番紅花小球莖乙醇提取物抗真菌活性分析

王德富，張鵬，王玉芬，杜江，牛顏冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

番紅花（Crocus SativusL.）為鳶尾科（Iridaceae）番紅花屬（Crocus）植物，以其干燥三叉柱頭入藥［1～4］，具有活血化瘀、涼血解毒、健胃等功效［5～8］。目前，番紅花主要種植在亞洲和歐洲地中海地區(qū)，其中伊朗種植面積最大，其產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的85%以上［9］。中國(guó)、法國(guó)、美國(guó)、英國(guó)和葡萄牙等國(guó)也有較小規(guī)模種植［10～12］。在我國(guó)，番紅花主要采用室內(nèi)采花、大田繁殖球莖的方式進(jìn)行栽培［13，14］。而在長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖過程中，球莖越種越小，小球莖開花少且花小，有的甚至不開花，失去藥用價(jià)值而廢棄［15，16］。目前，有關(guān)番紅花的研究大多集中在藥用部位柱頭上［17，18］，也有研究者對(duì)其花瓣、雄蕊、花粉和球莖等非藥用部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究，且發(fā)現(xiàn)這些非藥用部位含有黃酮、山奈酚、槲皮素等抗菌和抗氧化活性成分［12，19，20］，而對(duì)小球莖提取物的抑菌性能研究較少。利用西紅花非藥用部位較好的抗菌和抗氧化性能，將其開發(fā)成為一種天然添加劑應(yīng)用到食品防腐等領(lǐng)域，不僅為天然防腐劑的開發(fā)提供豐富原料，而且能變廢為寶，擴(kuò)大番紅花資源綜合利用率，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)今，食源性病菌引起的食品污染和腐敗問題極為普遍，且其防治以添加化學(xué)防腐劑為主，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅，而源于植物的天然防腐劑具有無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，已成為人們研究的熱點(diǎn)［21～23］。為了擴(kuò)大番紅花資源綜合利用率，本試驗(yàn)以番紅花小球莖（＜8 g）為研究對(duì)象，以食品中常見的6種真菌為供試菌種進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，并對(duì)球莖的有效抑菌成分進(jìn)行初步分離，以期為番紅花小球莖抑菌活性成分的純化研究奠定基礎(chǔ)，為番紅花小球莖作為食品天然防腐劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

番紅花小球莖（＜8 g）采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院番紅花種植基地；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Asppergillus niger）、桔青霉（Penicillium citrinum）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和綠色木霉（Trichoderma viride）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 小球莖處理

將洗凈的番紅花小球莖置50℃烘干，粉碎機(jī)粉碎。稱取50 g球莖粉末加入500 mL 95%乙醇中，室溫下磁力攪拌24 h后抽濾，濾渣重復(fù)提取3次，將所得濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（50℃、0.1 MPa）濃縮至深棕色膏狀物，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試藥劑配制

用無(wú)菌水溶解球莖乙醇提取物，配制成100 mg·mL-1的待測(cè)液，再用無(wú)菌水稀釋成10 mg·mL-1，采用二倍遞減稀釋法將待測(cè)液稀釋成50、25、12.5和6.25 mg·mL-1的藥液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種活化

在無(wú)菌條件下將供試菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.4 含藥培養(yǎng)基制備

準(zhǔn)確吸取1 mL 100、50、25、12.5和6.25 mg·mL-1的提取液，隨即加入9 mL熔化的PDA培養(yǎng)基（45～50℃），混合均勻制成平板，使提取物的最終濃度分別為10、5、2.5、1.25和0.625 mg·mL-1。培養(yǎng)基冷卻凝固后即為含藥培養(yǎng)基，以加入相同體積的無(wú)菌水做對(duì)照。

1.2.5 病原菌接種

用接種針將活化好的供試菌接種到5種不同濃度含藥培養(yǎng)基中央，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量菌落直徑大小，每個(gè)菌落用十字交叉法測(cè)量2次，取平均值，計(jì)算公式如下：

以提取液濃度的對(duì)數(shù)作為變量x，抑菌率轉(zhuǎn)換成幾率值作為變量y，用Execl回歸統(tǒng)計(jì)法得到毒力回歸方程，并計(jì)算其半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。

1.2.6 小球莖提取物液液萃取分離

稱取20 g球莖提取物溶于200 mL無(wú)菌水中，然后裝入500 mL分液漏斗中。先用200 mL石油醚萃取3次，合并有機(jī)相，減壓濃縮制得石油醚組分；水相繼續(xù)用200 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，減壓濃縮制得乙酸乙酯組分；水相最后再用正丁醇萃取3次，每次200 mL，合并有機(jī)相，減壓濃縮制得正丁醇組分，各分離組分保存4℃冰箱，備用。

1.2.7 酚酸類化合物成分檢測(cè)

分別配置甲液（2%三氯化鐵水溶液）和乙液（1%鐵氰化鉀水溶液），將甲乙溶液等體積混合后，取1～2滴加入1 mL提取液中，若溶液反應(yīng)呈藍(lán)色或墨綠色，證明提取液中可能含有酚酸類化合物。

1.2.8 硅膠柱層析分離活性組分

取1 g乙酸乙酯萃取膏狀物用石油醚溶解后加入預(yù)處理的層析柱中，并在樣品上方加適量脫脂棉。以石油醚∶乙醇為洗脫液，通過調(diào)節(jié)各組分的配比，逐步增大極性分步洗脫，流速為每秒3～4滴。所得各流分（每份約50 mL）經(jīng)薄層色譜（Thin Layer Chromatography，TLC）指導(dǎo)合并，各流分減壓濃縮后獲得膏狀提取物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較分析檢驗(yàn)顯著性，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 番紅花小球莖乙醇提取物抑菌活性分析

由圖1、圖2可見，球莖提取物對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制效果最好，在0.625 mg·mL-1時(shí)就分別達(dá)到了81.34%和75.65%，而同濃度提取物對(duì)米曲霉、桔青霉、綠色木霉和釀酒酵母的抑制率分別為24.86%、14.76%、31.84%和35.66%；當(dāng)提取物濃度增加到1.25 mg·mL-1時(shí)，除對(duì)米曲霉的抑制效果顯著增強(qiáng)外，對(duì)其它5種供試真菌的抑制作用增強(qiáng)不顯著；當(dāng)濃度升到2.5 mg·mL-1以上后，除釀酒酵母外，提取物對(duì)供試真菌的抑制作用隨濃度的提高而顯著增加（P＜0.05），且10 mg·mL-1的提取物能完全抑制黑曲霉、黑根霉和釀酒酵母的生長(zhǎng)，表明提取物濃度越高，對(duì)供試真菌的抑制作用越強(qiáng)。

圖1 番紅花小球莖乙醇提取物抗真菌活性分析Fig.1 Antifungal activity analysis of ethanol extracts from saffron small corm

圖2 番紅花小球莖乙醇提取物（0.625 mg·mL-1濃度）抗真菌效果Fig.2 Antifungal effects of ethanol extracts from saffron small corm

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表1），球莖提取物濃度的對(duì)數(shù)與6種供試真菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率幾率值之間均表現(xiàn)為線性相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均差異顯著（P＜0.05）。從毒力回歸方程可以看出，球莖提取物對(duì)黑根霉和黑曲霉的EC50值相對(duì)較小，分別為0.4412和0.3513 mg·mL-1，說(shuō)明球莖提取物對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制作用最強(qiáng)，而對(duì)桔青霉和米曲霉的抑制作用較弱，其EC50值分別為1.5878和1.5624 mg·mL-1。

表1 番紅花小球莖乙醇提取物對(duì)供試真菌的毒力回歸方程及EC50Table 1 The toxicity regression equation and EC50 of saffron corm ethanol extracts to the six tested fungi

提取液對(duì)供試真菌的抑菌效果的方差分析表明（表2），球莖提取物不同濃度之間對(duì)供試真菌的抑制效果均差異顯著（P＜0.05）?；谏鲜鲆志鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)將以黑曲霉和黑根霉為主要供試菌進(jìn)行活性組分的初步分離研究。

表2 番紅花小球莖乙醇提取物抗真菌活性方差分析Table 2 ANOVA analysis on antifungal activity of ethanol extracts from saffron small corm

2.2 番紅花小球莖提取物最佳抑菌活性萃取組分確定

采用三氯化鐵-鐵氰化鉀試驗(yàn)對(duì)提取液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)加入1滴等體積的三氯化鐵-鐵氰化鉀混合液后，提取液呈墨綠色（圖3），說(shuō)明其主要化學(xué)成分可能為酚酸類化合物。

圖3 番紅花小球莖乙醇提取物化學(xué)成分預(yù)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Preliminary results of chemical components for ethanol extracts from saffron small corm

為確定番紅花小球莖提取物的最佳抑菌活性萃取組分，采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)小球莖提取物進(jìn)行萃取分離，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4個(gè)萃取相。各萃取相對(duì)黑曲霉和黑根霉的抗菌效果見圖4。乙酸乙酯萃取相對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制效果最好，分別達(dá)到了89.13%和74.36%，而石油醚萃取相對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制率分別為20.95%和37.81%，正丁醇萃取相為20.97%和13.46%，均低于乙酸乙酯萃取相，水相抑制效果最差，分別為7.47%和7.33%。

圖4 番紅花小球莖乙醇提取物不同萃取組分抗真菌活性分析Fig.4 Antifungal activity analysis of saffron corm ethanol extracts with different extraction fractions

不同萃取相對(duì)黑根霉和黑曲霉抑制活性的方差分析結(jié)果表明（表3），乙酸乙酯萃取相對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制率均與其它3種萃取相差異顯著（P＜0.05），因此確定小球莖提取物乙酸乙酯萃取相含有最佳抑菌組分。

表3 番紅花小球莖乙醇提取物不同萃取組分抗真菌活性方差分析Table 3 ANOVA analysis on antifungal activity of saffron corme thanol extracts with different extraction fractions

2.3 番紅花小球莖乙酸乙酯萃取相最佳抑菌活性流分確定

將球莖提取物乙酸乙酯萃取相通過硅膠柱層析和TLC分離獲得9種流分（Fraction，F(xiàn)），以黑曲霉和黑根霉為供試菌種，分別測(cè)定了9種流分的抑菌活性。由圖5可見，9種流分中，F(xiàn)6對(duì)黑曲霉的抑制效果最好（90.95%），與F1、F5、F8、F9差異顯著（P＜0.05）。F6對(duì)黑根霉的抑制率最高（93.83%），與F2、F4、F5、F7、F8差異顯著（P＜0.05）。

圖5 番紅花小球莖提取物不同流分抗真菌活性分析Fig.5 Antifungal activity of the saffron corm ethanol extracts with different fractions

不同流分抑菌活性的方差分析結(jié)果表明（表4），不同流分對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑菌活性差異顯著（P＜0.05）。F6的抑菌效果最好，說(shuō)明F6為番紅花小球莖提取物的最佳抑菌活性組分。

表4 番紅花小球莖乙酸乙酯萃取組分不同流分的抑菌效果方差分析Table 4 ANOVA analysis on antifungal activity of the saffron corm ethanol extracts with different fractions

3 討論

番紅花球莖中含有山奈酚和飛燕草苷等活性物質(zhì)，具有較好的抗菌和抗氧化能力，這些非藥用部位可用于食品、制藥和化妝品等高端日用品的生產(chǎn)，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值［12，24］。目前番紅花栽培中產(chǎn)生的不能繼續(xù)當(dāng)作種栽的小球莖（＜8 g）往往直接作為農(nóng)業(yè)殘留物來(lái)處理，尚缺乏合理的開發(fā)與利用途徑。鑒于此，本研究以番紅花小球莖（＜8 g）為原料，開展其乙醇提取物抗真菌活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)番紅花小球莖乙醇提取物對(duì)黑根霉和黑曲霉具有顯著抑制作用，其EC50分別為0.3513和0.4412 mg·mL-1，且進(jìn)一步通過有機(jī)溶劑萃取和硅膠柱層析分離得到9個(gè)分級(jí)產(chǎn)物，其中F6對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制效果最好，分別達(dá)到了90.95%和93.83%。因此，確定F6為番紅花小球莖乙醇提取物的最佳有效抑菌組分，但其具體抑菌機(jī)理尚不清楚。已有研究表明，天然產(chǎn)物抑菌主要通過降解細(xì)胞壁、損傷質(zhì)膜結(jié)構(gòu)、抑制膜蛋白合成、引起胞內(nèi)物質(zhì)滲漏、降低胞內(nèi)代謝活動(dòng)相關(guān)酶活力等方式，引起機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致菌體死亡而發(fā)揮抑菌作用［25～27］。而本研究得到的番紅花小球莖乙醇提取物具體是通過上述其中的一條途徑或多條途徑來(lái)有效抑制真菌生長(zhǎng)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。陳娜等［28］研究表明西紅花非藥用部位富含黃酮、酚酸、皂苷和多糖等化合物，而本研究通過三氯化鐵-鐵氰化鉀試驗(yàn)初步測(cè)定番紅花小球莖乙醇提取液中含有酚酸類化合物，但其具體以那種酚酸種類和分子結(jié)構(gòu)存在還需進(jìn)一步鑒定。

研究表明許多植物提取物都具有抗菌活性，但一種植物中有效的抗菌成分不可能抑制所有微生物［29］。如果實(shí)驗(yàn)中選擇了不合適的待測(cè)試微生物種類，則含有高活性抗菌成分的植物將被忽視。因此，實(shí)驗(yàn)中必須以從腐敗產(chǎn)品中直接分離出來(lái)的微生物為測(cè)試對(duì)象，針對(duì)這類微生物開展源于植物提取物的潛在抗菌活性研究，從延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期的角度來(lái)看，這樣的研究結(jié)果或發(fā)現(xiàn)更具針對(duì)性和應(yīng)用價(jià)值。本研究中選擇的待測(cè)微生物大部分為食物腐敗類微生物（黑曲霉、桔青霉、黑根霉、米曲霉、綠色木霉），且抗菌活性分析表明，番紅花小球莖乙醇提取物對(duì)幾種典型食源性真菌均有潛在的抑制作用，特別是對(duì)黑根霉和黑曲霉的抑制作用最為顯著。另有研究表明，一些植物源化合物既有一定的抗細(xì)菌活性也有一定的抗真菌活性［30～33］，而本研究?jī)H揭示了番紅花小球莖乙醇提取物具有潛在的抗真菌能力，其是否具有抗細(xì)菌活性還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前，已開展了大量的植物提取物體外抗菌活性研究，但關(guān)于食品體內(nèi)的研究很少，可能是因?yàn)橹参锾崛∥镌谑称穬?nèi)產(chǎn)生的抑制作用沒有體外效果明顯。而這種抑菌有效性降低可能是大多數(shù)研究中都使用了粗提物，因粗提物中含有糖苷形式的類黃酮，其中的糖會(huì)降低對(duì)某些菌體的有效性［34，35］。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)也獲得了較好的抗真菌活性結(jié)果，但將其運(yùn)用于食品添加劑領(lǐng)域，其適宜添加量的確定以及是否對(duì)食品感官特性存在潛在不利影響，還需開展更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)番紅花提取物在未來(lái)食品中作為天然防腐劑的可行性。

4 結(jié)論

番紅花小球莖乙醇提取物對(duì)6種供試真菌均有一定抑制作用，其中對(duì)黑根霉和黑曲霉的抑制作用最為顯著（P＜0.05），其EC50分別為0.3513 mg·mL-1和0.4412 mg·mL-1，且隨著提取物濃度的增高，其抑菌效果也在增強(qiáng)，當(dāng)提取物濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑菌率達(dá)到100%；此乙醇粗提物的乙酸乙酯萃取組分對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑制效果最好，其抑菌率分別達(dá)到了89.13%和74.36%，且該萃取組分經(jīng)硅膠柱層析分離獲得9個(gè)分級(jí)產(chǎn)物，其中F6對(duì)黑曲霉和黑根霉的抑菌率達(dá)90.95%和93.83%，說(shuō)明F6為番紅花小球莖提取物的最佳有效抑菌組分。