三黃凝膠對耳郭痤瘡模型大鼠血清IL-17、IL-23水平的影響

李炳男，郭斐斐，劉 婧，牛凡紅，王思農

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

痤瘡是累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，好發(fā)于顏面部，青春期人群更為常見，嚴重程度不一[1-2]。臨床上常表現(xiàn)為不同程度的皮膚損傷，如黑頭或白頭粉刺、丘疹、膿皰、結節(jié)等，且易反復發(fā)作，愈后易遺留色素沉著或瘢痕[3]，這不僅影響美觀，還會對患者的心理、社交造成不良的影響[4]。目前西醫(yī)臨床治療痤瘡主要采用維A酸類和激素類等藥物,療效確切，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性、復發(fā)率高等問題。中醫(yī)藥的治療優(yōu)勢被越來越多的患者所認可，研究證實部分中藥有調節(jié)內分泌、抑制皮脂分泌、抗炎等作用[5]。本實驗觀察了三黃凝膠對耳郭痤瘡大鼠血清中白細胞介素-17(IL-17)、白細胞介素-23(IL-23)水平的影響，旨在探討三黃凝膠治療痤瘡的機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級Wistar大鼠50只，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗室提供，實驗動物許可證號:SYXK(甘)2005-001。常規(guī)飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗室動物房，給固定配方的標準飼料，自由進食進水，適應環(huán)境后開始實驗。實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(2019-116)。

1.2實驗藥物及試劑 三黃凝膠 (3.6 g生藥/10 g，窯街煤電集團有限公司總醫(yī)院， 批號：Z20160001)；0.025 %維A酸乳膏(商品名：迪維，重慶華邦制藥有限公司，國藥準字H50021817，規(guī)格：15 g/支)；煤焦油 (廣東恒健制藥有限公司提供，批號:H44024241)；大鼠血清ELISA IL-17和IL-23試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.3主要儀器 DW-8W118S低溫保存箱(無錫冠亞恒溫制冷技術有限公司)，iMark酶標儀(美國伯樂有限公司)，D3024R臺式離心機(美國SCILOGEX賽洛捷克)，DP72雙目倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，PRACTUM612-1CN電子天秤(德國) 。

1.4實驗方法 將 50只大鼠按體重由輕到重的順序依次編號，按隨機數(shù)表法隨機取8只作為空白組，剩余42只大鼠進行造模：在右耳內側面的耳導管開口處，約2 cm×2 cm的范圍，用玻璃棒涂煤焦油，每日1次，每次約0.5 mL，連續(xù)涂抹21 d，隔日于鼠耳皮下注射痤瘡丙酸桿菌菌液，每單耳0.1 mL。然后隨機抽取2只造模大鼠，取耳部痤瘡病變皮膚活檢，用10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色。參照痤瘡模型鏡下組織學觀察的判定分級標準[6]，以光鏡下皮膚角質層增厚，角栓堵塞、擴大呈壺狀，毛囊口漏斗部見中量角化物質提示大鼠耳郭痤瘡模型建成。將建模成功的40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，每組8只。模型組不予涂擦任何藥物；各干預組依據(jù)人與大鼠之間的用藥劑量等效換算公式計算給藥劑量，維A酸乳膏組給予0.025%維A酸乳膏5 g/(kg·d)右耳郭造模處涂擦，三黃凝膠低、中、高劑量組分別給予含生藥0.02 g/(kg·d)、0.04 g/(kg·d)、0.08 g/(kg·d)的三黃凝膠右耳郭造模處涂擦，均每天1次，連續(xù)4周。

1.5觀察指標及方法 造模和干預期間觀察各組大鼠耳部皮損情況。末次用藥24 h后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血5 mL，4 000 r/min離心5 min后取上清液，-80 ℃冰箱中備用，嚴格按照IL-17、IL-23的ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-17、IL-23水平。頸椎脫臼法處死大鼠，切取患處耳部組織，用10 %福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理情況。

2 結 果

2.1各組大鼠造模期間耳部皮損變化 空白組大鼠耳郭外觀呈淡紅色，可清晰地看到毛細血管的分布，觸之柔軟，無紅腫現(xiàn)象，內耳導管的開口處無角化物質分泌。各造模組大鼠造模結束后，耳郭皮膚色紅，伴有腫脹，觸之皮溫升高，可見明顯表皮增厚，且質地粗糙，有較嚴重的脫屑、痂皮癥狀，毛囊孔增大。

2.2各組大鼠干預期間耳部皮損變化 空白組大鼠與之前相同。模型組大鼠皮損未見明顯好轉。干預1周后，各干預組大鼠耳郭皮膚癥狀開始減輕，顏色較前變淡，觸之質地變軟，皮溫有所下降，表皮厚度變薄，部分痂皮也開始脫落。干預4周后，三黃凝膠低劑量組大鼠耳表皮增厚有所減輕，毛囊角栓和結節(jié)明顯減少，但仍有較多未治愈粉刺存在；三黃凝膠中劑量組大鼠耳表皮厚度正常，毛囊角栓和結節(jié)顯著減少，但仍有少量脫屑現(xiàn)象；三黃凝膠高劑量組大鼠耳皮膚顏色接近正常，皮溫正常，觸之質地柔軟、無腫脹，無脫屑及痂皮現(xiàn)象，基本恢復正常狀態(tài)；維A酸乳膏組大鼠皮損恢復狀態(tài)與三黃凝膠中劑量組相近。

2.3各組大鼠血清IL-17、IL-23水平比較 模型組大鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；各干預組大鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且三黃凝膠高劑量組均明顯低于維A酸乳膏組(P均<0.05)，三黃凝膠低、中劑量組與維A酸乳膏組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和耳郭痤瘡各組大鼠血清IL-17、IL-23水平比較

2.4各組大鼠耳組織病理學表現(xiàn) 光鏡下觀察，空白組大鼠耳組織結構清晰，細胞排列有序，表皮組織較薄，毛囊、皮脂腺清晰可見，角化無異常；模型組大鼠耳表皮組織增厚，皮脂腺增大，毛囊擴大成壺狀，同時致密的角化物質充滿了毛囊口和漏斗部；三黃凝膠低劑量組毛囊口擴張程度有所減輕，其內角化物疏松，炎性細胞較模型組減少；三黃凝膠中劑量組和維A酸乳膏組可見毛囊口擴張程度減輕，炎性細胞減少，表皮略微增厚；三黃凝膠高劑量組炎性細胞顯著減少，表面附有薄層角質層。見圖1。

圖1 正常組和耳郭痤瘡各組大鼠耳組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

3 討 論

痤瘡的病因尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學認為與皮膚的炎性反應密切相關[7-8]。Th17是誘導炎性發(fā)生的重要細胞，IL-17和IL-23是Th17細胞發(fā)揮作用的主要相關細胞因子，Th17細胞通過IL-23/IL-17炎癥軸，在自身免疫性疾病及炎性疾病中發(fā)揮重要作用[9-10]。IL-17 是T細胞誘導的炎性反應的早期啟動因子，能夠募集和激活單核細胞、中性粒細胞在炎性部位聚集[11]，增加細胞滲透性，并誘導炎性反應[12]。同時IL-17有強大的致炎性，可誘導其他促炎細胞因子和趨化因子的表達，并促進炎性級聯(lián)反應的發(fā)生和發(fā)展[13]，加重局部組織的炎性反應。IL-23是由活化的樹突狀細胞、巨噬細胞及單核細胞分泌的促炎因子[14]，可以通過誘導、驅動Th17細胞的分化，以產(chǎn)生IL-6、IL-17和IFN-γ，從而引起炎癥細胞因子的級聯(lián)反應[15-16]。IL-23本身還可以通過記憶T細胞的擴增產(chǎn)生大量巨噬細胞來促進單核細胞分化，與IL-1一起參與炎癥反應[17-18]。IL-17誘導、刺激產(chǎn)生的前炎性因子(IL-1、IL-6等)可進一步引起IL-23的過表達。因此，IL-17、IL-23可能在痤瘡的發(fā)病中起著重要作用。

中醫(yī)認為痤瘡可因素體陽熱偏盛，肺經(jīng)蘊熱，復受風邪，亦可由于后天失養(yǎng)，嗜食辛辣肥甘厚味，濕熱互結以及失眠熬夜、酗酒吸煙等不良生活習慣，導致肺胃火熱熏蒸顏面，誘發(fā)本病[19]。本實驗選用的三黃凝膠是在三黃膏的基礎上改變劑型得來的。三黃膏是治療痤瘡的傳統(tǒng)中醫(yī)外用制劑，主要組成有黃連、黃芩、黃柏、冰片、麻油和凡士林等。由于傳統(tǒng)加工工藝簡單，使之存在有效成分析出有限、吸收較慢、用藥后色素沉著的問題。因此，三黃凝膠新增具有美白功效的茯苓、白及、白芷等藥物，再結合現(xiàn)代制劑工藝，將卡波姆作基質并加入促透劑(月桂氮酮)、調節(jié)劑(三乙醇胺)，使之透皮吸收快、顯效快，色素沉著減少，更易涂抹，攜帶方便，更易被患者所接受。方中黃芩、黃柏、黃連為君藥，具有清熱解毒消腫的功效，且黃芩內含黃酮類物質，可以抑制炎性介質釋放[20]，從而達到抗炎的效果，黃芩苷可減輕細胞過多地分泌雄性激素，有效防止復發(fā)；黃連中的小檗堿成分有很好的抗菌活性，同時也能有效抑制急慢性炎癥[21]?？鄥ⅰ敋w、丹參為臣藥，苦參有祛風逐濕之功，能助三黃之藥效；丹參有涼血消腫、祛瘀祛瘢之功，且丹參有抑制真菌繁殖、減輕炎癥反應、促進組織修復與再生的作用[22]；當歸有活血養(yǎng)血之功，且化瘀而不傷血，還可增強機體的特異性及非特異性免疫功能[23]；白芷、白及、茯苓為佐藥，均具有消腫功效，同時白芷可抑制黑素細胞合成，減少色素沉著[24]；白及可作為天然的乳化劑，可誘導免疫調節(jié)因子的表達，白及膠漿有較強的抑菌作用，易在局部形成保護膜[25-26]；薄荷、冰片為使藥，能引藥直達病所，以助三黃散毒去瘡。全方共奏清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀之功。

本實驗結果顯示，痤瘡模型大鼠血清IL-17、IL-23水平明顯高于空白組，提示IL-17、IL-23在痤瘡的發(fā)病中起著重要作用。干預結束后，三黃凝膠低劑量組大鼠仍有較多未治愈粉刺，三黃凝膠中、高劑量組和維A酸乳膏組大鼠痤瘡皮損均明顯減輕，三黃凝膠高劑量組基本恢復正常且鏡下僅見少量炎性細胞；各干預組大鼠血清IL-17、IL-23水平均較模型組低，其中三黃凝膠高劑量組均明顯低于其他組。提示三黃凝膠可有效治療痤瘡， 推測其可能通過抑制IL-17、IL-23的分泌，控制炎性反應從而發(fā)揮作用，也說明通過抑制IL-17、IL-23治療痤瘡是可行的。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。