環(huán)磷酰胺致小鼠免疫器官損傷的組織學(xué)研究

曹楠，八曉敏，洪龍勝，鄧媛，李婉雁，黃運茂，田允波，許丹寧*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動物科技學(xué)院，廣東 廣州510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州510225；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物衛(wèi)生研究所，廣東 廣州510640）

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）在20世紀(jì)60年代開始廣泛用于治療自身免疫性疾病及作為腫瘤疾病的化療用藥，但過量使用時，會產(chǎn)生劑量依賴性的毒性臨床表現(xiàn)［1］。CTX對細(xì)胞的毒性作用主要表現(xiàn)為骨髓抑制和白細(xì)胞、血小板下降，阻斷淋巴母細(xì)胞生長發(fā)育、T/B細(xì)胞的分化過程，因此，對機(jī)體細(xì)胞和體液免疫都有抑制作用。通常在用藥后7～14 d達(dá)到高峰，停藥15 d后機(jī)體慢慢自行恢復(fù)［2］。CTX在體內(nèi)代謝過程中，不僅直接作用于細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用，還對胸腺、脾臟及骨髓等免疫器官有明顯的損傷，科研人員利用CTX的毒性作用制備免疫抑制動物模型，可以獲得良好的免疫抑制效果，從而用于不同目的的科學(xué)探索試驗中［3，4］。

有研究發(fā)現(xiàn)，CTX可以引起小鼠白細(xì)胞數(shù)量降低，造成小鼠胸腺、脾臟和骨髓組織及細(xì)胞的損傷［5］。付晶等［6］發(fā)現(xiàn)，CTX可導(dǎo)致雛雞肝臟組織細(xì)胞線粒體明顯受損，并發(fā)生細(xì)胞凋亡。也有研究證明了通過不同方式給予小鼠CTX都可以引起小鼠骨髓微核率逐漸增大［7］。然而目前對于CTX的研究多集中在對各個免疫器官的影響，缺乏對于免疫器官的系統(tǒng)性、整體性研究。此外，CTX的使用劑量、作用時間、給藥方式等的不同，對機(jī)體免疫功能的抑制效果也不同。據(jù)此，本研究選用低、中、高3種不同濃度的CTX，連續(xù)3 d對昆明小鼠進(jìn)行腹腔注射，建立免疫抑制小鼠模型，觀察在不同濃度的CTX作用下，小鼠的胸腺、脾臟、白細(xì)胞及骨髓組織的病理損傷變化，為建立合適的免疫抑制小鼠模型提供組織學(xué)的試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

32只5周齡雌性SPF級昆明小鼠，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試驗材料

注射用CTX：國藥準(zhǔn)字H14023686，山西普德藥業(yè)股份有限公司；HE染色液及Giemsa染色液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛、戊二醛：廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗分組及設(shè)計

將32只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對照組（C組）、CTXⅠ組、CTXⅡ組、CTXⅢ組，組間小鼠平均體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）。對照組小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL，CTXⅠ組、CTXⅡ組、CTXⅢ組小鼠分別按40、100、160 mg·kg-1·BW-1劑量腹腔注射CTX溶液，連續(xù)3 d，注射后第7天采集樣品并保存。整個試驗期嚴(yán)格按照昆明小鼠飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程［GB14925-2010］進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3.2 體重及胸腺、脾臟指數(shù)測定

采集樣品前，小鼠禁食12 h，稱重后安樂死小鼠，快速摘取小鼠胸腺及脾臟，稱重記錄，按公式：器官指數(shù)=器官重（mg）/體重（g），計算胸腺和脾臟指數(shù)。

1.3.3 胸腺、脾臟和骨髓組織結(jié)構(gòu)觀察

預(yù)冷剪刀及尖鑷迅速摘取小鼠胸腺及脾臟組織，修成1 mm3左右的近方形組織塊，置于2.5%戊二醛溶液并在4℃保存，送廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心制備透射電鏡切片并拍照。取小鼠胸腺、脾臟及左側(cè)股骨，修成3～5 mm3左右組織塊，置于多聚甲醛溶液中保存，制備切片進(jìn)行H.E.染色，成片于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 外周血白細(xì)胞比例測定

剪除小鼠尾尖采血滴于潔凈載玻片一側(cè)，另取載玻片進(jìn)行推片，使血膜呈舌狀，自然干燥后進(jìn)行Giemsa染色，油鏡下觀察白細(xì)胞形態(tài)，每組每只小鼠取4張血涂片，每張血涂片計數(shù)200個白細(xì)胞，分別計算中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞比例（%）。

1.3.5 骨髓PCE微核率測定

安樂死小鼠后，摘取小鼠胸骨及右側(cè)股骨，將胸骨縱向切開，用PBS將每一節(jié)胸骨中的骨髓沖洗至離心管中，股骨剪斷兩端骨骺，用PBS將股骨中的骨髓沖洗至離心管中，混勻后骨髓懸濁液1000 r·min-1離心5 min后棄去上清液，取20μL用于制作骨髓涂片，自然晾干后滴加甲醇固定5 min，Giemsa染色。每組每只小鼠計數(shù)1000個多染紅細(xì)胞（PCE）微核率，以千分率（‰）為單位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，選擇單因素方差分析LDS多重比較法分析組間數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±S.D.）表示，P＜0.05時認(rèn)為顯著性差異；組織石蠟切片、血涂片及骨髓涂片采用CCD顯微成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的CTX對小鼠體重、胸腺、脾臟指數(shù)及組織結(jié)構(gòu)的影響

3個CTX組間小鼠的體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05））（表1），與對照組相比，CTX組小鼠的體重和胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05），CTXⅡ組和CTXⅢ組胸腺指數(shù)顯著低于CTXⅠ組（P＜0.05）。脾臟指數(shù)隨CTX濃度的升高而降低，但差異不顯著（P＞0.05）。

表1 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及體重變化Table 1 Variations of thymus and spleen index and body weight of mouse in each group

對照組小鼠胸腺發(fā)育良好，皮質(zhì)、髓質(zhì)區(qū)分界明顯，皮質(zhì)層較厚，胸腺細(xì)胞排列密集有序，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體，胸腺細(xì)胞數(shù)量較多。CTXⅠ組小鼠胸腺皮質(zhì)層厚度與對照組接近，低倍鏡下與對照組無差異，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體，但胸腺細(xì)胞著色較淺（1000X）。CTXⅡ組和CTXⅢ組小鼠胸腺結(jié)構(gòu)紊亂，皮髓分界模糊，皮質(zhì)區(qū)面積縮小，胸腺細(xì)胞排列疏松，形態(tài)差異較大，髓質(zhì)區(qū)偶見胸腺小體，成熟的胸腺細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡細(xì)胞增多，纖維細(xì)胞增多，纖維增生現(xiàn)象明顯（圖1）。

圖1 各組小鼠的胸腺組織結(jié)構(gòu)（H.E.染色，上100×，下1000×）Fig.1 Thymus tissue structure of mouse in each group（H.E.staining，upper 100×，lower 1000×）

超微結(jié)構(gòu)觀察可見對照組小鼠胸腺細(xì)胞形態(tài)良好，排列整齊，核質(zhì)比較大，核內(nèi)異染色質(zhì)團(tuán)塊較多，核仁清晰可見，細(xì)胞器簡單，最常見線粒體結(jié)構(gòu)（圖2）。CTXⅠ組小鼠胸腺細(xì)胞有明顯的病理變化，主要以凋亡為主，也可見自噬小體，胞核內(nèi)異染色質(zhì)濃縮、邊集和中集，細(xì)胞內(nèi)有髓樣小體，線粒體腫脹。CTXⅡ組中壞死細(xì)胞數(shù)量劇增，凋亡小體也隨處可見，大部分胸腺細(xì)胞胞核萎縮，異染色質(zhì)結(jié)塊聚集，常染色質(zhì)缺失，線粒體腫脹變形。CTXⅢ組是損傷最嚴(yán)重，除了上述病理表現(xiàn)外，大部分胸腺細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴和脂褐素沉積，表明細(xì)胞處于瀕死崩解階段。

圖2 各組小鼠的胸腺超微結(jié)構(gòu)（TEM，上1500×，下10000×）Fig.2 The ultrastructure of the thymus of mice in each group（TEM，upper1500×，lower10000×）

對照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓、紅髓分界清晰，白髓部分動脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，少見脾小結(jié)，淋巴細(xì)胞密度大，排列整齊，中央動脈結(jié)構(gòu)良好（圖3）。CTX組小鼠脾臟白髓處動脈周圍淋巴鞘隨著CTX濃度升高而逐漸變薄，淋巴細(xì)胞著色變淺，排列稀疏，白髓和紅髓難以區(qū)分。CTXⅠ組中央動脈管壁疏松，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，CTXⅡ、CTXⅢ組小鼠脾臟紅髓區(qū)出現(xiàn)髓外造血現(xiàn)象，有許多散在的巨核系前體細(xì)胞，核高度分葉，胞漿豐富性。

圖3 各組小鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)（H.E.染色，上100×，下1000×）Fig.3 Spleen tissue structure of mice in each group（H.E.staining，upper 100×，lower 1000×）

超微結(jié)構(gòu)可見對照組小鼠脾臟中各類細(xì)胞形態(tài)良好，未見異?，F(xiàn)象，成熟的淋巴細(xì)胞較多，還可見漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等（圖4）。CTX組小鼠脾臟細(xì)胞密度比對照組小，排列不規(guī)則，也主要以凋亡為主，胞核萎縮，異染色質(zhì)高度聚集，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞漿和細(xì)胞器病理變化不如胸腺細(xì)胞明顯，CTXⅡ組和CTXⅢ組凋亡及壞死的細(xì)胞明顯多于CTXⅠ組，并出現(xiàn)較多的巨核系前體細(xì)胞。

圖4 各組小鼠的脾臟超微結(jié)構(gòu)（TEM，上1500×，下10000×）Fig.4 The ultrastructure of the spleen of mice in each group（TEM，upper 1500×，lower 10000×）

2.2 不同濃度的CTX對小鼠白細(xì)胞比例、PCE微核率及骨髓結(jié)構(gòu)的影響

表2結(jié)果顯示，與對照組相比，3個CTX組小鼠血液中性粒細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），淋巴細(xì)胞比例顯著下降（P＜0.05），CTXⅢ組小鼠的中性粒細(xì)胞比例顯著高于CTXⅠ組和CTXⅡ組（P＜0.05），淋巴細(xì)胞比例顯著低于這2組（P＜0.05）。單核細(xì)胞比例在4組間沒有顯著性差異（P＞0.05）。從圖5可以看出，對照組小鼠白細(xì)胞形態(tài)正常，中性粒細(xì)胞胞核一般為2～4葉，處于成熟狀態(tài)，淋巴細(xì)胞核質(zhì)比大，體積小，單核細(xì)胞核分葉情況極少，絕大部分呈現(xiàn)蠶豆形或腎型。CTX組中隨著CTX濃度的升高，中性粒細(xì)胞核分葉減少，桿狀核增多，單核細(xì)胞分葉增多，淋巴細(xì)胞核質(zhì)比逐漸降低。CTXⅢ組中死亡的中性粒細(xì)胞數(shù)量最多，表現(xiàn)為細(xì)胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物溢出，僅有核存在。CTX組小鼠骨髓PCE微核率均顯著高于對照組，CTX組之間均差異顯著（P＜0.05）（圖6）。

圖5 各組小鼠的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞形態(tài)（Giemsa染色，1000×）Fig.5 The morphology of neutrophils，lymphocytes and monocytes in each group of mice（Giemsa stain，1000×）

圖6 各組小鼠的骨髓PCE微核（Giemsa染色，1000×）Fig.6 Bone marrow PCE micronucleus of mice in each group（Giemsa stain，1000×）

表2 各組小鼠3種白細(xì)胞比例及骨髓PCE微核率變化Table 2 Changes of the ratio of 3 types of white blood cells and the rate of PCE micronucleus in mice

骨髓切片顯示，對照組小鼠股骨骨結(jié)構(gòu)正常，骨髓豐滿，細(xì)胞密集，髓性造血干細(xì)胞中的粒系、紅系及巨核細(xì)胞系發(fā)育良好，可見成熟的淋巴細(xì)胞（圖7）。CTXⅠ組小鼠骨組織與對照組相近，僅骨髓細(xì)胞數(shù)量稍少，其余結(jié)構(gòu)未見明顯異常，骨髓內(nèi)細(xì)胞形態(tài)及種類也能保持正常。CTXⅡ、CTXⅢ組小鼠骨組織與對照組相比有顯著差異，骨髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)量急劇下降，各細(xì)胞系的細(xì)胞核淡染，發(fā)育不良，粒系細(xì)胞量相對增多，成熟的淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)大量紅細(xì)胞，并有纖維增生現(xiàn)象。

圖7 各組小鼠的股骨組織結(jié)構(gòu)（H.E.染色）Fig.7 Femur tissue structure of mice in each group（H.E.staining）

3 討論

3.1 CTX對小鼠胸腺、脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

CTX是經(jīng)典的腫瘤化療藥物，具有強(qiáng)烈的骨髓抑制及免疫抑制作用，在自身免疫性疾病和器官移植中廣泛應(yīng)用［8］，也是制備免疫抑制動物模型最常用的藥物，但應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康?，對CTX的用法及用量進(jìn)行條件探索。本試驗連續(xù)3 d對小鼠腹腔注射不同濃度的CTX，7 d后觀察到所有CTX組小鼠體重顯著減輕。胸腺指數(shù)隨CTX濃度的升高而顯著降低，但脾臟指數(shù)與對照組無顯著性差異，可能是因為胸腺作為中樞免疫器官，內(nèi)部絕大部分是處在不同發(fā)育時期的胸腺細(xì)胞，CTX可直接抑制胸腺細(xì)胞的正常發(fā)育，導(dǎo)致大量胸腺細(xì)胞死亡［9］，又因骨髓抑制作用，淋巴祖細(xì)胞遷入胸腺途徑受阻，胸腺細(xì)胞得不到及時的補(bǔ)充，因此在CTX作用下，胸腺重量減輕更顯著。脾臟是外周免疫器官，內(nèi)部免疫細(xì)胞主要是可執(zhí)行功能的成熟細(xì)胞，而CTX主要對處于增殖周期階段的細(xì)胞具有強(qiáng)烈的毒性作用［10］。與此同時，脾臟又具備儲血、濾血及髓外造血功能，所以各CTX組小鼠脾臟指數(shù)與對照組差異不顯著。

組織學(xué)結(jié)果顯示，CTX對小鼠胸腺和脾臟造成的共同損傷主要表現(xiàn)在內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量明顯減少、大量細(xì)胞凋亡和壞死。在光學(xué)顯微鏡下，CTXⅠ組小鼠的胸腺和脾臟基本能維持正常結(jié)構(gòu)，CTXⅡ組和CTXⅢ組小鼠胸腺和脾臟結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，胸腺有嚴(yán)重的纖維增生現(xiàn)象，脾臟白髓區(qū)動脈周圍淋巴鞘變薄，F(xiàn)rancesco等［11］指出，CTX對脾臟中CD8+T細(xì)胞的清除效力在50%左右，而骨髓中未被激活的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量則未受到CTX的影響，這項研究從細(xì)胞實驗角度解釋了本實驗中CTXⅡ組和CTXⅢ組小鼠動脈周圍淋巴鞘變薄的現(xiàn)象。此外，脾臟紅髓區(qū)發(fā)生髓外造血，出現(xiàn)大量巨核系前體細(xì)胞，屬于三系髓外造血類型，出現(xiàn)髓外造血與CTX造成的小鼠骨髓抑制密切相關(guān)，并具有劑量依賴性。髓外造血指的是發(fā)生于骨髓腔以外的器官或組織的造血增生現(xiàn)象，當(dāng)具有造血功能的骨髓出現(xiàn)功能障礙時，脾臟、肝臟及淋巴結(jié)會恢復(fù)胚胎時期的造血功能，一般嚙齒動物自發(fā)的髓外造血較其他動物品系更常見，特別是小鼠［12］。產(chǎn)生髓外造血的生理依據(jù)是肝脾器官在幼齡期本身具備造血功能，成年后依然保留有造血干細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)骨髓造血障礙、骨髓抑制、炎癥、損傷及修復(fù)時，會激發(fā)脾臟和肝臟出現(xiàn)代償性的髓外造血，也有研究認(rèn)為髓外造血的發(fā)生不是肝脾內(nèi)造血干細(xì)胞發(fā)揮作用，而是來源于骨髓造血干細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝脾定居而產(chǎn)生［13，14］。本試驗電鏡結(jié)果顯示，CTXⅠ組小鼠胸腺和脾臟內(nèi)部的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于對照組，CTXⅡ組和CTXⅢ組的壞死細(xì)胞數(shù)量顯著增多，其中胸腺細(xì)胞被破壞的更加嚴(yán)重，細(xì)胞器病理損傷嚴(yán)重，瀕死和死亡細(xì)胞數(shù)量高于脾臟內(nèi)部細(xì)胞，而脾臟以細(xì)胞凋亡為主。Victoria等［15］用200 mg·kg-1·BW-1CTX對大鼠肌肉注射7 d后，觀察到大鼠胸腺中出現(xiàn)大量漿細(xì)胞和活性巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的有絲分裂活性降低，這與本試驗結(jié)果差異較大，可能CTX的劑量及試驗動物品種的不同對胸腺造成的損傷也不同，在大劑量長期應(yīng)用CTX的情況下，不僅直接損害胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞，還可能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞發(fā)生遷移。包匯慧等［16］采用10 mg·kg-1·BW-1CTX經(jīng)口染毒大鼠連續(xù)28 d后，觀察胸腺和脾臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，胸腺和脾臟結(jié)締組織增生，胸腺皮質(zhì)部淋巴細(xì)胞排空，脾細(xì)胞早期凋亡和壞死細(xì)胞顯著升高，是制備脾細(xì)胞免疫抑制模型的最適劑量和用法。這與本試驗得出的結(jié)果略有差異，而楊敬等［17］采用100 mg·kg-1·BW-1CTX連續(xù)腹腔注射4 d，注射后d 4觀察Balb/c小鼠脾臟的組織結(jié)構(gòu)則得出了與本試驗近似的結(jié)論。說明在低濃度的CTX長期作用下，脾臟并未發(fā)生髓外造血，而主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞的缺失并發(fā)結(jié)締組織增生的病理現(xiàn)象，而中、高濃度的CTX短期作用下，骨髓造血干細(xì)胞缺失較多，脾臟啟動造血功能，發(fā)生髓外造血，這是機(jī)體自我修復(fù)的表現(xiàn)。上述結(jié)果表明，CTX使用劑量及作用時間對胸腺和脾臟的病理組織學(xué)的影響差異很大，與CTX的致病機(jī)理及試驗動物自身的調(diào)節(jié)能力密切相關(guān)。

3.2 CTX對小鼠外周血白細(xì)胞比例及骨髓PCE微核率的影響

小鼠股骨石蠟切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTXⅠ組小鼠股骨結(jié)構(gòu)也與對照組接近，同樣在CTX濃度超過100 mg·kg-1·BW-1時出現(xiàn)明顯的病理損傷，髓性造血干細(xì)胞的數(shù)量顯著下降。CTX是一種烷化劑，對造血干細(xì)胞的影響很大，因其醛脫氫酶含量高而對巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的影響更大，因此在高濃度CTX作用下，骨髓單個核細(xì)胞（Bone Marrow Mononuclear Cells，BMNC）中的巨核系細(xì)胞減少最多［18］。He等［19］在研究中采用腹腔注射100 mg·kg-1CTX制備化學(xué)損傷小鼠模型，檢測BMNC中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1（SHP-1）及凋亡相關(guān)基因Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CTX組SHP-1和Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，SHP-1是JAK/STAT信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，能顯著抑制這條途徑，從而影響造血干細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡過程。而凋亡關(guān)鍵基因Bax表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，因此，CTX可能是通過影響上述基因的表達(dá)，從而對骨髓細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑 制 作 用。曹 勝 男 等［20］采 用20 mg·kg-1·BW-1CTX灌胃連續(xù)處理小鼠14 d，檢測小鼠股骨干重較對照組減少28%，股骨橫徑減少9.64%，骨鈣含量下降32.54%，差異極顯著，這項研究表明，CTX不僅對骨髓細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用，還可能對骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而使骨膠原的合成和分泌減少，導(dǎo)致鈣鹽沉積減少，骨鈣流失，造成骨質(zhì)疏松。

血涂片和骨髓涂片結(jié)果顯示，與對照組相比，CTX組小鼠中性粒細(xì)胞比例顯著升高，淋巴細(xì)胞比例顯著下降，單核細(xì)胞比例變化不明顯。且在相同倍數(shù)視野下觀察發(fā)現(xiàn)，CTX組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組，且CTXⅡ組和CTXⅢ組小鼠的各類白細(xì)胞形態(tài)均與對照組有顯著差異，瀕死白細(xì)胞數(shù)量增多。也有研究人員指出，連續(xù)5 d給予昆明小鼠腹腔注射50 mg·kg-1·BW-1CTX，12 h后檢測發(fā)現(xiàn)小鼠的淋巴細(xì)胞百分比較對照組顯著升高，而中性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比均顯著下降［21］。田嘉軍等［22］采用經(jīng)口灌胃法給予昆明小鼠100 mg·kg-1·BW-1的CTX連續(xù)3 d，24 h后檢測小鼠的中性粒細(xì)胞百分比為45.26%，淋巴細(xì)胞百分比為50.18%，單核細(xì)胞百分比為0.62%。上述試驗結(jié)果均在24 h內(nèi)檢測各類白細(xì)胞百分比，得出了與本研究不同的結(jié)論，由此可推測，CTX作用后對小鼠白細(xì)胞比例的影響是一個動態(tài)變化的過程，在白細(xì)胞絕對數(shù)值顯著下降的情況下，初期中性粒細(xì)胞比例顯著下降，淋巴細(xì)胞比例上升，而到后期淋巴細(xì)胞的比例顯著下降，中性粒細(xì)胞百分比顯著上升。

此外，CTX組小鼠的骨髓PCE微核率也顯著升高，分別比對照組高出2.69、8.44、11.20倍，研究 結(jié) 果 與 付少 華 及Lyris等 相一 致［23，24］。王 文蔚等［25］研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠一次性腹腔注射60～90 mg·kg-1·BW-1CTX溶液后，36～48 h時就發(fā)現(xiàn)骨髓PCE微核率的顯著升高，表明低濃度的CTX單次作用就可對骨髓紅系細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生明顯的損傷。因此，骨髓PCE微核率指標(biāo)可用來判斷藥物或毒物對細(xì)胞染色體的損傷程度，微核出現(xiàn)的頻率取決于染色體斷裂或丟失的速率以及細(xì)胞分裂的速率，雖然幾乎所有正在分裂的細(xì)胞都可產(chǎn)生微核，但在任何有誘導(dǎo)染色體畸變的藥物作用下，骨髓PCE微核率會顯著上升［26］。本試驗結(jié)果也進(jìn)一步證實了CTX對骨髓造血干細(xì)胞的強(qiáng)烈抑制作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本文從病理組織學(xué)的角度，對昆明小鼠的胸腺、脾臟、骨組織及血液中白細(xì)胞比例和骨髓PCE微核率指標(biāo)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)100 mg·kg-1·BW-1的CTX可顯著降低小鼠體重及胸腺指數(shù)，導(dǎo)致胸腺結(jié)構(gòu)紊亂，纖維增生，胸腺細(xì)胞凋亡及大量壞死，脾臟白髓區(qū)動脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)消失，發(fā)生髓外造血，脾細(xì)胞凋亡數(shù)量劇增，骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量減少，血液中白細(xì)胞比例失衡，骨髓PCE微核率顯著升高，是造模的最佳注射劑量。