Aloxe3在非酒精性脂肪肝中調控作用及其分子機制

孫菲 蘇維瑋 李佳 劉曉剛

(1山東大學齊魯醫(yī)院(青島)肝病科/感染病科，山東 青島 266000；2唐山市工人醫(yī)院肝膽外科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素外所致的以肝細胞內(nèi)脂質過度沉積為主要特征的臨床病理綜合〔1〕，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關的肝硬化。單純性脂肪肝指的是肝臟脂質含量超過肝臟體積的5%，隨著肝臟脂質沉積的增多，肝臟炎癥隨之發(fā)生。NASH是單純性脂肪肝的下一階段〔2〕，其在一般人群中的發(fā)病率為3%～5%，NASH患者在進展為肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌方面具有更高風險〔3〕。非酒精性脂肪肝是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝性肝病，與肥胖、胰島素抵抗和高血糖密切相關〔4,5〕。隨著2型糖尿病和肥胖癥患病率增加，非酒精性脂肪肝成為一種比酒精性脂肪肝更常見的脂肪肝〔6〕，患病率約占總人群的30%〔7〕，因此探究NAFLD發(fā)病機制，為其防治提供一定的理論基礎，具有重要的臨床意義。

脂氧合酶(Aloxe)3基因可編碼一種新型代謝調控蛋白即表皮型Aloxe3〔8〕。研究報道，通過對患有非大皰性先天性魚肌樣紅皮病家族進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)Aloxe3基因突變和非大皰性先天性魚肌樣紅皮病有關〔9〕。隨后研究發(fā)現(xiàn)Aloxe是一個氧化不飽和脂肪酸如花生四烯酸等特定的過氧化物的含鐵蛋白酶家族，Aloxe3蛋白即其中的一個獨特的可催化特定的環(huán)氧醇類生成的環(huán)氧醇合酶。相關研究證實，過表達Aloxe3可改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗〔10〕，Aloxe3作為一個潛在的肝細胞禁食反應的效應調控分子〔10〕，是代謝性疾病尤其是糖尿病治療中的重要代謝靶蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在禁食、葡萄糖饑餓或海藻糖/海藻糖類似物治療期間，Aloxe3基因被激活并介導了肝臟饑餓相關代謝反應〔10,11〕。然而目前關于Aloxe3在脂肪肝中的作用機制仍不清楚，本研究探究Aloxe3在脂肪肝中的具體作用機制，為NAFLD治療尤其脂肪肝藥物研發(fā)發(fā)掘潛在的分子靶向位點。

1 試劑和方法

1.1試劑 脂質(油紅O)染色試劑盒(貨號：0080-1)購買自默克公司，Aloxe3過表達病毒和Aloxe3干擾病毒均購自上海吉凱生物，脂質檢測試劑盒包括三酰甘油(TG)檢測試劑盒、總膽固醇(TC)檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，貨號分別為A110-1、A112-1。β-羥基丁酸檢測試劑盒購自R&D公司，貨號為R2302-A。逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑均購自日本東洋紡TOYOBO公司，貨號為FSQ-101和FSQ-115。Aloxe3抗體購自上海晅科生物科技有限公司，貨號141-240，tubulin抗體購自Santa公司，貨號為13022。

1.2高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠飼養(yǎng) 16只雄性5周齡C57/BL小鼠購自南京模式動物中心，體重16～18 g，小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF)動物房中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24℃，日溫差≤3℃，相對濕度達50%～650%，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，日照12 h晝夜循環(huán)。適度適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為對照組和高脂飼料組，每組8只，高脂飼料組開始高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料購自Research Diet公司，對照組為普通飼料喂養(yǎng)。

1.3基因型肥胖(ob/ob)小鼠的飼養(yǎng) 8只雄性8周齡ob/ob小鼠及8只野生型對照小鼠購自南京模式動物中心，體重22～26 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，ob/ob小鼠及其對照組小鼠普通飼料喂養(yǎng)與1.2中小鼠一樣，8 w后，苯巴比妥鈉麻醉小鼠，心尖心搏最明顯處穿刺取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，取小鼠肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測。

1.4Aloxe3過表達病毒感染野生型小鼠 16只雄性6周齡C57/BL小鼠購自南京模式動物中心，體重18～20 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同1.2。適度適應性喂養(yǎng)1 w后所有小鼠開始高脂飼料喂養(yǎng)，每周稱量小鼠體重，連續(xù)喂養(yǎng)7 w后，隨機分為對照組和Aloxe3過表達組，每組8只，Aloxe3過表達組尾靜脈注射5×1010pfu/ml Aloxe3過表達腺病毒，對照組給予同等劑量的對照載體病毒，給予病毒后每周檢測一次小鼠體重及進食量，4 w后，苯巴比妥鈉麻醉小鼠，心尖取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，同時取小鼠肝臟并稱量肝臟重量，然后取50 mg肝臟保存于組織包埋劑(OCT)保存液中用于冰凍切片油紅O染色，其余肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測。

1.5Aloxe3 shRNA下調小鼠肝臟中Aloxe3表達 20只雄性6周齡C57/BL小鼠購自南京模式動物中心，體重18～20 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同方法1.2。適度適應性喂養(yǎng)2 w后隨機分為對照組、Aloxe3干擾組，每組10只，小鼠尾靜脈注射1×1011pfu/ml Aloxe3 shRNA干擾腺病毒，對照組給予同等劑量的對照載體病毒，6 w后，兩組饑餓16 h，稱量小鼠體重，然后苯巴比妥鈉麻醉，心尖取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，同時取小鼠肝臟并稱量肝臟重量，取肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測。

1.6血清和肝臟中的脂質含量 稱取50 mg肝組織放入裝有研磨珠的2 ml離心管，加入0.5 ml預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將離心管放入組織樣品研磨機中60 Hz、120 s震蕩研磨，加入1 ml氯仿-甲醇溶液(體積比為2∶1)，充分振蕩混勻，2 500 r/min離心10 min，離心后剝離上層組織片，上層為水相，吸取下層有機相至另一新的1.5 ml離心管中，離心管敞開蓋子，通風櫥中干燥過夜，然后利用無水乙醇溶解干燥后的脂質，用TG及TC檢測試劑盒檢測血清和肝臟中的脂質含量。TG及TC的檢測方法參照南京建成公司試劑盒操作說明進行。

1.7酮體水平檢測 利用β-羥基丁酸檢測試劑盒檢測小鼠血清中酮體β-羥基丁酸，樣品均采用復孔檢測，減少操作導致的誤差。操作根據(jù)試劑盒說明進行，大致步驟如下：每孔加入血清樣品100 μl(10倍稀釋)，然后加入樣品反應液，37℃反應30 min后，加入終止液 450 nm處檢測每孔的吸光度(OD值)。

1.8油紅O染色 用OCT包埋劑浸沒的肝臟組織在液氮中保存，然后在冰凍切片機中切成厚度為10 μm的冰凍切片，然后用4%多聚甲醛固定10 min，其次用蒸餾水洗，60%異丙醇浸洗分化，油紅O染液染色10 min，60%異丙醇分色至背景無色后蒸餾水洗2遍，蘇木素復染，蒸餾水洗后甘油明膠封片，然后顯微鏡下觀察肝臟切片油紅O染液陽性區(qū)域并拍照。油紅O屬于偶氮染料，可與TG結合，油紅O染液陽性區(qū)域表示脂質沉積區(qū)域。

1.9實時熒光定量PCR 提取肝臟總RNA，加總RNA抽提劑(TRIZOL)試劑1 ml，震蕩碾磨搖勻，加氯仿0.2 ml，輕搖15 s，室溫靜置2～3 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min。然后取上清無色水相到EP管中加0.5 ml異丙醇，室溫下靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min。棄去上清后75%乙醇洗滌總RNA白色沉淀，7 500 r/min，4℃離心5 min，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解總RNA，測RNA濃度后利用逆轉錄試劑盒逆轉錄，最后利用DNA結合染料(SYBR)和隨機引物進行實時熒光定量PCR，檢測基因的表達。引物序列如下：Aloxe3 正義：5′-TACACTGCATCAGCTGCATC-3′；反義：5′-CG CTCGCTCGCTATCAGCTG-3′。SREBP1正義：5′-CT CGTAGCATGATATCGAGT-3′；反義：5′-ATCGCTGGTATCGATGTACA-3′。FASN正義：5′-ATGCTGAACA GTGTACACAAT-3′；反義：5′-ACGCGTGTCAGCTAGC TAGCTT-3′。PPARα正義：5′-AGCTACAACTCGCTGCATGAT-3′；反義：5′-CAATCAGTCAGCATCGATAC-3′。CPT1α正義：5′-CGTACGTACGTACGATGCT AG-3′；反義：5′-ACGCATGATGACTAGATCC-3′。AC OX1 3正義：5′-CGCGCGTAGCATGATCGTG-3′；反義：5′-ACGTGATCGATGTGGCACC-3′。HMGCS2正義：5′-ACAAGATGCTCTGAGAGAGCC-3′；反義：5′-CATCGATGTGACATC TAGAGAGC-3′。SCD1正義：5′-CGATGTGCTGTCGAGACTACCCA-3′；反義：5′-ACGACTGACTAGTATCTGCGATTC-3′。GAPDH正義：5′-ACTGCATGCATGTGTCATCAGCGA-3′；反義：5′-CCGCGCTAGCT GCATGTACGCAGTC-3′。

1.10Western印跡 用組織快速裂解液(RIPA)裂解肝臟組織并在組織破碎儀震蕩，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清進行蛋白濃度測定，然后上樣80 V恒壓電泳，以120 V恒壓將蛋白電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中用相應的一抗孵育4℃過夜，二抗室溫結合2 h，加入顯影液曝光顯影，分析目的蛋白的表達量。

1.11統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism6.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組脂肪中Aloxe3表達 高脂飼料組小鼠肝臟中TG的含量顯著高于對照組(P<0.001)。高脂飼料組mRNA水平和蛋白水平均顯著低于對照組(P<0.001或P<0.01)，見表1。

表1 兩組肝臟中的Aloxe3表達

2.2ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表達 ob/ob小鼠組肝臟中TG含量顯著高于對照組(P<0.001)。ob/ob小鼠組mRNA、蛋白水平均顯著低于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表達

2.3過表達Aloxe3的小鼠體重和攝食量的改變 Aloxe3過表達組肝臟中Aloxe3的mRNA和蛋白水平〔(4.68±0.73),(3.89±0.69)〕顯著高于對照組〔(1.03±0.05),(1.11±0.08);P<0.01或P<0.001〕，表明Aloxe3過表達成功。Aloxe3過表達組Aloxe3過表達前，兩組體重無明顯差異，在Aloxe3過表達病毒感染1 w后，Aloxe3過表達組體重即開始明顯低于對照組(P<0.05)，在Aloxe3過表達的第2、3、4周，兩組差異明顯增大(P<0.01或P<0.001)。而兩組攝食量未見明顯差異(P>0.05)，提示Aloxe3可能參與調控機體的能量代謝率。見表3。

表3 過表達Aloxe3的小鼠體重和攝食量改變

2.4過表達Aloxe3的小鼠脂質代謝的改變 Aloxe3過表達組肝臟脂質沉積量顯著低于對照組(P<0.01)。見圖1。Aloxe3過表達組肝臟TG、血清TG和TC含量顯著低于對照組，而酮體β-羥基丁酸含量顯著高于對照組(P<0.01)，表明Aloxe3過表達可降低小鼠血脂，促進酮體生成，改善肝臟脂質沉積。見表4。

圖1 過表達Aloxe3的小鼠肝臟脂質沉積水平(油紅O染色，×200)

表4 過表達Aloxe3的小鼠肝臟脂質代謝的改變

2.5Aloxe3可促進脂質分解和脂肪酸氧化 Aloxe3過表達后肝臟脂質合成相關基因膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP)1、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)1的表達無明顯變化，而肝臟脂質氧化分解相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α、肉毒堿棕櫚?；D移酶(CPT)1α、過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶(ACOX)1的表達均顯著高于對照組(P<0.01或P<0.001)。酮體生成基因3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGCS)2的表達顯著高于對照組，表明Aloxe3主要通過上調脂質分解和脂肪酸氧化，促進酮體生成，增強小鼠的脂質分解代謝率。見表5。

表5 過表達Aloxe3小鼠肝臟脂質代謝相關基因的表達

2.6Aloxe3下調后小鼠脂代謝的改變 Aloxe3 shRNA腺病毒感染后的小鼠肝臟中Aloxe3表達較對照組顯著降低(P<0.001)，見圖2、表6，表明Aloxe3 shRNA腺病毒下調效果明顯。Aloxe3 shRNA腺病毒感染小鼠饑餓16 h后肝臟TG含量也顯著增加(P<0.001)。同時血清脂質包括TC和TG含量顯著升高(P<0.001)，Aloxe3干擾組血清β-羥基丁酸水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表6，說明Aloxe 3參與調控肝臟脂質代謝，尤其是脂肪酸氧化和酮體生成水平。

圖2 Aloxe3 shRNA病毒感染后Aloxe3在小鼠肝臟中的表達

表6 Aloxe3下調后小鼠脂代謝的改變

3 討 論

Aloxe3基因是一種編碼表皮型脂氧合酶eLOX3，有研究表明〔10〕Aloxe3基因被激活并介導了肝臟饑餓相關代謝反應，是一種潛在的治療性禁食反應的新型效應物，提示Aloxe3基因可能參與了機體脂質代謝的調控。為此本文首先在飲食誘導和ob/ob小鼠脂肪肝模型中檢測Aloxe3的表達，發(fā)現(xiàn)Aloxe3在上述兩個脂肪肝模型中均表達下降。在小鼠中過表達Aloxe3，發(fā)現(xiàn)Aloxe3不僅可降低小鼠體重，還可抵抗高脂誘導的小鼠脂肪肝。這與此前的研究結果一致，過表達Aloxe3可增強db/db糖尿病小鼠的基礎產(chǎn)熱、改善胰島素抵抗〔10〕，提示過表達Aloxe3可能改善小鼠糖脂代謝。

肝葡萄糖饑餓反應作為一種治療途徑，可增強肝臟和整個宿主的代謝率〔12〕，目前得到越來越廣泛的應用〔13，14〕，而這些代謝調控的作用機制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在攝食量未明顯改變的情況下，高脂小鼠體重降低，脂肪肝改善，同時酮體生成水平增加，即過表達Aloxe3小鼠表現(xiàn)為肝葡萄糖饑餓反應。同時Aloxe3可增強肝臟脂質代謝，減輕脂肪堆積和體重增加，并降低血液中的TG和TC水平。提示Aloxe3可能是肝葡萄糖饑餓反應的重要介導因子。然而對Aloxe3是否引起熱量燃燒增加、促進機體的代謝率改變，將是以后研究的重點，下一步將利用代謝籠加以探究。

新的研究發(fā)現(xiàn)，天然海藻糖可激活Aloxe3的表達以提高機體胰島素敏感性，從而降低2型糖尿病的發(fā)病概率〔15，16〕。有研究表明，通過飲水的方式喂食小鼠海藻糖會對其肝臟糖脂代謝功能帶來有益的影響〔17〕，其效果類似于饑餓〔15～18〕，但是對于海藻糖引起的小鼠脂代謝的改善是否通過Aloxe3目前尚無相關研究，應進一步研究海藻糖可否調控肝臟特異性Aloxe3敲除小鼠的糖脂代謝改變。研究表明當肝臟PPARγ特異性敲除后，Aloxe3介導的增強胰島素敏感性的作用即消失，因此Aloxe3主要通過PPARγ-PGC1α通路來提高肝胰島素敏感性〔10〕。Aloxe3作為一個潛在的依賴PPARγ的禁食反應效應調控分子〔19〕，在脂代謝中的作用尤其在脂肪酸氧化和酮體生成中的作用〔20〕，是否依賴PPARγ目前尚不可知，本研究結果顯示PPARα在Aloxe3過表達后其水平亦顯著上升，可推測Aloxe3的脂質代謝改善作用可能是依賴PPARα，這有待進一步研究。