非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)6-β-乙基-7-酮石膽酸(A)；水解脫除保護(hù)基時(shí)，通過(guò)控制堿的濃度就可獲得具有不同構(gòu)型的6-位取代的化合物A和化合物7；再由化合物A和化合物7，經(jīng)酯化或者乙?；涂傻玫诫s質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D或雜質(zhì)E(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance-300 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker LC-QTOF型高分辨質(zhì)譜儀；Waters 515 型高效液相色譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)6-β-乙基-7-酮石膽酸(A)的合成

稱取中間體625.00 g(0.053 mol)，溶解于290 mL混合溶液(四氫呋喃/甲醇=1/1,V/V)中，完全溶解后，加入1 M NaOH水溶液100 mL，室溫下反應(yīng)2.5 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為3，用水(3×200 mL)洗滌，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V)純化得白色固體A17.8 g，收率81%，HPLC純度98.7%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.47(m, 1H), 2.47(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.27(m, 1H), 2.20～1.99(m, 2H), 1.96～1.81(m, 3H), 1.81～1.50(m, 7H), 1.37(m,J=9.0 Hz, 5.4 Hz, 4H), 1.25(m, 2H), 1.18～0.98(m, 7H), 0.86(d,J=6.3 Hz, 3H), 0.81～0.68(m, 3H), 0.60(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.40, 176.55, 70.15, 61.98, 54.69, 49.46, 48.55, 45.42, 42.70, 42.34, 39.84, 38.65, 35.67～34.74, 30.88, 29.32, 28.02, 26.43, 25.82, 24.77, 21.25, 18.21, 12.93, 11.94; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H42O4Na {[M+Na]+}441.2975, found 441.2964。

(2)6-β-乙基-7-酮-石膽酸甲酯(B)的合成

稱取A5.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL 甲醇中，完全溶解后，緩慢滴加3 mL濃硫酸至反應(yīng)液,室溫下反應(yīng)1 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗滌，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色泡沫狀固體B2.96 g，收率57%，HPLC純度99.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.65(s, 3H), 3.55(s, 1H), 2.55(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.35(m, 1H), 2.27～2.06(m, 1H), 2.04～1.85(m, 3H), 1.70(m, 8H), 1.54～1.23(m, 4H), 1.23～1.02(m, 4H), 0.91(d,J=6.2 Hz, 3H), 0.83(m, 3H), 0.66(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.46, 174.68, 70.62, 62.08, 54.78, 51.47, 49.59, 48.68, 45.56, 42.89, 42.50, 39.82, 38.79, 35.58, 35.34, 35.22, 31.03, 30.97, 29.55, 28.17, 26.59, 25.95, 24.90, 21.42, 18.33, 13.06, 12.08; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3118。

(3)3-α-乙?；?6-β-乙基-7-酮石膽酸(C)的合成

依次稱取A5.00 g(0.012 mol)，NaHCO320.00 g(0.238 mol)，乙酸酐20 mL(0.210 mol)溶解于200 mL 四氫呋喃中，65 ℃下回流攪拌12 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為5，用水(3×200 mL)洗滌，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色固體C1.82 g，收率33%，HPLC純度98.3%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 6.11(s, 2H), 4.65(m, 1H), 2.56(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.47～2.07(m, 3H), 2.06～1.87(m, 6H), 1.86～1.56(m, 7H), 1.56～1.02(m, 14H), 0.92(d,J=6.1 Hz, 4H), 0.84(q,J=6.2 Hz, 3H), 0.67(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.30, 179.87, 170.67, 72.80, 61.85, 54.82, 49.22, 48.65, 45.53, 42.93, 42.49, 38.77, 35.59, 35.24, 34.94, 31.32, 30.88, 29.68, 28.16, 26.50, 25.90, 25.72, 24.88, 21.46, 21.30, 18.34, 13.03, 12.10; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3070。

(4)6-α-乙基-7-酮-石膽酸甲酯(D)的合成

稱取中間體75.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL甲醇中，完全溶解后，緩慢滴加3 mL濃硫酸至反應(yīng)液,室溫下反應(yīng)1 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗滌，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色泡沫狀固體D2.95 g，收率33%，HPLC純度96.0%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.67～3.63(m, 3H), 3.52(m, 1H), 2.68(m, 1H), 2.41～2.27(m, 2H), 2.26～2.10(m, 2H), 2.01～1.87(m, 2H), 1.86～1.58(m, 10H), 1.51～1.27(m, 6H), 1.20(s, 6H), 1.17～1.04(m, 4H), 0.89(m, 5H), 0.80(m, 4H), 0.64(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ:212.72, 174.66, 71.15, 54.76, 51.98, 51.45, 50.66, 49.91, 48.96, 43.67, 42.63, 38.97, 35.66, 35.18, 34.24, 31.78, 31.02, 30.97, 29.85, 28.26, 24.59, 23.48, 21.84, 18.80, 18.33, 12.03, 11.95; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3145。

(5)3-α-乙?；?6-α-乙基-7-酮-石膽酸(E)的合成

依次稱取中間體7100 mg(0.239 mol), NaHCO30.4 g(0.005 mol)，乙酸酐0.4 mL(0.004 mol)，溶解于4 mL 四氫呋喃中，65 ℃下回流攪拌12 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)完全后蒸干溶劑，殘余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為5，用水(3×200 mL)洗滌，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸去溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得白色固體E34 mg，收率31%，HPLC純度98.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 8.51(s, 1H), 4.60(m, 1H), 2.67(q,J=6.3 Hz, 1H), 2.33(t,J=11.1 Hz, 2H), 2.17(m, 2H), 1.96(s, 5H), 1.89～1.55(m, 8H), 1.55～1.00(m, 16H), 0.98～0.70(m, 9H), 0.62(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 212.58, 180.00, 170.60, 73.18, 54.72, 51.90, 50.41, 49.82, 48.84, 43.58, 42.54, 38.84, 35.58, 35.10, 33.77, 31.26, 30.79, 28.17, 27.63, 25.87, 24.48, 23.39, 21.78, 21.23, 18.72, 18.25, 11.98, 11.93; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3073。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)型的確定

為了確定6-乙基立體構(gòu)型，對(duì)雜質(zhì)A(圖1)和中間體7(圖2)的1H NMR進(jìn)行了解析，兩個(gè)化合物8-H的化學(xué)位移由于受到化合物的立體結(jié)構(gòu)的影響，分別為δ2.47的三重峰以及δ2.68的四重峰。通過(guò)比較兩個(gè)化合物的立體結(jié)構(gòu)，中間體7的α型的乙基與羰基氧離得更近，易與羰基形成氫鍵，使8-H的化學(xué)位移向低場(chǎng)偏移。同時(shí)成功得到雜質(zhì)A的單晶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步確定了化合物結(jié)構(gòu)(圖3)，通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)可以看出，其6-乙基(C12和C13)為β構(gòu)型。得到的5個(gè)雜質(zhì)用HPLC進(jìn)行含量測(cè)定，并且在該HPLC條件下，5個(gè)雜質(zhì)能有效分離。

δ

δ

圖3 A的單晶衍射圖譜

2.2 堿的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)控制堿的濃度可獲得具有不同構(gòu)型的6-取代的化合物，在使用10 M 氫氧化鈉時(shí)，可以以100%的收率得到單一化合物7；在1 M NaOH 的條件下，可以獲得兩種構(gòu)型的6-取代的化合物(A/7=89/11)。

以易得的化合物5為原料，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的操作，合成了5個(gè)奧貝膽酸關(guān)鍵中間體雜質(zhì)。并通過(guò)HPLC確定了所有雜質(zhì)純度均在96%以上，為奧貝膽酸生產(chǎn)工藝的研究和質(zhì)量研究提供了更簡(jiǎn)單的雜質(zhì)制備策略。