云煙凈油有機(jī)膜分離成分中關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的關(guān)聯(lián)系分析

許春平，曲利利，杜歡哲，楊華武*

1 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136號(hào) 450002；

2 湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，長(zhǎng)沙市雨花區(qū)勞動(dòng)中路386號(hào) 410007

近年來(lái)國(guó)內(nèi)有一些學(xué)者采用相關(guān)性分析、聚類分析等對(duì)煙葉成分或煙氣成分與感官指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了一些探索[1-2]。劉善名等[3]研究了曬紅煙中致香物質(zhì)含量與感官評(píng)吸質(zhì)量的相關(guān)關(guān)系，研究結(jié)果表明β-大馬酮、3-羥基-二氫大馬酮等17種致香物質(zhì)與感官評(píng)吸質(zhì)量有正面效應(yīng)，異佛爾酮、2-乙基吡啶等5種致香物質(zhì)對(duì)感官評(píng)吸質(zhì)量有負(fù)面效應(yīng)。殷飛[4]采用PLSR等方法建立了清香型卷煙主流煙氣化學(xué)成分與感官指標(biāo)之間的相關(guān)性模型，結(jié)果表明清香與巨豆三烯酮呈顯著正相關(guān)關(guān)系，酸香與油酸呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，花香與丁烯酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系。采用膜分離加柱層析的方式對(duì)云煙凈油進(jìn)行處理，能有效降低了生產(chǎn)成本，縮短提取分離的時(shí)間，減少工藝過(guò)程中的能耗，且所得產(chǎn)品純度較高、加工性能較穩(wěn)定[5]。本研究擬通過(guò)GC-MS分析云煙凈油有機(jī)膜分離組分的香氣成分組成，計(jì)算ROAV值確定其關(guān)鍵香氣成分，進(jìn)行感官分析找出煙草關(guān)鍵香味成分與感官指標(biāo)間的關(guān)系，為卷煙增香和制備特征煙用香料提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

YC7659云煙凈油（上海祺源香精香料有限公司），無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），石油醚（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠），乙酸乙酯（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠），硅膠粉，薄層層析柱用硅膠H60型。

有機(jī)膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī)BONA-GM-22（博納生物），陶瓷膜分離實(shí)驗(yàn)機(jī)BONA-GM-18（博納生物），Agilent GC6890-MS5973N型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，（美國(guó)安捷倫科技有限公司），EYELAN-2100全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），硅膠薄層層析柱H60型（河南省予華儀器有限公司）玻璃柱：直徑5 cm，長(zhǎng)度60 cm，SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司），DLSB-5/10低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 膜分離

將乙醇稀釋后的云煙凈油過(guò)50 nm陶瓷膜去除固形顆粒雜質(zhì)，然后將50 nm陶瓷膜透過(guò)液過(guò)100 kDa有機(jī)膜，100 kDa有機(jī)膜截留液組分記為M1；100 kDa有機(jī)膜透過(guò)液組分記為M2，50 nm陶瓷膜透過(guò)液記為W。對(duì)截留液M1、透過(guò)液M2兩組分進(jìn)行柱層析分離。

1.2.2 柱層析分離

（1）樣品預(yù)處理。將100 kDa截留液M1、100 kDa透過(guò)液M2旋蒸濃縮，稱取5 g的M1和M2的濃縮物，分別加入1.5倍的硅膠粉，混勻，60℃水浴5小時(shí)烘干[6-8]。

（2）裝柱。采用硅膠粉干裝法，制備長(zhǎng)度45 cm，直徑5 cm的硅膠柱，將上述烘干后的樣品覆蓋于硅膠上部，再將少許的硅膠覆蓋于樣品之上，最后以棉花覆蓋。

（3）洗脫。分段收集洗脫劑及其配比見表1，洗脫液的流速10 mL/min，按表1的比例依次進(jìn)行洗脫，每組組分均取得4個(gè)柱體積，以便收集各段不同組分的樣品，將硅膠柱層析洗脫分離后得到的產(chǎn)物進(jìn)行旋蒸濃縮。

表1 過(guò)柱層析流程表Tab. 1 Flow chart of column chromatography

1.2.3 GC-MS分析

表2 GC-MS分析條件表Tab. 2 GC-MS analysis conditions

1.2.4 關(guān)鍵香氣成分的確定

劉登勇等[9]定義的一種通過(guò)閾值確定香味貢獻(xiàn)程度的新指標(biāo)——相對(duì)氣味活度值（ROAV），來(lái)確定樣品中的揮發(fā)性成分對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度。計(jì)算公式如下：

ROAVi≈（Ci/ Cmax×Tmax/ Ti）*100

式中，ROAVi為物質(zhì)i的相對(duì)香氣活性值；Ci為香氣成分的相對(duì)百分含量；Ti為香氣成分的香氣閾值；Cmax與Tmax為對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的組分的相對(duì)百分含量和氣味閾值；ROAV≥1的香味物質(zhì)被確定為關(guān)鍵香氣成分；0.1≤ROAV≤1的香味物質(zhì)被認(rèn)為對(duì)總體風(fēng)味有貢獻(xiàn)的香氣成分[10-11]。

1.2.5 主成分分析

采用主成分分析法在保留大部分原始信息的基礎(chǔ)上，對(duì)變量進(jìn)行降維，篩選出不同組分云煙精油的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[12]。

1.2.6 感官分析

將不同洗脫液比例下的流分45℃真空濃縮得到餾分濃縮物（1000 mL濃縮為5 mL左右），將餾分濃縮物按照0.2%的比例用香精注射機(jī)添加10 μL到未加香未加料的空白卷煙（湖南中煙提供）中，在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h后進(jìn)行感官評(píng)吸，取僅加等量乙醇的空白煙作對(duì)照。感官分析小組從清甜香、木香、花香、干草香、辛香5個(gè)香韻來(lái)定義樣品的感官屬性，感官特征的強(qiáng)度使用0～9的等級(jí)進(jìn)行評(píng)分，其中0 =無(wú)或不可察覺的強(qiáng)度，9=極高的強(qiáng)度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

利用多元偏最小二乘法比較關(guān)鍵香氣成分與感官指標(biāo)的關(guān)系，建立云煙凈油關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLS模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 云煙凈油有機(jī)膜分離組分的主成分分析

對(duì)截留液和透過(guò)液組分的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，得到兩組組分的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為100%和87.839%，根據(jù)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率高于85%的原則，提取截留液和透過(guò)液組分中前4個(gè)主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。

主成分載荷矩陣分析得出截留液的第1主成分中油酸乙酯，癸醛主成分載荷值較大，分別達(dá)到0.913和0.903；第2主成分中的二氫獼猴桃內(nèi)酯的載荷值較大，達(dá)到0.942；第3主成分中的4-叔丁基苯酚載荷值較大，達(dá)到0.909；總體上，第1、2、3主成分對(duì)香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)較大，而第4主成分相對(duì)貢獻(xiàn)較小。油酸乙酯、癸醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯的載荷值較高，推測(cè)這些物質(zhì)為關(guān)鍵香氣成分。

透過(guò)液的第1主成分中甲酸辛酯、正辛醛的主成分載荷值較大，分別達(dá)到0.944、0.954；第2主成分中壬醛的主成分載荷值最大；第3主成分中巨豆三烯酮的主成分載荷值最大，達(dá)到0.929；正辛醇、壬醛、巨豆三烯酮的載荷值較高，推測(cè)這些物質(zhì)為關(guān)鍵香氣成分。

2.2 有機(jī)膜分離組分的相對(duì)含量和ROAV值

GC-MS譜庫(kù)檢索采用NIST庫(kù)對(duì)截留液和透過(guò)液組分進(jìn)行檢索，從檢索結(jié)果中挑選正向、反向檢索匹配度均大于99%的致香成分[13]。

截留液共檢測(cè)出25種揮發(fā)性成分，主要包括酯類、酸類、醇類；相關(guān)研究在分析古井貢酒、梨酒、綠茶和雞蛋干的關(guān)鍵香氣組分中，由表3（a）可知，油酸乙酯、癸醛、壬醛、肉豆蔻醛、3,5-二叔丁基-4-羥基芐醇、苯并噻唑的ROAV大于1，確定這6種為關(guān)鍵香氣成分。

透過(guò)液共檢測(cè)出30種揮發(fā)性成分，主要包括酯類、酸類、醇類；ROAV用于評(píng)價(jià)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)香氣的貢獻(xiàn)，由表3（b）可知，癸醛，甲酸辛酯，正辛醛，壬醛，酞酸二甲酯，巨豆三烯酮的ROAV大于1，這6種應(yīng)為關(guān)鍵香氣成分。

表3 100 kDa有機(jī)膜組分的相對(duì)含量以及ROAV值[14-17]Tab. 3 Relative content of 100 kDa organic membrane retentate and ROAV value

續(xù)表3

續(xù)表3

與截留液相比，透過(guò)液組分中的揮發(fā)性成分種類和含量都較高，部分香味成分僅存在于透過(guò)液組分中，截留液中沒有檢出?？赡苁墙亓粢航M分中這些香味成分與某些含量高的香味成分的保留時(shí)間相近，色譜峰被高含量香味成分的色譜峰所掩蓋，導(dǎo)致截留液中未檢測(cè)出這些物質(zhì)[18]。

2.3 感官評(píng)價(jià)

由表4（a）、圖1（a）可得，石油醚-乙酸乙酯配比為2-1的組分中，木香，花香較明顯，在該組分中，3,5-二叔丁基-4-羥基芐醇的ROAV值大于1且相對(duì)含量較高是關(guān)鍵香氣成分，該組分具有木香，花香；在石油醚-乙酸乙酯配比為10-1的組分中，清甜香較明顯，花香，干草香稍有，苯并噻唑和壬醛的ROAV值均大于1且相對(duì)含量較高，該組分具有清甜香，花香，干草香；在石油醚-乙酸乙酯配比為20-1的組分中，清甜香，干草香，木香的香氣較明顯，花香和青香稍有，油酸乙酯，癸醛，壬醛，肉豆蔻醛的ROAV值均大于1，且含量較高，導(dǎo)致該組分具有清甜香，干草香，木香香氣。

圖1 100 kDa有機(jī)膜分離組分感官評(píng)析雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of 100 kDa organic membrane separation components

由表4（b）、圖1（b）可得，在石油醚-乙酸乙酯配比為10-1的組分中，青香，干草香稍有，癸醛和巨豆三烯酮的ROAV值均大于1且相對(duì)含量較高，為該組的關(guān)鍵香氣成分，該組分具有青香，干草香；在石油醚-乙酸乙酯配比為20-1的組分中，清甜香，辛香，木香的香氣較明顯，花香稍有，癸醛、壬醛的ROAV值均大于1且相對(duì)含量較高為該組的關(guān)鍵香氣成分，該組分具有清甜香，辛香，木香香氣。

表4 100 kDa有機(jī)膜組分感官評(píng)價(jià)表Tab. 4 Sensory evaluation table of 100 kDa organic membrane retentate

2.4 感官評(píng)價(jià)關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLS分析

以關(guān)鍵香氣成分的ROAV值為X變量，以感官屬性評(píng)分為Y變量進(jìn)行相關(guān)性分析，建立PLS模型如圖2所示。

圖2（a）顯示苯并噻唑，距清甜香，花香分布較遠(yuǎn)，不能作為特征香味物質(zhì)，主要呈香成分油酸乙酯與干草香、癸醛與青香分布在較近的區(qū)域，說(shuō)明它們之間相關(guān)性較強(qiáng)。且在本組中存在有二氫獼猴桃內(nèi)酯，由于無(wú)法查詢其具體的閾值，所以ROAV值為空白，但盧樂(lè)華[19]研究表明，二氫獼猴桃內(nèi)酯也是煙葉香氣的特征香氣成分。

圖2（b）顯示主要呈香成分巨豆三烯酮與青香味、壬醛與清甜香、癸醛與辛香分布在較近的區(qū)域，說(shuō)明它們之間相關(guān)性較強(qiáng)。

圖2 云煙凈油100 kDa有機(jī)膜分離組分的關(guān)鍵香氣成分與感官屬性的PLS相關(guān)性載荷圖Fig.2 PLS correlation load diagram of key aroma components and sensory attributes of 100 kDa organic membrane separation components of Virginia tobacco absolute

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS分析云煙凈油有機(jī)膜分離組分中的香氣成分組成，通過(guò)建立偏最小二乘回歸分析模型反映出關(guān)鍵香氣組分和香韻之間的關(guān)聯(lián)性（如油酸乙酯和干草香相關(guān)性較強(qiáng)；壬醛和清甜香相關(guān)性較強(qiáng)），該結(jié)論與主成分中所篩查出的關(guān)鍵香氣成分相互印證，所含香韻特征成分及分布與其感官評(píng)價(jià)結(jié)果吻合，為云煙凈油關(guān)鍵香氣成分的確定以及關(guān)鍵香氣成分與感官指標(biāo)的關(guān)系提供了相關(guān)科學(xué)依據(jù)。