胃腺癌患者腫瘤組織中免疫細胞浸潤的生物信息學(xué)分析

曾靜媛 李煒 梁雨 何誠成 羅玉嬌 趙文靜 羅波 毛櫻逾 鄭小莉

(西南醫(yī)科大學(xué) 1護理學(xué)院，四川 瀘州 646000；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3德陽市中江縣人民醫(yī)院急診科；西南醫(yī)科大學(xué) 4臨床醫(yī)學(xué)院；5教務(wù)處·高教研究所)

胃癌位居2018年中國癌癥發(fā)病率第三位，僅次于肺癌和乳腺癌〔1〕。其發(fā)病與飲食習(xí)慣、Hp感染、機體免疫功能、種族、地理環(huán)境有關(guān)〔2〕。胃腺癌是胃癌最常見的組織類型，由于胃腺癌的發(fā)病機制目前尚不十分清楚，因此對胃腺癌的早期診斷率也仍較低〔3〕。胃腺癌的預(yù)后與其病理分期、組織類型〔4〕、生物學(xué)行為以及治療措施有關(guān)〔5〕。

腫瘤是機體正常細胞惡變而來，特點是不斷增殖并在體內(nèi)轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞分泌或細胞溶解后產(chǎn)生的一些物質(zhì)，稱為“新抗原”，可招募免疫細胞對腫瘤細胞進行殺傷、清除。這是目前腫瘤免疫治療方法之一〔6〕，如：單克隆抗體免疫檢查點抑制劑(PD1/PDL1)治療胃癌。本研究中，我們從腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)角度出發(fā)〔7〕，通過生物信息學(xué)方法，分析22種免疫細胞在正常組織和腫瘤組織中浸潤的差異〔8〕，試圖找到胃腺癌患者腫瘤組織中浸潤的關(guān)鍵免疫細胞。

基因表達匯編(GEO)數(shù)據(jù)庫中有分析正常組織與腫瘤組織差異表達的基因芯片，下載數(shù)據(jù)表后，利用Perl語言將探針轉(zhuǎn)換成基因后進行數(shù)據(jù)矯正，轉(zhuǎn)換為矩陣，再通過CIBERSORT軟件反卷積法計算腫瘤組織和正常組織中22種免疫細胞的組成情況并量化特定免疫細胞的豐度值〔9〕。Perl軟件處理的矩陣再次轉(zhuǎn)換為樣本與免疫細胞的矩陣，R軟件進行分析并找出胃腺癌組織中浸潤的關(guān)鍵免疫細胞，Graziosi等〔10〕研究表明腫瘤組織中浸潤的免疫細胞與臨床預(yù)后密切相關(guān)。

1 材料和方法

1.1材料 基因芯片數(shù)據(jù)。從(GEO)數(shù)據(jù)庫下載GSE79973 Series Matrix File樣本數(shù)據(jù)、GPL570測序的平臺文件——〔HG-U133-Plus-2〕Affymetrix HumanGenome U133 Plus 2.0 Array。GSE79973樣本數(shù)據(jù)分析了10例胃腺癌患者的腫瘤組織和正常組織共計20個樣本的基因表達數(shù)據(jù)。10個胃腺癌患者正常組織：GSM2109533、GSM2109535、GSM2 109537、GSM2109539、GSM2109541、GSM2109543、GSM2109545、GSM2109547、GSM2109549、GSM210 9551；10個癌癥組織：GSM2109532、GSM2109534、GSM2109536、GSM2109538、GSM2109540、GSM210 9542、GSM2109544、GSM2109546、GSM2109548、GS M2109550。

1.2數(shù)據(jù)處理 用Perl軟件將Series Matrix File和GPL570平臺中樣本和探針數(shù)據(jù)整理成矩陣。探針矩陣轉(zhuǎn)換為行名是基因、列名是樣本的基因矩陣，基因矩陣中樣本信息分為正常組織和腫瘤組織兩組。采用R語言Limma程序包再對矩陣進行數(shù)據(jù)矯正，獲得適合CIBERSORT軟件分析的矩陣信息。CIBERSORT軟件通過反卷積算法，可以基于標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達數(shù)據(jù)來計算復(fù)雜組織中免疫細胞組成〔11〕，該方法能量化特定免疫細胞類型的比例。用CIBERSORT軟件對矯正后矩陣數(shù)據(jù)進行分析，原理是把輸入基因矩陣信息轉(zhuǎn)換為免疫細胞的矩陣。所得到的矩陣行名是22種免疫細胞、列名是樣本信息的矩陣數(shù)據(jù)。用R(3.5.1版本)和Bioconductor程序包對免疫細胞矩陣數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。用t檢驗分析腫瘤組織中相關(guān)免疫細胞浸潤的差異，所有統(tǒng)計分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。在R語言里安裝barplot、pheatmap、corrplot、vioplot、ggplot2程序包分別對CIBERSORT結(jié)果繪制柱狀圖、熱圖、相關(guān)性熱圖、小提琴圖、成對差異分析和主成分分析圖。

2 結(jié) 果

2.1數(shù)據(jù)篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE79973的GPL570平臺數(shù)據(jù)、樣品矩陣數(shù)據(jù)、樣本信息數(shù)據(jù)，通過Perl語言、CIBERSORT軟件將數(shù)據(jù)整理成樣本與免疫細胞的矩陣數(shù)據(jù)。按P<0.05進行數(shù)據(jù)篩選，對20例樣本數(shù)據(jù)分析，除了單核細胞在正常和腫瘤組織中表達都為零，其余21種免疫細胞在腫瘤組織中存在表達差異。

2.2免疫細胞矩陣分析 在R語言中，用barplot函數(shù)繪制柱狀圖。未活化的CD4記憶性T細胞、活化的自然殺傷(NK)細胞、記憶性B細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞在胃腺癌的正常組織中高表達；初始CD4 T細胞、活化的NK細胞在胃腺癌的腫瘤組織中高表達，見圖1。

圖1 22種免疫細胞在正常組織和胃腺癌癌癥組織的表達

在R軟件中安裝pheatmap程序包。對免疫細胞與樣品的矩陣數(shù)據(jù)繪制熱圖：未活化的CD4記憶性T細胞、γδT細胞在胃腺癌正常組織中含量高，M0巨噬細胞在胃腺癌腫瘤組織中表達相對較高，見圖2。

10例正常樣本(con組-藍色)，10例胃腺癌樣本(treat組-粉紅色)高表達(紅色)低表達(綠色)圖2 22種免疫細胞在20個樣本中表達

在R軟件中安裝corrplot程序包，繪制相關(guān)熱圖：在同一樣品中，M1巨噬細胞與活化的CD4記憶T細胞相關(guān)系數(shù)最高，為0.74。即在同一樣品中M1巨噬細胞和CD4記憶T細胞表達呈正相關(guān)，如M1巨噬細胞含量高，則活化的CD4記憶T細胞含量也高。而在同一樣品中，活化的肥大細胞與未活化的肥大細胞表達值最低，為-0.73。即在同一樣品中未活化的肥大細胞和活化的肥大細胞表達呈負(fù)相關(guān)，如未活化的肥大細胞含量低，而活化的肥大細胞含量高，見圖3。

高表達(紅色)、低表達(藍色)圖3 在同一樣品中，22種免疫細胞表達相關(guān)熱圖

在R軟件中安裝vioplot程序包繪制小提琴圖。記憶性B細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞、未活化的CD4記憶性T細胞在正常組織中高表達；初始CD4 T細胞、活化的NK細胞在腫瘤組織中高表達，見圖4。

圖4 免疫細胞在正常組織和胃腺癌癌癥組織中表達

2.3成對分析及主成分分析 在R軟件中自定義成對分析函數(shù)，對同一例患者正常組織和腫瘤組織做成對比較，分析在這兩種組織中某一免疫細胞的表達是否具有差異，仍采用t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在胃腺癌的正常的組織中，記憶性B細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞、未活化的CD4記憶性T細胞表達較高；在腫瘤組織中初始CD4 T細胞、活化的NK細胞表達較高(P<0.05)，見圖5。

圖5 成對分析

在R軟件中安裝ggplot2程序包，對正常組織和腫瘤組織做主成分分析(PCA)。PCA是一種統(tǒng)計方法，通過正交變量將一組可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)變量，轉(zhuǎn)換后的這組變量叫做主成分。PCA結(jié)果顯示：該免疫細胞浸潤分析能夠很好地區(qū)分正常組織與腫瘤組織，見圖6。

圖6 主成分分析

3 討 論

在體液免疫中，吞噬細胞對入侵機體的抗原進行攝取和處理，呈遞給T淋巴細胞，T淋巴細胞分泌淋巴因子刺激B淋巴細胞增殖和分化產(chǎn)生漿細胞、記憶性B細胞。記憶性B細胞對抗原具有特異性的識別能力，當(dāng)抗原第二次感染機體時，記憶性B細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞的過程比原來更迅速〔12〕。嗜酸性粒細胞具有移行至有病原體和發(fā)生過敏反應(yīng)的部位，該細胞具有能吞噬抗原抗體復(fù)合物，釋放多種溶酶體酶有殺菌作用。未活化的CD4記憶性T細胞不具有細胞免疫的功能，但有刺激時，可迅速轉(zhuǎn)化為具有活性的CD4記憶性T細胞〔13〕。在本研究中，胃腺癌患者正常組織中記憶性B細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞、未活化的CD4記憶性T細胞表達較高，表明在正常組織中，這四種免疫細胞能及時清除抗原，減少腫瘤發(fā)生或浸潤，對機體具有保護作用，在防御功能方面具有重要作用〔14〕。

活化的NK細胞在白細胞介素(IL)-2刺激下可發(fā)生增殖反應(yīng)，并產(chǎn)生干擾素(IFN)-γ，認(rèn)為NK細胞與T細胞在發(fā)育上關(guān)系密切〔15〕。由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，作用靶細胞后殺傷活性出現(xiàn)較早的特性，腫瘤發(fā)生時，NK細胞的靶細胞主要是腫瘤細胞，在腫瘤微環(huán)境中表達增高〔16，17〕。

CD4 T細胞可轉(zhuǎn)化為Th0細胞，Th0細胞在細胞因子如IL-12、IL-2和IFN-γ作用下可轉(zhuǎn)化為Th1細胞，后者在白細胞介素-2和IFN-γ刺激下可輔助CTL細胞(細胞毒性T細胞)活化，Th1和CTL 細胞在機體參加細胞免疫；TH0細胞在細胞因子IL-4作用下轉(zhuǎn)化為Th2細胞，細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13能促進Th2細胞的增殖，進而輔助B細胞活化，發(fā)揮體液免疫的作用；Th0細胞在細胞因子IL-6，TGF-β刺激下可向Th17細胞轉(zhuǎn)化，在細胞因子IL-17作用下參與固有免疫反應(yīng)〔18〕，在腫瘤微環(huán)境中，缺血、缺氧或腫瘤生長過快、營養(yǎng)不良引起腫瘤壞死物、凋亡的腫瘤細胞、細胞免疫產(chǎn)生的壞死物引起無菌性炎癥，Th17細胞參與的人體固有免疫反應(yīng)在這方面也具有重要意義。在我們這項研究中，胃腺癌腫瘤組織中浸潤的CD4 T細胞高表達，在Th0細胞向Th1、CTL、Th17 細胞轉(zhuǎn)化具有重要意義，發(fā)揮著積極地抗腫瘤作用〔19〕。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，同一樣本中，M1巨噬細胞與活化的CD4記憶T細胞表達成正相關(guān)。即M1巨噬細胞高表達，則活化的CD4記憶T細胞也就高表達。M1巨噬細胞在細胞因子如IL-1β、TNF、IL-12、IL-18作用下吞噬能力增強，在人體固有免疫防御或反應(yīng)中有重要意義；而活化的CD4記憶T細胞有記憶特異性抗原刺激的作用，一旦激活，可以分泌細胞因子，調(diào)節(jié)或者協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)〔20〕。

綜上所述：胃腺癌腫瘤免疫細胞浸潤生物信息學(xué)研究，胃腺癌組織中初始CD4 T細胞、活化的NK細胞表達增高，具有研究價值，進一步的實驗驗證將是我們下一步研究的重點，如：增大臨床胃腺癌組織樣本，流式細胞儀測定初始CD4 T細胞、活化的NK細胞數(shù)量，CCK8檢測胃腺癌患者腫瘤組織中初始CD4 T細胞、活化的NK細胞這兩種免疫細胞的增殖功能。

記憶性B細胞、嗜酸性粒細胞、漿細胞、未活化的CD4記憶性T細胞在正常組織中表達高于胃腺癌組織，發(fā)揮著積極的固有免疫防御反應(yīng)。在Svensson等〔21〕的一項關(guān)于胃腺癌T淋巴細胞和NK細胞浸潤預(yù)后的研究中表明，腫瘤浸潤的T淋巴細胞抗腫瘤作用在很大程度上依賴于T淋巴細胞和B淋巴細胞或漿細胞之間的功能相互作用。而初始CD4 T細胞、活化的NK細胞在腫瘤組織中表達增高，表明這兩種免疫細胞在對腫瘤細胞殺傷和吞噬也發(fā)揮積極的細胞免疫和固有免疫。Oberg等〔22〕在研究her2(+)陽性的胃癌患者中，腫瘤中浸潤的T淋巴細胞和NK細胞增加了殺傷腫瘤細胞的細胞毒性作用。腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞的免疫逃脫、免疫監(jiān)視機制有關(guān)；在免疫微環(huán)境中免疫細胞與腫瘤細胞“攻-防”系統(tǒng)失去平衡，導(dǎo)致腫瘤細胞進一步生長、發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移〔23〕。Kelly〔24〕在胃癌免疫治療研究中，提到免疫細胞治療腫瘤具有重要意義。免疫微環(huán)境中，我們關(guān)于免疫細胞浸潤腫瘤組織的研究將有助于推動免疫細胞治療腫瘤這個方向的發(fā)展，篩選出在腫瘤組織中浸潤增多的初始CD4 T細胞、活化的NK細胞可以為治療胃腺癌提供新的靶標(biāo)。