基于臨床療效的注射用益氣復(fù)脈（凍干）質(zhì)量標(biāo)志物確證

張 磊，蘇小琴，李德坤，岳洪水，鞠愛春，楊 峰，侯 穎，張鐵軍，劉昌孝*

1.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300410

2.天津市中藥注射劑安全性評價企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410

3.天津藥物研究院，天津 300462

中醫(yī)藥是我國獨(dú)特的醫(yī)療資源，是國民健康體系的重要組成部分，對我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展意義重大。構(gòu)建科學(xué)的中藥質(zhì)量研究模式，挖掘與臨床療效緊密結(jié)合的物質(zhì)基礎(chǔ)，形成更加合理的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。劉昌孝院士[1]于2016年提出“中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，QMarker）”的創(chuàng)新概念，并對其科學(xué)內(nèi)涵及方法學(xué)做了系統(tǒng)性闡述[2-4]。中藥Q-Marker是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品（如中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑）中固有的或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制[1]。中藥Q-Marker理念的提出，開創(chuàng)了中藥質(zhì)量研究新模式，將藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與中藥生物屬性、配伍理論等自身醫(yī)藥體系特點(diǎn)深度融合，強(qiáng)化了中藥有效性-物質(zhì)基礎(chǔ)-質(zhì)量控制指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度。在中藥Q-Marker理論及其方法學(xué)指導(dǎo)下，國內(nèi)學(xué)者對不同中藥材及復(fù)方制劑開展了系統(tǒng)性的質(zhì)量研究[5-8]。

注射用益氣復(fù)脈（凍干）（Yiqi Fumai Lyophilized Injection，YQFM）是由紅參、麥冬及五味子為原藥材，采用現(xiàn)代工藝精制而成的中藥凍干粉針劑。其功效為益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津，臨床上用于冠心病勞累型心絞痛氣陰兩虛癥以及冠心病所致慢性心衰的治療。前期工作基于中藥Q-Marker理論體系，采用藥效學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、藥動學(xué)及藥性等方法，初步預(yù)測分析了YQFM中的13個Q-Marker，并建立了全程質(zhì)量控制體系[9]。為了使建立的Q-Marker更好地控制制劑質(zhì)量，本文在前期研究基礎(chǔ)上，從YQFM的臨床研究入手，探索YQFM的Q-Marker與臨床有效性之間的關(guān)系，分析Q-Marker在YQFM臨床療效中的潛在作用，進(jìn)一步完善YQFM的QMarker體系。

1 YQFM中的Q-Marker

YQFM是典型的中藥復(fù)方制劑，化學(xué)成分復(fù)雜。前期工作對YQFM的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)開展了系統(tǒng)性研究，結(jié)果顯示YQFM的化學(xué)成分主要包括糖類、皂苷類、木脂素類等。周垚垚等[10]采用超高效液相四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)對YQFM進(jìn)行化學(xué)成分全解析，鑒定出145個化合物，其中有26個藥效成分為首次檢出，包括17個黃酮類化合物、4個麥冬皂苷類化合物以及5個木脂素類化合物。Liu等[11]采用超快速液相色譜串聯(lián)離子阱-飛行時間質(zhì)譜（UFLC-IT-TOF/MS）技術(shù)解析了YQFM所含的人參皂苷類、木脂素類、麥冬皂苷類、高異黃酮類等成分，最終鑒定出非糖類成分65個，包括來自紅參藥材成分42個、五味子藥材成分16個以及麥冬藥材成分7個，并對其中21個化合物完成了定量分析。李莉等[12]采用高效液相色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）技術(shù)，開展YQFM中鈉元素研究，并對鈉元素成分完成了定量分析。通過上述一系列工作，基本明確了YQFM的化學(xué)成分，為進(jìn)一步開展制劑Q-Marker的研究提供了條件。

在化學(xué)成分研究基礎(chǔ)之上，以中藥Q-Marker理論及方法為指導(dǎo)，采用中藥藥性學(xué)、藥效學(xué)、電子舌技術(shù)以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法，對YQFM的QMarker開展了預(yù)測分析研究[9]。最終確定8種人參皂苷類（人參皂苷Rb1、Rg1、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Ro、Rg3）、3種麥冬皂苷類[麥冬皂苷C、麥冬苷元- 3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷]以及果糖和五味子醇甲共13個化學(xué)成分為YQFM的Q-Marker，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

2 YQFM的藥理作用和臨床應(yīng)用

根據(jù)中醫(yī)藥傳統(tǒng)藥性配伍理論，YQFM方中人參為君藥，大補(bǔ)元?dú)?，益肺、生津止渴；麥冬為臣藥，甘寒養(yǎng)陰、清熱生津，人參、麥冬配伍，發(fā)揮益氣養(yǎng)陰之功效。佐以五味子，具有酸收、斂陰止汗之功效，與人參、麥冬配伍，起到補(bǔ)固正氣與收斂陰津的作用[13]。YQFM在現(xiàn)代臨床上主要用于慢性心力衰竭、冠心病心絞痛等心血管疾病的治療。

為了明確YQFM所含Q-Marker與臨床療效之間的關(guān)系，需要對YQFM的藥效學(xué)、藥理機(jī)制以及臨床有效性開展系統(tǒng)性研究。近年來，圍繞YQFM的藥理作用和臨床應(yīng)用內(nèi)容較為集中，主要針對心血管系統(tǒng)的影響，包括抗心肌缺血、抗心肌缺氧損傷、抗心衰等的治療。

圖1 YQFM中Q-Marker的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of Q-Marker in YQFM

2.1 YQFM的藥理作用

在YQFM治療心力衰竭機(jī)制的研究方面，Xing等[14]建立大鼠冠狀動脈結(jié)扎慢性心衰模型，考察了YQFM對心臟收縮功能和炎癥介質(zhì)水平的影響。研究證明YQFM能夠引起心電圖ST段的明顯下降，降低血漿腦鈉肽（brain-type natriuretic peptide，BNP）水平，抑制血清以及心肌組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β等炎癥因子的釋放。慢性心衰大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增生、膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）系統(tǒng)活性增強(qiáng)有關(guān)[15]。張秋月等[15]研究了YQFM對心肌MMP及其組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，YQFM能夠降低MMP-2、MMP-9、MMP-3的含量，升高TIMP1和TIMP-2水平，維持MMP-2/TIMP-2的動態(tài)平衡，從而改善慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的程度，緩解大鼠慢性心衰癥狀。在一項(xiàng)YQFM對心功能及心力衰竭標(biāo)志物影響的研究中發(fā)現(xiàn)，YQFM對改善心衰模型大鼠心功能和心室重塑方面有顯著療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，YQFM能夠提高心衰大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）、縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S），降低左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVDs），增加收縮末左室后壁厚度。推測其機(jī)制可能與減少心肌纖維化和抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活作用有關(guān)[16]。此外，YQFM能夠改善心衰小鼠的左心結(jié)構(gòu)和功能，降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶、丙二醛、腦自然肽氨基端前體蛋白（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide，NT-proBNP）和尿羥脯氨酸的含量，從而減輕心肌組織的損傷以及膠原沉積和纖維化，推測其與抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路的磷酸化有關(guān)[17]。Yuan等[18]采用冠狀動脈永久結(jié)扎建立小鼠慢性心力衰竭模型，YQFM干預(yù)治療14 d，采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)篩選小鼠血漿和尿液樣本的內(nèi)源性代謝物。結(jié)果表明，YQFM治療改變了慢性心力衰竭的代謝模式，調(diào)節(jié)了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、?；撬岷痛闻；撬岬拇x、組氨酸的代謝和精氨酸的生物合成等。

采用小鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎誘導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷模型研究顯示，YQFM能夠有效改善缺血再灌注造成的小鼠心肌損傷，降低心臟梗死面積、提高LVEF和FS；顯著降LDH及肌酸激酶活性，改善心肌病理組織形態(tài)學(xué)變化，減少炎性細(xì)胞浸潤，改善心功能，降低血清心肌酶活性[19]。Li等[20]研究顯示，YQFM對提高體外細(xì)胞存活率，減少LDH釋放，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）的表達(dá)等有顯著作用。此外，YQFM能夠調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因及其相關(guān)蛋白X的表達(dá)，通過提升線粒體膜電位和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的含量進(jìn)而改善線粒體功能。在YQFM給藥組中加入腺苷酸活化蛋白激酶adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抑制劑后，轉(zhuǎn)染AMPK α siRNA的心肌細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡。該結(jié)果提示，YQFM抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能通過激活A(yù)MPK信號通路實(shí)現(xiàn)。在一項(xiàng)YQFM保護(hù)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌缺血損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，YQFM能夠降低心肌缺血損傷小鼠血清中LDH、肌酸激酶含量，減少生理記錄儀T波升高，降低丙二醛和髓過氧化物酶水平，改善心肌組織病理損傷狀況[21]。此外，YQFM可以明顯減輕低氧環(huán)境所致心臟組織內(nèi)皮細(xì)胞的腫脹、空泡化，增加心臟收縮功能，提高心肌缺氧耐受性[22]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)開展的YQFM治療心-腦缺血疾病多靶點(diǎn)的研究中，揭示了YQFM與缺血性疾病相關(guān)的靶點(diǎn)通路有12條，主要的有核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MAPK、轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（adenosine cyclophosphate-response element binding protein，CREB）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等信號通路[23]。Gou等[24]采用血管加壓素注射成功建立大鼠心絞痛模型，探討YQFM對血管加壓素誘導(dǎo)的大鼠心絞痛模型的保護(hù)作用及其潛在途徑。采用超聲心動圖系統(tǒng)、染色法、全自動生化分析儀等方法檢測心臟功能、組織形態(tài)及血清心肌酶，評價心臟損傷程度，采用Western blotting法檢測促炎因子TNF-α、IL-6水平及相關(guān)NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)，研究結(jié)果表明YQFM可以通過NF-κB/p65信號通路改善血管加壓素誘導(dǎo)的心絞痛。這些發(fā)現(xiàn)為YQFM治療心絞痛的臨床應(yīng)用提供了藥理學(xué)證據(jù)。

上述一系列研究結(jié)果表明，YQFM對心血管疾病的作用機(jī)制包括增強(qiáng)心臟的收縮功能、延緩心室重構(gòu)、抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌損傷、改善線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡、改善能量代謝、減少心肌組織膠原沉積等。與這些機(jī)制相關(guān)的蛋白分子信號通路主要包括NF-κB、AMPK、MAPK、CREB和mTOR等。

2.2 YQFM的臨床應(yīng)用

慢性心力衰竭也稱慢性心功能不全，是心臟收縮舒張功能受損，最終導(dǎo)致心功能不全的一組臨床綜合征，以心排血量不足，血液灌注不足以及肺循環(huán)和體循環(huán)瘀血為特征[25]。在一項(xiàng)對1134例冠心病所致心力衰竭患者的多中心臨床研究中，采用YQFM治療14 d，結(jié)果顯示患者心臟功能顯著改善，胸片異常人數(shù)減少，Lee氏心力衰竭計(jì)分和明尼蘇達(dá)心力衰竭評分等指標(biāo)也明顯改善，彩超多項(xiàng)檢測指標(biāo)均有好轉(zhuǎn)[26]。NT-proBNP是心功能紊亂程度最敏感的標(biāo)志物，研究顯示，對慢性心力衰竭的患者在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上聯(lián)用YQFM，可以顯著降低患者血漿NT-proBNP水平，提高LVEF值，改善心衰患者的心臟功能，提高慢性心衰患者6 min步行距離，改善活動耐受度[27-28]。針對缺血性心肌合并心力衰竭的治療，在常規(guī)西藥基礎(chǔ)上加用YQFM，心功能評估參照美國紐約心臟病學(xué)會心功能分級標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果顯示，YQFM組的心功能分級改善I～I(xiàn)I級的比例明顯高于常規(guī)組，關(guān)鍵標(biāo)志物NTproBNP的水平顯著下降。同時，YQFM治療組后6 min步行結(jié)果明顯優(yōu)于對照組，且心肌受損程度減輕[29-30]。

臨床上常規(guī)治療聯(lián)用YQFM可改善冠心病心衰患者的臨床癥狀，使心衰計(jì)分、明尼蘇達(dá)生活質(zhì)量量表積分降低，明顯減少冠心病心衰合并心絞痛患者的心絞痛發(fā)作次數(shù)，改善總有效率可以達(dá)到85.36%[31]。對慢性心力衰竭的患者給予YQFM治療，結(jié)果顯示，左心室收縮及舒張期內(nèi)徑縮小，LVEF增加。同時，BNP水平明顯降低，與心功能的改善成正相關(guān)[32]。對于急性心力衰竭患者的臨床研究結(jié)果顯示，YQFM治療組緩解急性心衰癥狀的時間短于對照組，YQFM治療能夠顯著提高患者的LVEF，降低左室舒張末期容積，縮小左房內(nèi)徑，升高二尖瓣口舒張?jiān)缙谧畲笱魉俣扰c舒張晚期最大血流速度比值[33]。在對120例急性心衰患者臨床試驗(yàn)研究中，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用YQFM，結(jié)果顯示YQFM能顯著降低患者血清中肌鈣蛋白-I與BNP水平，減輕心肌損傷，改善心功能分級，保護(hù)心臟[34-35]。

在對冠心病心絞痛治療的臨床研究中，給予患者YQFM靜脈滴定治療，結(jié)果顯示治療后心電圖改善明顯，硝酸甘油停減率為91.5%，心絞痛分級及發(fā)作次數(shù)等有大幅度改善[36]。采用西雅圖心絞痛量表評價YQFM聯(lián)合西藥對不穩(wěn)定型心絞痛的療效，YQFM能夠提高冠心病心絞痛患者的生活質(zhì)量和滿意度[37]，同時還能夠有效降低老年穩(wěn)定型心絞痛患者收縮壓[38-39]。血細(xì)胞比容、全血黏度、纖維蛋白原等血液流變學(xué)指標(biāo)升高極易導(dǎo)致血栓的形成，進(jìn)而阻塞冠狀動脈引發(fā)冠心病心絞痛。張崇榮等[40]納入62例氣陰兩虛型冠心病心絞痛患者觀察YQFM的臨床療效，研究表明在常規(guī)基礎(chǔ)治療上聯(lián)用YQFM可以降低患者血液流變值、明顯降低心絞痛復(fù)發(fā)率和心肌梗死發(fā)生率。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的損傷容易引發(fā)不穩(wěn)定型心絞痛[41]，不穩(wěn)定型心絞痛發(fā)作時，氧化應(yīng)激等因素可導(dǎo)致血管內(nèi)皮系統(tǒng)慢性微炎癥狀態(tài)的過度激活，加劇血管內(nèi)皮損傷，加重動脈斑塊的不穩(wěn)定性。在一項(xiàng)對88例不穩(wěn)定型心絞痛患者治療的臨床研究中[42]，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用YQFM，結(jié)果顯示治療后患者血漿一氧化氮水平較治療前明顯升高，內(nèi)皮素以及血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1顯著降低，且治療組指標(biāo)改善情況均優(yōu)于對照組。上述結(jié)果說明，YQFM可以減輕不穩(wěn)定型心絞痛患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮功能。

綜上所述，YQFM在臨床上主要用于心力衰竭、冠心病心絞痛、心肌梗死等心血管疾病的治療，療效顯著，且其臨床療效的發(fā)揮是通過多種作用機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。

3 YQFM中Q-Marker藥效機(jī)制與其臨床療效的相關(guān)性

“藥性”與“藥效”均是中醫(yī)藥理論的核心概念，在創(chuàng)建及完善中藥Q-Marker理論體系中誕生的“性-效-物”三元論，是在對中藥藥效及化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，將“藥性”相關(guān)物質(zhì)納入質(zhì)量評價中，從中藥的基本屬性及術(shù)語出發(fā)，完整闡釋中藥治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的創(chuàng)新概念，是指導(dǎo)中藥Q-Marker研究的核心思想[3-4]。YQFM的臨床有效性體現(xiàn)了其組方藥材的藥性與藥效的協(xié)同作用，而中藥藥效作用的發(fā)揮與其藥效物質(zhì)密切相關(guān)。因此，借助“性-效-物”三元論的指導(dǎo)，解析各組方藥材中與藥效有關(guān)的活性成分，揭示YQFM的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，特別是Q-Marker與其臨床療效背后所蘊(yùn)含的多重藥理機(jī)制之間的相關(guān)關(guān)系，對于確證YQFM中QMarker的合理性，并進(jìn)一步借助中藥Q-Marker理論及方法學(xué)提升中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施中藥質(zhì)量控制具有現(xiàn)實(shí)意義。

3.1 紅參中Q-Marker與YQFM臨床有效性關(guān)系辨識

紅參為YQFM組方中的君藥，具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫之功效。YQFM中來源于紅參的Q-Marker為人參皂苷類物質(zhì)，現(xiàn)代研究表明，人參皂苷具有增強(qiáng)免疫力、抗血小板凝集、保護(hù)神經(jīng)、改善心血管功能、抗炎、抗氧化等活性。作為Q-Marker的8個人參皂苷之一，其作用機(jī)制與YQFM臨床對心衰、心絞痛等疾病的治療密切相關(guān)。在以結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支慢性心衰模型考察YQFM心臟保護(hù)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)[14]，YQFM中所含的人參皂苷Rb1、Rg1、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Ro和Rg3具有抗炎作用，并證實(shí)人參皂苷Ro是一種NF-κB抑制劑。而NF-κB信號通路及細(xì)胞因子的抑制被看作是YQFM改善大鼠慢性心衰的主要機(jī)制之一。謝薇等[43]研究了白消安誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及人參皂苷Rb1對此的干預(yù)效應(yīng)，結(jié)果顯示高濃度（0.12 g/L）白消安可顯著誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，人參皂苷Rb1可以抑制凋亡作用，說明人參皂苷Rb1可以通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。Zhou等[44]以實(shí)驗(yàn)豬為模型研究了人參皂苷Rb1對于高同型半胱氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管內(nèi)皮功能障礙形成的血管損傷的影響。結(jié)果表明人參皂苷Rb1能夠有效阻滯高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管舒張依賴性內(nèi)皮功能障礙，阻滯超氧化物負(fù)離子的產(chǎn)生，抑制內(nèi)源性一氧化氮合酶的下調(diào)。郭佳等[45]考察了人參皂苷Rb1對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1處理組的細(xì)胞生存率增加2.28倍，凋亡率減少5.29%，LDH、丙二醛含量分別降低了59.2%、72.3%，一氧化氮活性增加了2.67倍。說明人參皂苷Rb1能顯著減輕肥厚心肌細(xì)胞的脫氧復(fù)氧損傷，該機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡，減少脂質(zhì)過氧化以及增強(qiáng)一氧化氮活性相關(guān)。對缺血再灌注大鼠模型分別采用人參皂苷Rb1和人參皂苷Re治療，結(jié)果顯示人參皂苷Rb1和人參皂苷Re治療的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于模型組。表明人參皂苷Rb1和人參皂苷Re可以有效抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷[46-47]。古云等[48]采用大鼠心衰模型研究了人參皂苷Rg1對心功能的保護(hù)作用。以依那普利為對照，將人參皂苷Rg1治療分為高、中、低[4、2、1 mg/(kg·d)] 3個劑量組。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1高劑量組LVEF、左心室最大內(nèi)壓上升/ 下降速率（±dp/dtmax）明顯增高，LVDs和左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVDd）明顯降低，高劑量組的Ca2+,Mg2+-ATP酶、總ATP酶、總糖原、堿性磷酸酶、LDH以及心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)心肌肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶的表達(dá)與其他組相比明顯升高，Na+,K+-ATP酶明顯降低。結(jié)果說明，人參皂苷Rg1可改善心衰大鼠的心功能，與升高LVEF、±dp/dtmax、Ca2+,Mg2+-ATP酶、T-ATP酶、總糖原、堿性磷酸酶、LDH、心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)心肌肌漿網(wǎng)鈣離子ATP酶表達(dá)及降低LVDs、LVDd、Na+,K+-ATP酶有關(guān)。采用結(jié)扎SD大鼠左冠狀動脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型觀察人參皂苷Rg1對心肌梗死后心臟纖維化的影響[49]。結(jié)果顯示，手術(shù)1、2周后，人參皂苷Rg1組的心臟瘢痕形成要明顯少于對照組，說明人參皂苷Rg1對大鼠急性心肌梗后心臟纖維化有顯著抑制作用。張聰?shù)萚50]研究了人參皂苷對過氧化氫誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。與過氧化氫損傷組比較，人參皂苷Rh1、F1、Rd、Ro保護(hù)組的細(xì)胞存活率顯著升高。在以小鼠單核巨噬細(xì)胞考察人參皂苷Rh1抗炎活性的研究中，人參皂苷Rh1能夠有效組織組胺釋放，并能抑制誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）與環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的生成[51]。此外，研究顯示人參皂苷Rh1能夠有效緩解異丙腎上腺素引起的大鼠心肌損傷并改善心臟功能，該機(jī)制與人參皂苷Rh1抑制丙二醛、TNF-α和IL-1β含量升高，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性有關(guān)[52]。人參皂苷Rf能夠抑制由缺氧誘導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)，說明人參皂苷Rf在缺氧條件下具有抗炎活性[53]。人參皂苷Rb2對過氧化氫及缺血再灌注引起的小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的心臟損傷具有明顯的保護(hù)作用[54]。研究顯示，人參皂苷Rb2能夠減少心肌過氧化物的生成，下調(diào)gp91phox基因表達(dá)，降低IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)及活性，說明人參皂苷Rb2能夠顯著緩解由缺血再灌注損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。Chen等[55]研究了人參皂苷Rc對缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果顯示，人參皂苷Rc能夠顯著提高損傷心肌細(xì)胞的活力，其機(jī)制與改善能量代謝有關(guān)，包括提高ATP含量、減少LDH滲出和降低肌酸激酶含量。對人參皂苷Rg3的研究表明，人參皂苷Rg3對脂多糖導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮HUVECs細(xì)胞損傷具有保護(hù)功能，該藥效機(jī)制與降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）產(chǎn)生以及調(diào)節(jié)組織型纖溶酶原激活物和PAI-1平衡有關(guān)，說明人參皂苷Rg3具有血管保護(hù)和抗動脈粥樣硬化的功能[56]。人參皂苷Rg3能夠顯著減小心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的大鼠心肌梗死面積，提高心臟功能，降低血漿中肌酸激酶和LDH水平，表明人參皂苷Rg3對缺血所致的心肌損傷具有保護(hù)功能[57]。此外，人參皂苷Rg3對過氧化氫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的抑制作用[58]。上述研究結(jié)果表明，人參皂苷類Q-Marker對于心血管疾病具有多種的生物活性。在YQFM用于心衰、心絞痛的療效中，人參皂苷類Q-Marker發(fā)揮著保護(hù)患者血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善線粒體功能、抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎等功能。

除以上已經(jīng)確定的Q-Marker在心衰心絞痛治療中發(fā)揮療效之外，人參皂苷Re可以有效抑制缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷[46-47]。Li等[59]采用離體皮下脂肪組織和心外膜脂肪組織體外YQFM給藥24 h，采用HPLC-Q-TOF/MS技術(shù)檢測脂肪組織和對照樣品，確定益氣復(fù)脈中人參皂苷Rd是結(jié)合成分，并采用缺氧復(fù)氧實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YQFM和人參皂苷Rd可以顯著增加網(wǎng)膜素的含量。結(jié)果表明人參皂苷Rd可能部分介導(dǎo)YQFM的網(wǎng)膜素相關(guān)性保護(hù)作用。崔如意等[60]利用中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺V2.0，分析得到人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb2為人參治療心衰的Q-Marker。本課題組采用高效液相色譜技術(shù)，建立了一測多評法可以檢測人參皂苷Rd、Re在YQFM中的含量，能夠?qū)ζ錅?zhǔn)確定量分析[61]。因此，本文進(jìn)一步將人參皂苷Rd和人參皂苷Re納入YQFM的Q-Marker中，以期完善YQFM的Q-Marker體系。人參皂苷Re和Rd的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 人參皂苷Re和Rd的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of ginsenoside Re and Rd

3.2 麥冬中Q-Marker與YQFM臨床有效性關(guān)系辨識

麥冬為YQFM中的臣藥，其味甘、微苦，性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩的功效。麥冬的藥效成分主要為麥冬多糖和麥冬皂苷，隨著對麥冬研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在心腦血管疾病中具有良好的藥理活性。劉春花[62]對麥冬及其化學(xué)活性成分在YQFM中治療心血管疾病的作用機(jī)制開展了系統(tǒng)性研究。利用大鼠H9c2缺氧-復(fù)氧細(xì)胞模型和慢性間歇性缺氧小鼠模型探索了麥冬抗缺氧誘導(dǎo)心臟損傷發(fā)揮的保護(hù)作用及能量代謝調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)麥冬能較好的保護(hù)心臟抵抗缺氧-復(fù)氧損傷，在YQFM中具有改善能量代謝的功能。研究結(jié)果顯示，麥冬能夠促進(jìn)糖酵解限速酶6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase，6-PFK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2，PKM2）的蛋白表達(dá)，抑制丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）的蛋白水平表達(dá)，提示麥冬可以通過調(diào)節(jié)糖代謝限速酶促進(jìn)能量代謝產(chǎn)能效率。與紅參和五味子相比，麥冬尤其能促進(jìn)糖酵解中PKM2的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)丙酮酸生成，增加丙酮酸水平。麥冬果糖能夠提高缺氧H9c2細(xì)胞上清液中丙酮酸水平，顯著促進(jìn)PKM2和果糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter 5，Glut5）的蛋白表達(dá)水平。3種皂苷類物質(zhì)：麥冬皂苷C、麥冬苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷均顯著降低缺氧-復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，并能促進(jìn)能量代謝中間產(chǎn)物丙酮酸的生成，促進(jìn)能量代謝限速酶6-PFK和PKM2的蛋白水平表達(dá)，明顯抑制PDK4的蛋白水平，從而提高丙酮酸脫氫酶的活性。上述結(jié)果說明，來源于麥冬的Q-Marker在YQFM中主要通過調(diào)節(jié)糖代謝限速酶表達(dá)和提供足夠的底物來提高糖類能量代謝效率。說明在YQFM臨床治療心血管疾病中，麥冬的Q-Marker發(fā)揮著全方位改善能量代謝的重要作用。

3.3 五味子中Q-Marker與YQFM臨床有效性關(guān)系辨識

五味子在YQFM配伍中為佐藥，具有收澀、斂陰止汗之功效。其主要活性成分五味子醇甲被確定為YQFM中的Q-Marker。研究顯示，五味子醇甲具有較強(qiáng)的抗炎活性，能夠顯著降低角叉菜膠引起的大鼠足部腫脹和醋酸引起的大鼠血管通透性增加，其抗炎活性與抑制COX-2和iNOS蛋白表達(dá)有關(guān)[63]。楊敏[64]研究顯示，五味子醇甲可降低去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并提高心肌細(xì)胞存活率，對心肌細(xì)胞的形態(tài)具有改善作用，其機(jī)制與下調(diào)心肌肌鈣蛋白T、心肌肌鈣蛋白I和內(nèi)皮素-1的表達(dá)，降低炎性反應(yīng)有關(guān)。此外，五味子醇甲有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用，五味子醇甲10～100 mmol/L能夠減少HUVECs細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，增加細(xì)胞活力和一氧化氮水平，降低LDH和丙二醛含量，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成[65]。上述結(jié)果表明，作為QMarker的五味子醇甲在YQFM對心血管疾病的臨床治療中，主要通過抗炎、保護(hù)心肌細(xì)胞機(jī)制發(fā)揮作用。

綜上所述，在前期研究基礎(chǔ)上，納入人參皂苷Rd和人參皂苷Re作為YQFM的Q-Marker。QMarker的數(shù)量與各自組方藥材在YQFM配伍原則中的地位相對應(yīng)，各Q-Marker具有不同的藥效機(jī)制與作用靶點(diǎn)，其在YQFM臨床療效中發(fā)揮著不同效用。YQFM的Q-Marker藥效機(jī)制與其臨床療效相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。

4 結(jié)語

YQFM在臨床上主要用于心力衰竭、冠心病心絞痛等心血管疾病的治療，其作用機(jī)制包括增強(qiáng)心臟的收縮功能、延緩心室重構(gòu)、抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌損傷、改善線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡、改善能量代謝等。YQFM中15個Q-Marker具有不同的藥效活性特點(diǎn)和對應(yīng)靶點(diǎn)，分別從不同的活性機(jī)制實(shí)現(xiàn)YQFM在臨床上對冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療作用。其中，10個來自于君藥紅參的皂苷類成分具有保護(hù)患者血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善線粒體功能、抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎等功能。4個來源于臣藥麥冬的成分（3個麥冬皂苷和果糖）可以通過調(diào)節(jié)糖代謝限速酶表達(dá)和提供足夠的底物來提高糖類能量代謝效率，有效改善患者的能量代謝。佐藥五味子中的五味子醇甲能夠通過抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)揮作用。YQFM是遵照經(jīng)典的中藥配伍理論組方而成的中藥復(fù)方制劑，來自組方藥材紅參、麥冬和五味子的Q-Marker以不同的生物活性對心血管疾病發(fā)揮作用。

圖3 YQFM中Q-Marker的藥效機(jī)制與其臨床療效相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between Q-Marker of YQFM,pharmacodynamic mechanism,and clinical efficacy

中藥產(chǎn)品的質(zhì)量控制是中藥產(chǎn)業(yè)長期健康發(fā)展的核心問題。在明確中藥制劑臨床有效性及其作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，發(fā)掘其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)并對其實(shí)施有效控制是解決該問題的關(guān)鍵。中藥Q-Marker創(chuàng)新理念及其“性-效-物”三元論方法學(xué)體系，為中藥物質(zhì)基礎(chǔ)表征、中藥Q-Marker發(fā)現(xiàn)以及質(zhì)量評價系統(tǒng)的建立開辟了新的研究模式與思路。辨析中藥制劑的Q-Marker與其臨床療效之間的關(guān)系，能夠從臨床實(shí)踐角度進(jìn)一步佐證Q-Marker選擇的科學(xué)性，并為產(chǎn)品質(zhì)量的全面表征與控制提供充實(shí)的依據(jù)。本文在前期對YQFM所含Q-Marker預(yù)測研究結(jié)果之上，進(jìn)一步分析了YQFM臨床療效機(jī)制與其Q-Marker作用機(jī)制之間的內(nèi)在關(guān)系，揭示了Q-Marker在YQFM臨床治療心血管疾病中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，佐證了Q-Marker的合理性，為構(gòu)建更加全面的產(chǎn)品質(zhì)量評價體系提供了基礎(chǔ)。中藥Q-Marker借助于中藥Q-Marker創(chuàng)新理論與方法學(xué)篩選，結(jié)果反映了中藥傳統(tǒng)藥性配伍理論的物質(zhì)本源。本文將中藥QMarker理論體系成果與現(xiàn)代臨床研究的有效性證據(jù)相結(jié)合，通過Q-Marker客觀實(shí)體將傳統(tǒng)中藥藥性配伍理論與現(xiàn)代臨床研究達(dá)成統(tǒng)一，充分證明中藥Q-Marker理論在現(xiàn)代中藥基礎(chǔ)研究中發(fā)揮的作用與應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突