根皮素磷脂復(fù)合物的制備、表征及體內(nèi)外溶出行為評價(jià)

黃 珊，翟秉濤，楊 潔，鄒俊波，程江雪，張小飛，史亞軍，郭東艷

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 712046

根皮素（phloretin），化學(xué)名為2,4,6-三羥基-3-(4-羥基苯基)苯丙酮，是一種二氫查耳酮類的多酚化合物。主要分布于蘋果、荔枝等多汁水果的果皮及根皮中[1-2]。具有廣泛的生物活性，如抗氧化[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]等活性。此外，根皮素還具有美白保濕、延緩衰老等多種美容功效，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6]，但其溶解性差、生物利用度低嚴(yán)重限制了進(jìn)一步開發(fā)利用[7]。

磷脂復(fù)合物是指藥物與磷脂分子在非質(zhì)子溶劑中反應(yīng)所形成的穩(wěn)定化合物或絡(luò)合物，形成復(fù)合物后能改變藥物的理化性質(zhì)、增強(qiáng)皮膚和組織的滲透性，提高生物利用度，如咖啡酸磷脂復(fù)合物[8]、熊果苷磷脂復(fù)合物[9]。目前，對根皮素磷脂復(fù)合物（phloretin phospholipid complex，PHL-PC）的研究多集中在口服給藥，而關(guān)于經(jīng)皮給藥研究較少[10]。基于根皮素在抗炎、抗氧化方面的應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)擬采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化PHL-PC制備工藝，并對其理化性質(zhì)、經(jīng)皮滲透性及藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行考察，以期解決根皮素溶解性及經(jīng)皮滲透性差、生物利用度低的問題，為該原料的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會(huì)社；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Gene Speed X1型離心機(jī)，美國Gene Company；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海欣齊科學(xué)儀器有限公司；TP-6智能透皮擴(kuò)散儀，天津市精拓儀器科技有限公司；LC-2030CD3 PLUS島津高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；TESCAN-VEGA3鎢絲燈掃描電子顯微鏡（SEM），上海泰斯肯貿(mào)易有限公司；TAQ 2000差示掃描量熱儀（DSC），德國耐馳公司；Ultima IV普通X射線衍射儀（XRD），日本理學(xué)電機(jī)株式會(huì)社；TENSOR-27傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR），德國布魯克公司。

1.2 試藥

根皮素對照品，批號20180712，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；大豆卵磷脂，批號C11362919，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜級；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD雄性大鼠，體質(zhì)量（240±20）g；購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2020-030，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循陜西中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 PHL-PC的制備及復(fù)合率測定

稱取根皮素和大豆卵磷脂于圓底燒瓶中，加入無水乙醇作為復(fù)合溶劑，置恒溫磁力攪拌器攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。再加入氯仿復(fù)溶，濾過，收集濾渣干燥后稱定質(zhì)量。濾液經(jīng)減壓蒸干溶劑并真空干燥，即得PHL-PC。復(fù)合率計(jì)算公式如下。

M1為根皮素投藥量，M2為濾紙上殘留根皮素的質(zhì)量

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Shimadzu C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（45∶55）；柱溫30 ℃；檢測波長為280 nm；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。HPLC圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取根皮素對照品10 mg，加入色譜純甲醇溶解，定容至10 mL，得1 mg/mL根皮素對照品溶液。

圖1 根皮素對照品 (a) 及供試品 (b) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of phloretin reference substance (a) and test sample (b)

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取10 mg PHL-PC，加入10 mL色譜甲醇溶解，再精密吸取1 mL上述溶液，加色譜甲醇稀釋并定容至10 mL，得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液，用甲醇稀釋成20、40、60、80、100、120、200 μg/mL的系列對照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝45 072X＋48 436，r＝0.999 7，結(jié)果表明根皮素在20～200 μg/mL時(shí)，質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液（100 μg/mL），在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得根皮素峰面積的RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液6份，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算得根皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10 h，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得根皮素峰面積的RSD為0.29%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定的樣品9份，分為3組，分別加入相當(dāng)于樣品中根皮素含量80%、100%、120%的對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得平均加樣回收率為98.52%，RSD為2.64%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化PHL-PC制備工藝

根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇不同藥脂比（藥物與磷脂質(zhì)量比，X1）、藥物質(zhì)量濃度（X2）、反應(yīng)溫度（X3）作為考察因素，通過Design Expert 12分析軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以復(fù)合率（Y）為評價(jià)指標(biāo)篩選最佳工藝并進(jìn)行驗(yàn)證，各因素水平、試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面法因素水平、試驗(yàn)安排及結(jié)果Table 1 Experimental arrangement and results of Box-Behnken response surface method

以Y為響應(yīng)值進(jìn)行二次方程模型擬合，得出擬合方程Y＝92.54＋1.63X1－1.87X2＋1.57X3－1.20X1X2－2.35X1X3＋1.15X2X3－3.40X12－3.60X22－3.49X32，r2＝0.951 8，P＜0.001，對二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。由表2可知，模型的X1、X2、X3、X1X3、X12、X22、X32均具有顯著性，失擬性檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），表明該模型擬合程度良好，能較好地預(yù)測實(shí)際值。

根據(jù)二次回歸方程擬合結(jié)果，繪制響應(yīng)面的等高線圖和3D效應(yīng)曲面圖，結(jié)果見圖2。圖2可以直觀地反映2因素的交互作用對復(fù)合率的影響。由圖2可知，X1、X3因素的等高線圖呈橢圓形且其3D效應(yīng)曲面圖彎曲程度大，說明其交互作用強(qiáng)，為影響復(fù)合率的主要因素。

根據(jù)軟件預(yù)測的最佳工藝處方藥脂比為1.63，藥物質(zhì)量濃度為1.71 mg/mL，反應(yīng)溫度55.9 ℃。結(jié)合實(shí)際條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算復(fù)合率，結(jié)果見表3。表明該模型具有良好的預(yù)測性，且工藝穩(wěn)定可行。

2.4 PHL-PC的表征

2.4.1 SEM觀察 取適量樣品均勻涂布于鋁箔表面上，室溫下自然干燥，使用SEM觀察根皮素、大豆卵磷脂、物理混合物（physical mixture，PM）和PHL-PC的表面形態(tài)。結(jié)果如圖3所示，根皮素為細(xì)長的棒狀結(jié)構(gòu)，在PM中也保留了這種形態(tài)，但在PHL-PC中，并未出現(xiàn)根皮素的結(jié)構(gòu)。表明根皮素已高度分散在磷脂中，形成磷脂復(fù)合物。

表2 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Results of variance analysis

圖2 PHL-PC制備工藝中各因素交互作用的等高線圖和3D效應(yīng)面圖Fig.2 Contour map and 3D effect surface map of interaction of various factors in preparation process of PHL-PC

表3 最佳工藝制備下PHL-PC的復(fù)合率預(yù)測值及實(shí)驗(yàn)值( ±s,n = 3)Table 3 Predicted value and actual value of recombination rate of PHL-PC under optimum preparation process ( ±s,n = 3)

表3 最佳工藝制備下PHL-PC的復(fù)合率預(yù)測值及實(shí)驗(yàn)值( ±s,n = 3)Table 3 Predicted value and actual value of recombination rate of PHL-PC under optimum preparation process ( ±s,n = 3)

項(xiàng)目 X1 X2/(mg·mL-1) X3/℃ Y/% 預(yù)測值 1.63 1.71 55.9 93.09 實(shí)驗(yàn)值 1.6 1.7 56 93.80 1.6 1.7 56 95.60 1.6 1.7 56 93.50

圖3 根皮素 (a)、大豆卵磷脂 (b)、PM (c) 和PHL-PC (d) 的SEM圖Fig.3 SEM diagrams of phloretin (a),soybean lecithin (b),PM (c) and PHL-PC (d)

2.4.2 差示掃描量熱（DSC）法分析 采用DSC法研究根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC的熱性能。選擇30～350 ℃的溫度范圍，并在恒定氮?dú)饬飨乱?0 ℃/min的加熱速率掃描樣品。各樣品的 DSC曲線圖見圖4。從圖4可以看出，根皮素的熱圖在270 ℃左右顯示出1個(gè)明顯的吸熱峰，說明根皮素以結(jié)晶狀態(tài)存在。PM的熱圖中也在該位置出現(xiàn)了1個(gè)類似的根皮素峰，表明混合物分子間有微弱作用或完全沒有相互作用。但是與PM相比，PHL-PC的熱圖中，并未出現(xiàn)該峰，這可能是由于復(fù)合物中存在弱分子力引起的，說明根皮素失去了原有的結(jié)晶性，根皮素以分子或無定型狀態(tài)均勻的分散在磷脂復(fù)合物中。

圖4 根皮素 (a)、大豆卵磷脂 (b)、PM (c) 和PHL-PC (d) 的DSC圖Fig.4 DSC diagrams of phloretin (a),soybean lecithin (b),PM (c) and PHL-PC (d)

2.4.3 X射線衍射（XRD）法分析 通過XRD法研究磷脂復(fù)合物中根皮素的存在狀態(tài)。銅K輻射源 固定在40 kV和40 mA，掃描范圍2θ為10°～80°，掃描速度2°/min。根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC的XRD圖譜如圖5所示。根皮素和PM的圖譜中都在10°～30°出現(xiàn)強(qiáng)的衍射峰，表明PM中根皮素的形態(tài)和根皮素粉末中相同，仍以結(jié)晶狀態(tài)存在，但是，與PM相比，PHL-PC的圖譜中并沒出現(xiàn)該衍射峰。表明根皮素的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，根皮素以無定型態(tài)高度分散在磷脂中，形成磷脂復(fù)合物，這與DSC結(jié)果一致。

圖5 根皮素 (a)、大豆卵磷脂 (b)、PM (c) 和PHL-PC (d) 的XRD衍射圖Fig.5 XRD diagrams of phloretin (a),soybean lecithin (b),PM (c) and PHL-PC (d)

2.4.4 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）法 采用KBr壓片法研究各樣品的紅外吸收光譜。稱取適量根皮素、大豆卵磷脂、PM和PHL-PC，分別與KBr粉末按照1∶100的質(zhì)量比混合后壓片，在4000～400 cm-1波數(shù)處進(jìn)行FT-IR分析，結(jié)果如圖6所示。根皮素的譜圖中，特征峰為1634 cm-1（C＝O）；大豆卵磷脂的特征峰為1740 cm-1（C＝O）、1067 cm-1（P-O-C）；PM的譜圖為根皮素和大豆卵磷脂譜圖的簡單疊加，說明兩者只是混合，并未發(fā)生分子間作用；而在PHL-PC的圖譜中，根皮素的特征峰（C＝O）由1634 cm-1紅移至1606 cm-1且峰強(qiáng)顯著減弱，表明根皮素與大豆卵磷脂之間可能存在氫鍵締合，形成磷脂復(fù)合物。

2.5 平衡溶解度研究

稱取過量等量的根皮素和PHL-PC粉末（以根皮素含量計(jì)），各加入至5 mL蒸餾水或正辛醇中，37 ℃恒溫?fù)u床（100 r/min）震蕩24 h后，各取1 mL樣品，13 500 r/min離心10 min，上清液甲醇稀釋后進(jìn)樣測根皮素含量，計(jì)算溶解度，結(jié)果見表4。根皮素制成磷脂復(fù)合物后，在水和正辛醇中的溶解度分別提高到4.90、2.20倍。

圖6 根皮素 (a)、大豆卵磷脂 (b)、PM (c) 和PHL-PC (d) 的FTIR光譜圖Fig.6 FTIR spectra of phloretin (a),soybean lecithin (b),PM (c) and PHL-PC (d)

表4 根皮素和PHL-PC的溶解度 ( ±s,n = 3)Table 4 Solubility of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

表4 根皮素和PHL-PC的溶解度 ( ±s,n = 3)Table 4 Solubility of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

樣品 溶解度/(μg·mL-1) 蒸餾水 正辛醇 根皮素 72.13±0.35 729.44±0.67 PHL-PC 353.34±0.21 1 604.17±0.40

2.6 表觀油水分配系數(shù)（P）的測定

稱取適量等量根皮素和PHL-PC粉末（以根皮素含量計(jì)），分別加入2 mL油相（水過飽和的正辛醇）中，超聲溶解，5000 r/min離心10 min得油相溶液，定量稀釋后，進(jìn)樣測根皮素含量，記為C0，精密量取1 mL上述油相溶液，再加1 mL水相（正辛醇過飽和的水），37 ℃恒溫?fù)u床（100 r/min）震蕩24 h后，離心取上清液，甲醇定量稀釋后，進(jìn)樣測根皮素含量，記為C1。按照公式P＝C1/(C0－C1)（其中C0為正辛醇中藥物的初始含量，C1為分配平衡時(shí)藥物在油相中的含量，C0－C1為分配平衡時(shí)藥物在水相中的含量）計(jì)算油水分配系數(shù)。結(jié)果如表5所示，制成磷脂復(fù)合物后根皮素脂溶性明顯提高。

2.7 體外溶出度研究

精密稱取等量根皮素和PHL-PC，溶解于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中（以根皮素含量計(jì)，1 mg/mL）。精密吸取各溶液5 mL添加至透析袋中（截留相對分子質(zhì)量14 500），透析袋置于20 mL釋放介質(zhì)中，37 ℃恒溫?cái)嚢瑁?00 r/min）進(jìn)行體外溶出度試驗(yàn)。分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、24 h取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量溶出介質(zhì)。HPLC測根皮素含量，計(jì)算累積釋藥率（R）。

表5 根皮素和PHL-PC的P值 ( ±s,n = 3)Table 5 P values of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

表5 根皮素和PHL-PC的P值 ( ±s,n = 3)Table 5 P values of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

樣品 P lgP 根皮素 17.78±1.26 1.22±0.03 PHL-PC 107.98±2.09 2.03±0.01

Cn代表第n個(gè)取樣點(diǎn)根皮素質(zhì)量濃度，Ci代表當(dāng)前取樣點(diǎn)之前的各取樣點(diǎn)質(zhì)量濃度，V和Vs分別代表釋放介質(zhì)體積和取樣體積，Q0代表根皮素的初始量

根皮素和PHL-PC累積釋放曲線如圖7所示，根皮素及PHL-PC的累積釋藥率在24 h分別達(dá)到72.07%和86.34%，表明復(fù)合物的體外溶出性明顯優(yōu)于根皮素，這可能是因?yàn)榱字瑥?fù)合物具有兩親性，加速了根皮素的溶出。

圖7 根皮素和PHL-PC體外累積釋放曲線 ( ±s,n = 3)Fig.7 In vitro release curve of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

2.8 PHL-PC的經(jīng)皮滲透性考察

2.8.1 離體鼠皮的制備 大鼠處死，腹部脫毛后取皮膚，去除皮下組織和脂肪，選取無破損皮膚浸泡于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前仔細(xì)檢查鼠皮是否損傷，以確保皮膚完整性。

2.8.2 藥物溶液的制備 稱取等量的根皮素和PHL-PC（以根皮素含量計(jì)），溶解于pH 7.4的PBS介質(zhì)中，制成2 mg/mL的供試液，用于透皮實(shí)驗(yàn)。

2.8.3 皮膚滲透實(shí)驗(yàn) 使用Franz擴(kuò)散池研究PHL-PC的體外皮膚滲透。大鼠皮水平放置，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池。以pH 7.4的PBS為接收介質(zhì)，在接收室內(nèi)加入磁子持續(xù)磁力攪拌24 h以確保藥物分散均勻，將擴(kuò)散池置于恒溫磁力攪拌器上，固定轉(zhuǎn)速350 r/min，37 ℃水浴加熱，平衡30 min。將供試液（1 mL）分別添加到各供給池內(nèi)，并用封口膜覆蓋，以避免蒸發(fā)。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h吸取0.5 mL的接收液，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮接收液。精密吸取100 μL接收液，加200 μL甲醇，4000 r/min離心10 min，取上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定峰面積，計(jì)算接收液中根皮素含量，并根據(jù)下式計(jì)算累積滲透量（Qn）。

Cn、Ci分別代表接收介質(zhì)中第n、i時(shí)測得的根皮素質(zhì)量濃度，A為有效擴(kuò)散面積（0.785 cm2），V和Vi分別代表接收池體積（15 mL）和取樣體積（0.5 mL）

根皮素和PHL-PC的經(jīng)皮滲透曲線如圖8所示，24 h后，根皮素和復(fù)合物的Qn分別為16.97、35.02 μg/cm2。結(jié)果表明制成磷脂復(fù)合物顯著提高了根皮素在皮膚中的Qn，改善經(jīng)皮滲透性能。

圖8 根皮素和PHL-PC經(jīng)皮滲透曲線 ( ±s,n = 3)Fig.8 Transcutaneous permeation curve of phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 3)

2.9 藥動(dòng)學(xué)研究

2.9.1 分析方法的建立

（1）色譜條件：同“2.2.1”項(xiàng)下。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：精密稱取根皮素對照品10 mg，置于100 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，制備100 μg/mL的根皮素對照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：將“2.9.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白血漿逐級稀釋，使得根皮素終濃度為10 000、5000、1000、500、250、50、25、5 ng/mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）專屬性：通過比較空白血漿、根皮素標(biāo)準(zhǔn)工作液及血漿樣品的譜圖，發(fā)現(xiàn)血漿對根皮素的檢測未發(fā)生干擾，結(jié)果如圖9所示，表明該方法的專屬性良好。

圖9 空白血漿加根皮素對照品(a)、樣品 (b)、空白血漿 (c) 的HPLC圖Fig.9 HPLC of blank plasma (a),sample (b),and blank plasma spike (c)

（5）線性關(guān)系考察：取“2.9.3”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，加入600 μL甲醇渦旋混勻，離心吸取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.9.1”項(xiàng)下方法測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝7.540 5X＋635.79，r＝0.999 8。結(jié)果表明，根皮素在25～10 000 ng/mL，質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

（6）精密度試驗(yàn)：取低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品（50、500、5000 ng/mL），分別測定日內(nèi)和日間精密度，計(jì)算得日內(nèi)RSD均＜1.71%，日間RSD均＜6.03%，表明根皮素在所測范圍內(nèi)精密度良好。

（7）提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)：低、中、高質(zhì)量濃度（50、500、5000 ng/mL）樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為92.68%、92.44%、94.05%，RSD值分別為5.24%、6.46%、5.31%；提取回收率分別為89.77%、88.99%、87.25%，RSD值分別為5.21%、6.47%、5.54%?；|(zhì)效應(yīng)均＞90%，提取回收率均＞80%，表明該方法符合生物樣品檢測要求。

2.9.2 經(jīng)皮給藥供試品制備 精密稱取一定量等量的根皮素和PHL-PC粉末，分別加入PBS重新分散后，加入適量的卡波姆934，使卡波姆最終含量為1%，磁力攪拌溶脹過夜使成凝膠狀，即得。

2.9.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) SD雄性大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。隨機(jī)分為2組，每組6只，分別為根皮素組和PHL-PC組。大鼠背部脫毛面積為5 cm×5 cm，一組涂抹根皮素凝膠，另一組涂抹等劑量的PHL-PC凝膠（100 mg/kg，以根皮素含量計(jì)）。給藥后于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h眼眶采血，置于肝素鈉抗凝離心管中。高速冷凍離心15 min（13 500 r/min、4 ℃），吸取上清血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.9.4 血漿樣品的處理 精密吸取血漿樣品200 μL，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻后，13 500 r/min離心15 min。吸取上清液0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.9.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。

2.9.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 藥-時(shí)曲線見圖10，采用DAS 3.2藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，與根皮素相比，復(fù)合物的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05），t1/2與tmax延長，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與根皮素相比，復(fù)合物的AUC0～∞為12.07 μg·h/mL，是根皮素的2.15倍，表明制成磷脂復(fù)合物后不僅延長了藥物作用時(shí)間且顯著提高根皮素的生物利用度。

3 討論

圖10 根皮素和PHL-PC的藥-時(shí)曲線圖 ( ±s,n = 6)Fig.10 Concentration-time curves for phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 6)

表6 根皮素和PHL-PC的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) ( ±s,n = 6)Table 6 Pharmacokinetic parameters for phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 6)

表6 根皮素和PHL-PC的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) ( ±s,n = 6)Table 6 Pharmacokinetic parameters for phloretin and PHL-PC ( ±s,n = 6)

與根皮素組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs phloretin group

參數(shù) 單位 根皮素 PHL-PC t1/2 h 7.40±2.54 10.52±4.66 tmax h 1.33±0.75 1.42±0.66 Cmax μg·mL-1 0.42±0.10 0.69±0.09** AUC0～t μg·h·mL-1 4.41±2.35 8.94±3.74* AUC0～∞ μg·h·mL-1 5.61±2.08 12.07±5.91*

實(shí)驗(yàn)室前期對復(fù)合溶劑、藥脂比、藥物濃度、復(fù)合時(shí)間及復(fù)合溫度進(jìn)行了單因素考察，最終篩選出對復(fù)合率影響最大的3個(gè)因素：藥脂比、藥物濃 度和復(fù)合溫度進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法分析優(yōu)化最佳制備工藝條件。在制備過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇作為反應(yīng)溶劑的復(fù)合率較高且具有無毒、成本低等優(yōu)點(diǎn)；反應(yīng)溫度在55 ℃復(fù)合率最高，60 ℃時(shí)復(fù)合率有所下降，這可能與磷脂在60 ℃以上不穩(wěn)定、易氧化有關(guān)；隨著藥脂比和藥物濃度的增大，復(fù)合率呈先增高再降低，這可能是由于隨著磷脂用量或藥物濃度的增大，溶液呈現(xiàn)過飽和狀態(tài)，復(fù)合率又下降[11-12]。接著，為了考察各因素之間交互作用對復(fù)合率的影響，通過最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)精準(zhǔn)獲取因素與效應(yīng)之間的關(guān)系，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)選的制備工藝為藥脂比為1.6∶1、藥物質(zhì)量濃度為1.7 mg/mL、反應(yīng)溫度為56 ℃。

通過SEM、DSC、XRD和FT-IR對PHL-PC進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物中并未形成新的化學(xué)鍵，磷脂復(fù)合物的形成是由于根皮素分子與磷脂的極性末端存在弱的分子間作用力所致，根皮素以無定形狀態(tài)分散于復(fù)合物中。無定形狀態(tài)是一種高能無序狀態(tài)，具有溶解度高和溶出速率快的優(yōu)點(diǎn)，通常用來改善藥物溶解性，提高生物利用度[13]。本實(shí)驗(yàn)根皮素制成磷脂復(fù)合物后，根皮素在水和正辛醇中的溶解度得到了改善，生物利用度提高。

藥物經(jīng)皮滲透經(jīng)過2個(gè)階段，首先通過角質(zhì)層，再經(jīng)活性表皮層繼而被吸收。角質(zhì)層為親脂性，脂溶性藥物易通過；活性表皮層為水性組織，水溶性藥物易透過，因此，藥物既需要有一定脂溶性又需要一定水溶性才能用于經(jīng)皮滲透[14-15]。油水分配系數(shù)（lgP）作為藥物理化性質(zhì)和滲透性的重要參數(shù)，在藥物透過生物膜過程中具有關(guān)鍵作用，lgP值越大，說明該物質(zhì)越親油，反之，越小，則越親水，即水溶性越好[16]。一般認(rèn)為，lgP＜-2，化合物為親水性，不能穿過脂質(zhì)膜；lgP＞3，化合物因脂溶性太強(qiáng)而難以從細(xì)胞膜一側(cè)釋放出來。有文獻(xiàn)表明[17]，藥物透皮給藥的最佳lgP值為2～3。根皮素制成磷脂復(fù)合物后，lgP值由1.22增加到2.03，顯著改善了根皮素的脂溶性。經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明將根皮素制成磷脂復(fù)合物既提高水溶性又提高脂溶性，顯著增加其累積透皮吸收量。

根皮素由于具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老作用，在藥品及化妝品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前根皮素經(jīng)皮給藥制劑主要有根皮素微乳及微乳凝膠劑[18]等，但是發(fā)現(xiàn)其研究大多為制備工藝，未見經(jīng)皮滲透及藥動(dòng)學(xué)特征的相關(guān)研究。凝膠劑具有生物相容性好、黏附性好及對皮膚和黏膜無刺激性且易于經(jīng)皮給藥的優(yōu)點(diǎn)[19]，因此，實(shí)驗(yàn)中將根皮素和PHL-PC制成凝膠劑經(jīng)皮給藥，對比研究其藥動(dòng)學(xué)特性。藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，與根皮素相比，制成磷脂復(fù)合物可以顯著提高其生物利用度。有關(guān)磷脂復(fù)合物是否為根皮素經(jīng)皮給藥的最佳載藥形式，后續(xù)有必要進(jìn)一步開展磷脂復(fù)合物與其他載藥形式的比較研究，為今后開發(fā)根皮素經(jīng)皮給藥制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突