白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)自身免疫性肝損傷小鼠JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用研究

劉 鵬,胡陽(yáng)黔,曹扶勝,黃美松

(1. 國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院),湖北 十堰 442008；2. 十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

自身免疫性肝損傷是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身肝組織細(xì)胞及相關(guān)蛋白產(chǎn)生抗體，致使淋巴細(xì)胞攻擊自身肝組織細(xì)胞，進(jìn)而引起肝臟發(fā)生病理改變和功能障礙，臨床表現(xiàn)為食欲不振、疲乏無(wú)力等，隨著疾病進(jìn)展，可能并發(fā)腹水、黃疸、周圍水腫等。自身免疫性肝損傷以女性多見(jiàn)，發(fā)病年齡以15～24歲及45～64歲為主，呈雙峰形分布，目前已知的發(fā)病因素包括遺傳因素、感染及藥物因素等[1]。臨床中用于治療自身免疫性肝損傷的藥物有限，且表現(xiàn)出有效率低、復(fù)發(fā)率高等缺點(diǎn)[2]，所以臨床迫切需求新型抗自身免疫性肝損傷藥物。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)通路作為炎癥反應(yīng)的必要通路之一，近來(lái)被證實(shí)與自身免疫性肝損傷相關(guān)[3]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是從中藥材白術(shù)中提取、分離得到的藥物，其對(duì)于自身免疫性肝損傷具有一定保護(hù)作用，但研究資料較少。本實(shí)驗(yàn)基于JAK/STAT通路探討了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)自身免疫性肝損傷小鼠的作用，旨在進(jìn)一步明確白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的藥理作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性小鼠90只，6周齡，體重20～22 g，購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2020-0003。動(dòng)物均飼養(yǎng)在室溫(24±2)℃、相對(duì)濕度(50±5)%、光/暗周期12 h/12 h的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由攝食飲水。

1.2藥品與試劑 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，上海子起生物科技有限公司(貨號(hào)：ZRS00054)；醋酸潑尼松，天津力生制藥股份有限公司(批號(hào)：2019061121)；伴刀豆球蛋白A，香港JSENB公司(貨號(hào)：UEC5275)；組織蛋白裂解液，上海齊一生物科技有限公司(貨號(hào)：SH0653)；JAK2兔單克隆抗體、p- JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH兔多克隆抗體，山羊抗兔IgG抗體，賽默飛世爾科技有限公司(貨號(hào)：702434，710928，710077，44-384G，PA1-16777，A32731)；cDNA合成試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號(hào)：R211-01/02)；總RNA提取試劑盒，加拿大Norgen Biotek公司(貨號(hào)：19200)；熒光定量PCR試劑盒，百奧邁科生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：BK1010)；BCA蛋白法含量測(cè)試盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(貨號(hào)：KGPBCA)；過(guò)氧化氫酶(CAT) ELISA試劑盒，海振譽(yù)生物科技有限公司(貨號(hào)：CSB-E13439r-1)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx) ELISA試劑盒，本生健康科技有限公司(貨號(hào)：A-8534)；丙二醛(MDA) ELISA試劑盒，上海研生實(shí)業(yè)有限公司(貨號(hào)：YS-E8429)；髓過(guò)氧化物酶(MPO) ELISA試劑盒，上海恒斐生物科技有限公司(貨號(hào)：CSB-E08723m-1)；HE染色試劑盒，上海吉至生化科技有限公司(貨號(hào)：AG1120)；PCR引物設(shè)計(jì)與合成由基爾頓生物科技有限公司完成。

1.3設(shè)備及儀器 Omega Fluor 凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Aplegen公司；IX83全自動(dòng)熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；K3酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；HS-3315半自動(dòng)石蠟切片機(jī)購(gòu)自華速科技有限公司；Allegra X-15R臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER公司；BX-4000全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本SYSMEX公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將90只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝損傷組、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ低劑量組、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ中劑量組、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ高劑量組及潑尼松組，每組15只。正常對(duì)照組不造模，其余組小鼠參照文獻(xiàn)[4-5]方法，一次性尾靜脈注射20 mg/kg的伴刀豆球蛋白A，24 h后測(cè)定小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平并每組隨機(jī)取1只小鼠肝組織行HE染色，以小鼠血清ALT、AST、ALP水平較正常對(duì)照組小鼠升高2倍以上且肝組織發(fā)生病理學(xué)改變?yōu)樽陨砻庖咝愿螕p傷小鼠模型建立成功。證實(shí)造模成功后，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ低、中、高劑量組小鼠按照60 mg/kg、120 mg/kg、240 mg/kg的劑量灌胃白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，潑尼松組按照7.8 mg/kg的劑量灌胃醋酸潑尼松，正常對(duì)照組及肝損傷組灌胃等量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)21 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1肝功能指標(biāo) 末次灌胃24 h后，小鼠摘除眼球取血，離心保留血清，進(jìn)樣至全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT、AST、總膽紅素(TBil)、總膽汁酸(TBA)、ALP水平。

1.5.2肝組織病理學(xué)觀察 小鼠處死后，取小鼠肝組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋，行5 μm切片，常規(guī)HE染色后在光鏡下進(jìn)行觀察。

1.5.3肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 取小鼠肝組織勻漿液，分別使用相應(yīng)ELISA試劑盒測(cè)定各組小鼠肝組織中CAT、GPx、MDA、MPO水平。

1.5.4肝組織中JAK2、STAT3、IL-10、IL-21、IL-6 mRNA水平測(cè)定 使用總RNA提取試劑盒從小鼠肝臟中提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝組織中JAK2、STAT3、IL-10、IL-21、IL-6 mRNA表達(dá)水平，采用2-△△Ct法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量?；蛞镄蛄校篔AK2正向引物為5’-CAGACAAGAAGAGGTTGCC-3’，反向引物為5’-CGTCAGGCAGTTTGTATTGG-3’；STAT3正向引物為5’-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3’，反向引物為5’-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3’；IL-10正向引物為5’-CTTCTCACTGTCGACTAC-3’，反向引物為5’-GCGTCTCCTGTGCATTCG-3’；IL-21正向引物為5’-GAACCGGCACCTGACACC-3’，反向引物為5’-ACGACCTTCGTCAGTACCG-3’；IL-6正向引物為5’-GACAGCAAGATAGTAGGCC-3’，反向引物為5’-CGGAAGCTTCTTGTATGTGGG-3’；GAPDH正向引物為5’-GTCTGCCTTGGTAGTGGATAATG-3’，反向引物為5’-TCGAGGACGCCCTATCATGG-3’。

1.5.5肝組織中JAK2、p- JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平測(cè)定 取小鼠肝組織，加入含磷酸化酶抑制劑的組織蛋白裂解液研磨，離心分離上清，水浴煮沸變性并進(jìn)行蛋白定量，按照Western blot方法，取蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)JAK2、p- JAK2、STAT3、p-STAT3抗體孵育，再使用二抗孵育，在凝膠成像系統(tǒng)中成像，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、ALP水平比較 肝損傷組小鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、ALP水平均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)； 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組及潑尼松組小鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、ALP水平均明顯低于肝損傷組(P均<0.05)，且各指標(biāo)水平隨著白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ劑量的增加降低越明顯，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常對(duì)照組和自身免疫性肝損傷各組小鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、ALP水平比較

2.2各組小鼠肝組織病理表現(xiàn) 正常對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊、緊密，結(jié)構(gòu)正常；肝損傷組小鼠肝組織細(xì)胞嚴(yán)重空泡化，明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死、脫落，表明自身免疫性肝損傷模型小鼠建模成功；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組及潑尼松組小鼠肝組織空泡化、壞死明顯減少，肝臟病理改變明顯輕于肝損傷組。見(jiàn)圖1。

圖1 正常對(duì)照組和自身免疫性肝損傷各組小鼠肝組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組小鼠肝組織中CAT、GPx、MDA、MPO水平比較 肝損傷組小鼠肝組織中CAT、GPx水平均明顯低于正常對(duì)照組(P均<0.05)，MDA、MPO水平均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組及潑尼松組小鼠肝組織中CAT、GPx水平均明顯高于肝損傷組(P均<0.05)，MDA、MPO水平均明顯低于肝損傷組(P均<0.05)，且各指標(biāo)隨著白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ劑量的增加變化越明顯，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常對(duì)照組和自身免疫性肝損傷各組小鼠肝組織中CAT、GPx、MDA、MPO水平比較

2.4各組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、IL-10、IL-21、IL-6 mRNA表達(dá)水平比較 肝損傷組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、IL-21、IL-6 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組及潑尼松組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、IL-21、IL-6mRNA表達(dá)水平均明顯低于肝損傷組(P均<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯高于肝損傷組(P均<0.05)，且各指標(biāo)表達(dá)水平隨著白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ劑量的增加變化越明顯，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 正常對(duì)照組和自身免疫性肝損傷各組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、IL-10、IL-21、IL-6mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組小鼠肝組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較 肝損傷組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組小鼠肝組織中JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平均明顯低于肝損傷組(P均<0.05)，且各蛋白表達(dá)水平隨著白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ劑量的增加而逐漸降低，各劑量組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 正常對(duì)照組和自身免疫性肝損傷各組小鼠肝組織中JAK2、p- JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

自身免疫性肝損傷是由于機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂而導(dǎo)致的肝臟慢性炎癥反應(yīng)，以肝組織細(xì)胞炎性浸潤(rùn)、壞死為主要病理學(xué)表現(xiàn)，由于其發(fā)病機(jī)制及誘發(fā)因素尚不完全清楚，目前臨床主要采用緩解癥狀、改善肝功能等對(duì)癥治療[6]。潑尼松是臨床用于治療自身免疫性肝損傷的主要藥物，但其療效有限，且其作為一種全身性糖皮質(zhì)激素，長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、感染及心血管疾病等[7-8]，故研發(fā)安全有效的治療自身免疫性肝損傷的新型藥物迫在眉睫。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是從菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖中提取分離得到的單體化合物。郝延軍等[9]研究證實(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠通過(guò)提高唾液淀粉酶的活性，促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，進(jìn)而發(fā)揮其健脾的作用。體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠抑制胃癌、卵巢癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11]。王嫦鶴等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠通過(guò)降低肝酶水平、肝臟及脾臟指數(shù)，并抑制腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，提示白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在治療自身免疫性肝損傷疾病方面有巨大潛力。

ALT、AST、ALP 是反映肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)，肝組織損傷時(shí)，肝細(xì)胞破裂同時(shí)釋放出ALT、AST、ALP，這些指標(biāo)水平升高提示肝功能受損；TBil、TBA是反映肝臟對(duì)膽紅素和膽汁酸代謝能力的指標(biāo)，二者水平升高提示肝臟組織病理性改變且代謝功能下降[13]。CAT是主要存在于肝臟組織中的酶，具有抗氧化及抗損傷的作用；GPx是在肝臟細(xì)胞中含量較高的過(guò)氧化物分解酶，能夠降低組織細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物水平，保護(hù)肝細(xì)胞不受過(guò)氧化物損害；CAT及GPx水平降低提示肝細(xì)胞抗氧化損傷能力降低[14-15]。MDA為機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，可引起細(xì)胞氧化損傷；MPO為一種溶酶體酶，可通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其水平升高提示體內(nèi)炎癥加劇[16]。IL-21、IL-6、IL-10是調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)的重要因子，IL-21由T細(xì)胞分泌，可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化；IL-6由T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，有激活和增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用[17-18]；IL-10是免疫抑制因子，其能夠抑制抗原呈遞，下調(diào)T細(xì)胞及炎癥細(xì)胞活性[19]；在自身免疫性疾病中，IL-21、IL-6水平升高及IL-10水平降低均能夠加速疾病進(jìn)展[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組小鼠血清ALT、AST、TBil、TBA、ALP水平及肝組織中MDA、MPO水平和IL-21、IL-6 mRNA表達(dá)水平均明顯低于肝損傷組，肝組織中CAT、GPx水平及IL-10 mRNA表達(dá)水平均明顯高于肝損傷組。表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠修復(fù)自身免疫性肝損傷小鼠的肝損傷，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，有利于改善預(yù)后。

JAK/STAT通路是與炎癥因子釋放、細(xì)胞異常增殖和凋亡密切相關(guān)的通路，與炎癥性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[21]。在體內(nèi)，細(xì)胞因子與相關(guān)受體結(jié)合后，進(jìn)而與JAKs耦聯(lián)促進(jìn)酪氨酸磷酸化而使得JAKs被活化，活化后的JAKs催化受體本身磷酸化，并促使STATs通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合，形成二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[22]。王茜等[23]報(bào)道肝損傷大鼠體內(nèi)JAK/STAT通路被激活，p-JAK2及p-STAT3表達(dá)水平顯著升高，抑制大鼠肝組織JAK/STAT通路則能夠通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)而減輕炎癥反應(yīng)，改善大鼠肝功能。徐強(qiáng)等[24]報(bào)道在自身免疫性肝損傷小鼠體內(nèi)JAK/STAT通路同樣被激活，抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)則起到保護(hù)肝臟及抑制炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各劑量組小鼠肝組織中JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平及JAK2、STAT3、p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/ STAT3水平均明顯低于肝損傷組，提示白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)自身免疫性肝損傷的修復(fù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT通路相關(guān)。

綜上所述，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠改善自身免疫性肝損傷小鼠的肝功能，抑制肝組織氧化及炎癥損傷，其可能通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用。

致謝：感謝湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院洪城老師在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中提供的幫助！

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。