蓮子心飲片含量測定方法優(yōu)化

閆悅欣 梁思怡 紀勝男 李麗麗 哈婧

摘要：為了解決提取效率低而導致的市售蓮子心含量項鮮有合格的問題，對蓮子心飲片中有效成分的提取方法進行優(yōu)化。分別對蓮心堿的提取方式、提取溶劑以及提取溶劑體積進行了考察，利用優(yōu)化后的提取方法制備蓮子心飲片供試品溶液，選用Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm）色譜柱，以乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（體積比55∶44∶1）為流動相，在流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為284 nm，進樣量為10 μL條件下，進行含量測定。結(jié)果表明，最佳的提取條件為選擇25 mL 0.08%鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取40 min;優(yōu)化后的提取方法使蓮心堿的含量測定較穩(wěn)定，蓮心堿的提取效率得到顯著的提升;蓮心堿進樣量在36.9 ～ 369.5 ng時，線性關(guān)系良好，平均回收率為99.9%，RSD為1.79%。優(yōu)化后的提取方法操作簡便，提取率高，重復性好，方法準確，可為蓮心堿的提取以及后續(xù)蓮子心飲片質(zhì)量標準的制定提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：色譜分析;蓮子心飲片;蓮心堿;含量測定;高效液相色譜法

中圖分類號：O657.7+2文獻標識碼：ADOI：10.7535/hbgykj.2021yx04008

Optimization of the determination method of

Nelumbinis Plumula decoction pieces

YAN Yuexin1， LIANG Siyi1， JI Shengnan1， LI Lili2， HA Jing1

（1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China; 2. Hebei Yuzhilin Pharmaceutical Company Limited， Xingtai， Hebei 054400， China）

Abstract： In order to solve the problem of the low qualification rate of content detemination items of commercial Nelumbinis Plumula decoction pieces causing by the low extraction effciency of active ingredients，the extraction method of liensinine in Nelumbinis Plumula decoction pieces was optimized. The extraction method of liensinine， the extraction solvent， and the volume of the extraction solvent were investigated respectively， and the test solution of the Nelumbinis Plumula decoction pieces was prepared by using the optimized extraction method. The method was performed on Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm× 150 mm ） column with acetonitrile-0.05 mol/L sodium docecylsulfonate solution-glacial acetic acid （volume ratio 55∶44∶1） as the mobile phase. The content of liensinine in the Nelumbinis Plumula decoction pieces was determined under the conditions of the flow rate of 1.0 mL/min， the column temperature of 30 °C， the detection wavelength of 284 nm， and the injection volume of 10 μL. The results show that the best extraction conditions are 25 mL of 0.08% hydrochloric acid methanol solution as the extraction solvent， and ultrasonic extraction for 40 minutes. The optimized extraction method makes the content determination of liensinine more stable， and the extraction efficiency of liensinine is significantly improved. The liensinine has a good linear relationship in the injection range of 36.9 ～ 369.5 ng. The average recovery rate is 99.9%， and the RSD is 1.79%. The method is simple and accurate with the good reproducibility and high extraction rate， which can provide a reference for the extraction of liensinine and the formulation of the quality standards of Nelumbinis Plumula decoction pieces.

Keywords：chromatographic analysis; Nelumbinis Plumula decoction pieces; liensinine; content determination; high performance liquid chromatography（HPLC）

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbinis nucifera Gaertn.）成熟種子中的干燥幼葉及胚根[1]。蓮子心中含有生物堿類、黃酮類等多種化學成分，具有抗氧化、降血糖、保護心血管、促進脂肪分解等藥理活性[2-8]。蓮子心在中國資源豐富，主產(chǎn)于福建、湖南、江蘇等地[9-12]。采用《中華人民共和國藥典（2015年版 一部）》（以下簡稱《中國藥典》）蓮子心含量測定項下的方法，測定蓮子心飲片，市售飲片鮮有合格品，導致中藥臨床和制劑生產(chǎn)幾乎無蓮子心可用[13-15]。根據(jù)研究報道，多數(shù)蓮子心中蓮心堿含量達不到標準，可能是由于蓮心堿提取效率不夠高，但現(xiàn)有改進的蓮子心提取方法，其含量測定結(jié)果并不滿意[15]。本文通過考察合適的提取方式、提取溶劑以及提取溶劑體積，對《中國藥典》蓮子心含量測定項下方法中的提取方法進行優(yōu)化，提高飲片中蓮心堿的提取率。第4期閆悅欣，等：蓮子心飲片含量測定方法優(yōu)化河北工業(yè)科技第38卷

1儀器、藥品及試劑

1.1主要儀器

LC-10ATvp高效液相色譜儀，日本DHIMADZU公司提供;SQP十萬分之一電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司提供;DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司提供;KQ-250B超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司提供;FZ102萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司提供。

1.2試劑及藥品

蓮心堿高氯酸鹽對照品 （批號為111696-201703，純度≥96.3%，中國食品藥品檢定研究院提供），甲醇、乙腈 （色譜純，Sunrise Chem公司提供），十二烷基磺酸鈉、冰醋酸 （分析純，天津市永大化學試劑有限公司提供），蓮子心飲片 （樣品1產(chǎn)自中國浙江，樣品2產(chǎn)自中國福建，樣品3產(chǎn)自中國廣東，樣品4產(chǎn)自中國湖南，樣品5產(chǎn)自中國江蘇，樣品6產(chǎn)自中國湖北）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5-C18 （4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（體積比為55∶44∶1），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為284 nm，進樣量為10 μL。

2.2對照品溶液的制備

取蓮心堿高氯酸鹽對照品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液 （蓮心堿質(zhì)量=蓮心堿高氯酸鹽質(zhì)量/1.358 7）。

2.3供試品溶液的制備考察

2.3.1提取方式的比較

《中國藥典》中蓮子心含量測定項下的提取方法：以2%（體積分數(shù)，下同）鹽酸甲醇溶液為提取溶劑，水浴回流30 min。本試驗設(shè)定提取溶劑為2%鹽酸甲醇溶液，對水浴回流和超聲處理 （功率為250 W，頻率為40 kHz） 這2種方式的提取效果進行比較。

稱取樣品約0.5 g （過4號篩），精密稱定，平行6組，每組2份，加入2%鹽酸甲醇溶液25 mL，每組設(shè)定不同時間，分別用水浴回流、超聲處理 （功率為250 W，頻率為40 kHz） 提取樣品，然后放冷，稱重，補重，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，根據(jù)“2.1”項下的色譜條件，測定。結(jié)果2種方式提取出蓮心堿的含量接近，綜合蓮心堿的提取效率及提取時間，確定提取方式為超聲處理40 min，見表1（所用樣品為樣品4，產(chǎn)自中國湖南）。

2.3.2不同鹽酸含量的提取溶劑對蓮心堿提取效率的影響

精密取樣品約0.5 g （過4號篩），平行11組，每組2份，分別加入純甲醇和不同鹽酸含量的鹽酸甲醇溶液 （4%，2%，1%，0.8%，0.5%，0.2%，0.1%，0.09%，0.08%，0.07%）各25 mL，稱定重量，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），放冷，再稱定重量，補重，搖勻，濾過，其余試驗內(nèi)容按“2.3.1”項下步驟進行。

由含量測定結(jié)果可知，蓮心堿的提取效率與提取溶劑中鹽酸的含量有關(guān)，當鹽酸含量從4%逐漸降低至0.08%時，蓮心堿的含量逐漸升高，同時色譜圖的分離度也明顯改善，當鹽酸含量為0.07%時，蓮心堿的含量不再升高，當提取溶劑為純甲醇時，蓮心堿的含量降低。因此，適當降低提取溶劑中鹽酸的含量，有利于蓮心堿的提取以及色譜圖峰形的改善，含量測定結(jié)果及色譜圖見圖1和圖2。

2.3.3提取溶劑體積的考察

稱取樣品約0.5 g （過4號篩），精密稱定，平行3組，每組2份，分別加入不同體積 （15，25，40 mL） 0.08%鹽酸甲醇溶液，稱重，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），冷卻，稱定重量，補重，搖勻，濾過，其余試驗內(nèi)容按“2.3.1”項下步驟進行。由試驗結(jié)果可知，當提取溶劑的體積為25 mL時，蓮子心飲片中蓮心堿提取率達到最高并且穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

2.3.4供試品溶液的制備

通過優(yōu)化蓮子心飲片的提取條件，確定供試品溶液的制備方法：取樣品約0.5 g （過4號篩），加入0.08%鹽酸甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲處理40 min （功率為250 W，頻率為40 kHz），放冷，稱重，用0.08%鹽酸甲醇溶液補重，搖勻，濾過，精密取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4專屬性試驗

以0.08%鹽酸甲醇溶液為空白溶液，進行專屬性試驗，根據(jù)“2.1”項下的色譜條件，測定。結(jié)果說明空白溶液對蓮心堿的含量測定無干擾，見圖3。

2.5線性關(guān)系

按照“2.2”項下步驟制備對照品溶液，分別取對照品溶液2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀進行測定。結(jié)果蓮心堿進樣量為36.9 ～ 369.5 ng，線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=945.13x-67.854，R2=0.999 9，見圖4。

2.6精密度試驗

按照“2.2”項下步驟制備對照品溶液，取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示RSD為0.75% （n=6），表明儀器精密度良好，結(jié)果見表3。

2.7穩(wěn)定性試驗

根據(jù)“2.3.4”項下供試品溶液的制備方法，取蓮子心飲片，制備樣品溶液，每隔一定時間，進行測定。結(jié)果在24 h范圍內(nèi)，峰面積的穩(wěn)定性較好，RSD為0.32%，結(jié)果見表4。

2.8重復性試驗

按照“2.3.4”項下供試品溶液的制備方法，取蓮子心飲片，平行制備6份樣品溶液，測定。結(jié)果樣品中蓮心堿的平均含量（質(zhì)量分數(shù)，下同）為0.984 0 mg/g，RSD為0.39%，說明方法重現(xiàn)性較好，結(jié)果見表5。

2.9回收率試驗

精密稱取9份蓮子心飲片粉末，分別加入3種不同濃度的蓮心堿高氯酸鹽對照品溶液，每個濃度平行3份，各濃度對照品加入量與所取供試品含有量之比分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1。根據(jù)“2.3.4”項下供試品溶液的制備方法，制備樣品溶液，測定。結(jié)果加樣回收率的平均值為99.9%，RSD為1.79%，方法準確度較高，結(jié)果見表6。

2.10樣品含量測定

本實驗采用3種提取方法 （分別為《中國藥典》標準方法（簡稱藥典標準方法），文獻[14]中的方法（簡稱文獻方法），以及前述“2.3.4”項下供試品溶液的制備方法（簡稱改進后的方法），分別對不同產(chǎn)地的蓮子心樣品進行提取，然后根據(jù)不同方法下的色譜條件，分別進行含量測定。結(jié)果表明，改進后的方法使部分蓮子心飲片達到《中國藥典》中規(guī)定的含量限度，且該方法提取出蓮心堿的量高于藥典標準方法2.12倍，是文獻方法的1.25倍。因此說明，改進后的方法使蓮心堿的提取率得到一定程度的提升，見表7。

3討論

1）色譜條件的討論

為了更方便地將樣品續(xù)濾液被流動相稀釋，在藥典方法的基礎(chǔ)上，調(diào)整流動相的比例為乙腈-0.015 mol/L十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸（55∶44∶1），同時色譜圖峰形保持良好。十二烷基磺酸鈉易溶于熱水，因此在流動相配制過程中，將十二烷基磺酸鈉置于熱水（50 ℃ ）中溶解，制成0.015 mol/L的十二烷基磺酸鈉溶液，冷卻后觀察發(fā)現(xiàn)，當所處環(huán)境溫度低于30 ℃時，十二烷基磺酸鈉在水中易產(chǎn)生析出現(xiàn)象，因此建議在使用該流動相時，要注意嚴格控制室內(nèi)的溫度，且確保柱溫不低于30 ℃。

2）提取方法原因分析

采用水浴回流、超聲的提取方式，分別對蓮子心飲片進行提取，結(jié)果2種方式提取出蓮心堿的含量接近，從蓮心堿的提取效率及提取時間考慮，最終選擇提取方式為超聲提取40 min。蓮心堿易溶于甲醇，選擇甲醇為提取溶劑，同時蓮心堿又是一種雙芐基四氫異喹啉生物堿，加入適量的鹽酸，能夠提高提取效率。經(jīng)試驗條件篩選，當提取溶劑為0.08%的鹽酸甲醇溶液時，蓮心堿的提取效率最高。

3）蓮子心質(zhì)量標準的評價指標

蓮子心主要活性成分為生物堿類，其中蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿在總生物堿中占據(jù)較大比重，并且這3種生物堿都具有明確的藥理活性[16-24]。經(jīng)上述研究發(fā)現(xiàn)，改進后的方法使蓮子心飲片中蓮心堿的提取率得到顯著的提升，但仍有一部分飲片未能達到《中國藥典》中蓮子心項下規(guī)定的含量限度，因此僅以蓮心堿作為蓮子心飲片的評價指標，對于飲片的質(zhì)量評價是較片面的，在后續(xù)蓮子心飲片質(zhì)量標準的制訂中，建議將蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿的含量作為蓮子心飲片質(zhì)量評價的指標，從而使蓮子心飲片得到更全面的評價。

4結(jié)語

采用《中國藥典》蓮子心含量測定項下的方法，測定市售蓮子心飲片時，幾乎沒有合格品，因此以優(yōu)化含量測定項下供試品溶液的提取過程為研究方向，通過篩選供試品的提取方法、提取溶劑以及提取溶劑體積，確定了蓮子心飲片的最佳提取條件，對《中國藥典》中蓮子心含量測定項下的方法進行了優(yōu)化。采用優(yōu)化后的供試品溶液制備方法，對蓮子心飲片進行提取，根據(jù)調(diào)整后的色譜條件進行測定，結(jié)果優(yōu)化后的方法使蓮心堿的提取率得到顯著提升，但仍有部分飲片未達到《中國藥典》蓮子心項下的含量限度。查閱相關(guān)資料，得知《中國藥典》中蓮子心項下制定蓮心堿合格指標過高，市售飲片鮮有合格品。因此在后續(xù)對蓮子心飲片進行含量測定時，建議測定蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿的總量，以期使多數(shù)蓮子心飲片能夠符合藥用要求。

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