迷迭香精油對(duì)紫色桿菌群體感應(yīng)抑制實(shí)驗(yàn)

施宇，黃小芹，王文婷，楊輝祥，潘磊，丁弘揚(yáng)，葉鑌姬，李永裕

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/園藝植物天然產(chǎn)物研究所，福建 福州350002）

植物細(xì)菌性病害在全世界范圍內(nèi)有不同程度發(fā)生，對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失。致病細(xì)菌寄主植物眾多，主要包括十字花科、茄科、豆科、傘形科和葫蘆科等多種蔬菜及多種觀賞花卉植物［1，2］。傳統(tǒng)的防治方法多采用培育和利用抗病品種及使用化學(xué)殺菌劑，但是由于抗病育種的周期長，病原小種的分化速度往往超過品種更新?lián)Q代的速度；而化學(xué)防治細(xì)菌病害效果大多不很理想，長期使用對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生選擇耐藥性，且污染環(huán)境［3］。

細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）是響應(yīng)細(xì)菌密度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制，由信號(hào)分子合成酶和信號(hào)分子接受蛋白組成。研究表明，細(xì)菌QS系統(tǒng)調(diào)控多種致病因子的表達(dá)和分泌，包括色素、生物膜、群集運(yùn)動(dòng)、胞外酶、生物發(fā)光等［4，5］。紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）為β-變形菌屬革蘭氏陰性菌，具有唯一的QS系統(tǒng)（CviI-CviR型系統(tǒng)）。許多表型特征和代謝產(chǎn)物都與群體感應(yīng)調(diào)控有關(guān)，包括：抗生素、氰化物、彈性蛋白酶、各種胞外酶、紫色桿菌素、生物膜形成和群集運(yùn)動(dòng)等［6～8］。由于C.violaceum產(chǎn)生肉眼可見的紫色桿菌素，且受QS嚴(yán)格調(diào)控［9］，因此被作為研究細(xì)菌QS系統(tǒng)的模式菌株。紫色桿菌CV 026是源自C.violaceumATCC31532的突變體，缺失了信號(hào)分子合成基因cviI，因此需加入外源信號(hào)分子才能產(chǎn)生紫色桿菌素，常被用于檢測細(xì)菌信號(hào)分子和篩選群體感應(yīng)抑制劑（Quorum Sensing Inhibitor，簡稱QSI）開發(fā)以細(xì)菌QS為靶標(biāo)的抗毒力藥物，能夠在不影響病原菌正常生長的前提下，干擾毒力因子的產(chǎn)生，控制病害，并且使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性。

植物精油（Essential Oil，精油）取自天然芳香植物，綠色環(huán)保，安全無毒，具有廣譜的抗菌活性，有效殺菌濃度一般在微摩爾水平，且不同植物精油之間具有協(xié)同抗菌作用［10］，以植物精油作為QS抑制劑的研究越來越受到人們的關(guān)注。前人研究發(fā)現(xiàn)阿魏精油、綠薄荷精油、香樟精油、千層金精油等都對(duì)細(xì)菌QS具有潛在的起始抑制活性［11～14］。迷迭香（Rosmarinus officinalis）為唇形科迷迭香屬常綠亞灌木，原產(chǎn)于地中海地區(qū)。迷迭香精油是優(yōu)良的抗氧化劑，同時(shí)具有廣譜的抗真菌和細(xì)菌活性［15～17］。但是迷迭香精油作為細(xì)菌QS抑制劑的研究未見報(bào)道。本研究以模式菌紫色桿菌Chromobacterium violaceumATCC31532為研究菌株，對(duì)迷迭香精油的QS抑制活性進(jìn)行研究，為迷迭香精油更廣泛的利用提供理論參考，對(duì)豐富和創(chuàng)新群體感應(yīng)抑制劑開發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及菌株

迷迭香植物材料為1～2年生枝條，產(chǎn)地為上海地區(qū)，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。野生型紫色桿菌 ATCC31532（ChromobacteriumviolaceumATCC31532）、紫 色 桿 菌CV 026（Chromobacterium violaceumCV 026）、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacterium carotovorumsubsp.Carotovoru）、大 腸 桿 菌ATCC25922（Escherichia coliATCC25922）、銅 綠假 單 胞 菌PAO1（PseudomonasaeruginosaPAO1）、粘質(zhì)沙雷氏菌MG1（Serratia marcescensMG1）、白色粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）保存于本實(shí)驗(yàn)室。CV 026為紫色桿菌信號(hào)分子合成酶CviI缺失型的突變體，需加入外源信號(hào)分子才能誘導(dǎo)紫色桿菌素的合成。所有細(xì)菌1%接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1活化13 h。將上述活化后的細(xì)菌按照菌液、60%甘油1∶1混合，保存于-80℃冰箱。在使用時(shí)，將保存好的菌液按1%接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r·min-1培養(yǎng)12 h。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

卡那霉素（全式金公司，中國北京）、結(jié)晶紫（Crystal Violet，CV，Solarbio公司，中國北京）、PBS緩沖液（Solarbio公司，中國北京）。

LB固體和液體培養(yǎng)基：酵母提取物（Yeast Extract）5 g、NaCl 5 g、蛋白胨（Tryptone）10 g，加水定容至1 L，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g·L-1。

Swimming培養(yǎng)基：蛋白胨（Tryptone）1%、NaCl 0.5%、瓊脂（Agar）0.3%，加水溶解定容至1 L。

Swarming培養(yǎng)基：蛋白胨（Tryptone）1%、Na-Cl 0.5%、瓊脂（Agar）0.5%、D-葡萄糖（D-glucose）0.5%加水溶解定容至1 L。

所有培養(yǎng)基分裝后高壓鍋中121℃滅菌20 min備用。

1.3 主要儀器

電子調(diào)溫電熱套（98-1-B型，天津市泰斯特儀器有限公司，中國），恒溫循環(huán)器（HX-1050，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5811型，Eppendorf公司，德國）；光學(xué)顯微鏡（上海上光儀器有限公司，中國），多功能酶標(biāo)儀（ELISA，iMark，Bio-Bad公司，美國），恒溫培養(yǎng)搖床（ZHWY-200B型，上海智城分析儀器有限公司，中國），紫外分光光度計(jì)（U-290型，Hitachi公司，日本），生化培養(yǎng)箱（BPMJ-150F型，上海一恒公司，中國）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 迷迭香精油提取

迷迭香精油樣品的提取采用水蒸氣蒸餾法。取迷迭香枝條（含莖和葉）50～100 g，將植物材料與水按1∶10比例置于精油提取裝置中，提取2～3 h，收集精油后離心，吸取油相，計(jì)算精油提取率后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。精油提取率?jì)算方法：

M1為所得精油質(zhì)量；M0為提取前物料鮮重。

1.4.2 迷迭香精油成分分析

測定迷迭香精油組成成分，可以篩選并分離精油中具有群體感應(yīng)抑制活性的主效成分，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為明確迷迭香精油的群體感應(yīng)抑制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在色譜瓶中加入1 mL色譜級(jí)甲醇和1‰（v/v）精油。洗液瓶中加入色譜級(jí)甲醇。使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器GC-MS（GC，Clarus?680；MS，SQ8T；Perkin Elmer Company，America）分析。色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×25 mm×0.25μm），載氣為高純氦氣，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度為250℃。升溫程序?yàn)椋?0℃保持3 min，以3℃·min-1的速率升溫至100℃，維持2 min；再以5℃·min-1的速率升溫至160℃，維持2 min；最后以50℃·min-1的速率升溫至250℃，維持2 min。進(jìn)樣量為1 L，分流比20∶1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，溶劑延遲1.9 min，離子源溫度為230℃，掃描質(zhì)量范圍45～500 m/z。

1.4.3 迷迭香精油的廣譜抑菌活性測定

通過平板計(jì)數(shù)法，計(jì)算每毫升菌液所含菌落數(shù)（CFU·mL-1），并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果將細(xì)菌濃度控制在同一數(shù)量級(jí)。具體為：在培養(yǎng)皿中加入20 mL溶化的LB固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌水將活化12 h的細(xì)菌菌液稀釋至原濃度的10-5、10-6、10-7、10-8共4個(gè)濃度，在培養(yǎng)基表面加入菌液100μL，用三角推將菌液涂抹均勻。在30℃下培養(yǎng)12～24 h。選擇適合計(jì)數(shù)的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。

采用抑菌圈法測定了不同濃度精油對(duì)紫色桿菌ATCC31532、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌PAO1、粘質(zhì)沙雷氏菌MG1、白色粘質(zhì)沙雷氏菌的抑菌活性。方法參照S.Andotra等［18］并做一些修改。試驗(yàn)在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。將精油用色譜級(jí)甲醇稀釋為原精油體積分?jǐn)?shù)的25%、12.5%、6.25%、3.125%共4個(gè)濃度。將20 mLLB固體培養(yǎng)基加熱融化后，冷卻到40℃左右加入1%（v/v）菌液濃度為1×108CFU·mL-1的細(xì)菌菌液，搖勻后倒板。凝固后，用直徑6 mm打孔器在培養(yǎng)基表面打孔，在孔中分別加入30～35μL不同濃度精油稀釋液。以同體積1 mg·mL-1卡那霉素（Kanamycin）作為陽性對(duì)照；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，用色譜級(jí)甲醇代替精油稀釋液。培養(yǎng)皿在30℃條件下培養(yǎng)12 h，觀察并測量透明抑菌圈大小。

1.4.4 MIC測定

迷迭香精油對(duì)野生型紫色桿菌（Chromobacterium violaceumATCC31532）的MIC測定用倍半稀釋法測定［19］。將精油與甲醇1∶1混合后，再用無菌水稀釋到精油原液的80‰、40‰、20‰、10‰、5‰、2.5‰、1.25‰。在2 mL的離心管中加入300 μL的LB液體培養(yǎng)基、300μL精油稀釋液、6μL經(jīng)12 h活化后的紫色桿菌菌液。同時(shí)設(shè)置以無菌水代替精油的陰性對(duì)照。離心管在30℃、150 r·min-1培養(yǎng)24 h。觀察混合液的渾濁情況，并在酶標(biāo)儀中測定混合液OD600值，即為細(xì)菌濃度。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.5 生長曲線測定

為了探究亞抑菌濃度（Sub-MIC）下，迷迭香精油對(duì)紫色桿菌的生長影響情況，測定在亞抑菌濃度下，紫色桿菌的生長曲線。實(shí)驗(yàn)方法參照Wang W等［13］。將精油與甲醇1∶1混合后，用無菌水稀釋至1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。在滅菌的250 mL錐形瓶中加入20 mLLB液體培養(yǎng)基、1%（v/v）活化的菌液、6%（v/v）各濃度精油稀釋液。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以無菌水代替精油稀釋液。在30℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)，在紫外分光光度計(jì)中測定混合溶液3、6、9、12、24 h時(shí)OD600值，即為細(xì)菌濃度。

1.4.6 群集運(yùn)動(dòng)測定

群集運(yùn)動(dòng)參考Packiavathy IASV等［20］方法。試驗(yàn)方法具體如下：加熱Swimming或Swarming固體培養(yǎng)基使其融化，待培養(yǎng)基溫度降至約為40℃時(shí)加入不同濃度（Sub-MIC，6% v/v）的迷迭香精油，倒入培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基凝固后，將活化12 h的紫色桿菌菌液稀釋至終濃度108CFU·mL-1，取5μL加到培養(yǎng)基中央濾紙片中，封口膜封口培養(yǎng)皿。試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照，以等體積的水代替精油。30℃條件下培養(yǎng)12～24 h，觀察運(yùn)動(dòng)直徑并拍照。

1.4.7 紫色桿菌素定量測定

測定迷迭香精油對(duì)紫色桿菌所產(chǎn)生的紫色桿菌素含量的影響，可以進(jìn)一步研究迷迭香精油對(duì)紫色桿菌QS的抑制作用。方法參考Khan MSA等［21］。試驗(yàn)在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。將迷迭香精油稀釋為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC四個(gè)濃度。在試管中加入4 mL的LB液體培養(yǎng)基、6%（v/v）精油、1%活化12 h的紫色桿菌菌液。混合液在30℃條件下培養(yǎng)24 h。吸取1 mL混合液于1.5 mL離心管中，10000 r·min-1、25℃離心5 min，使菌體和紫色桿菌素沉淀至離心管底部。去掉上清液，加入1 mL的二甲基亞砜至離心管中，使用渦旋機(jī)震蕩離心管，使紫色桿菌素充分溶解于二甲基亞砜中。10000 r·min-1、25℃再次離心5 min，去除菌體及碎屑。取上清液，在紫外分光光度計(jì)中測定上清液OD595值，即為紫色桿菌素含量。紫色桿菌素抑制率按下式計(jì)算：

A0為對(duì)照組紫色桿菌素含量；A1為處理組紫色桿菌素含量。

1.4.8 生物膜定量測定

通過定量測定紫色桿菌生物膜含量，可以從生物膜的角度進(jìn)一步確定迷迭香精油對(duì)紫色桿菌QS抑制性。參照O’Toole等［22］的方法并做一些修改。試驗(yàn)在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。將精油按照上述方法配置成MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC四個(gè)濃度的精油稀釋液。將活化12 h的紫色桿菌菌液按1%接種于LB液體培養(yǎng)基中。在96孔板中加入200μL含1%菌液的LB液體培養(yǎng)基、6%（v/v）的各濃度精油稀釋液，同時(shí)試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照，以無菌水代替精油稀釋液。每個(gè)濃度設(shè)置12個(gè)重復(fù)。將孔板在30℃條件下培養(yǎng)24 h。生物膜定量測定方法如下：將孔板內(nèi)混合液倒掉，用雙蒸水將孔板內(nèi)混合液沖洗多次，晾干。用250μL 0.1%結(jié)晶紫染料對(duì)孔板內(nèi)的生物膜染色15 min。待生物膜充分染色后，用雙蒸水將孔板內(nèi)的染料沖洗多次，晾干。在每孔中加入180μL 30%乙酸溶液，震蕩7 min，將生物膜中的結(jié)晶紫染料溶解出來。在酶標(biāo)儀單波長550 nm處測定溶液的吸光度值，即為生物膜量。生物膜抑制率按下式計(jì)算：

A0為對(duì)照組生物膜含量；A1為處理組生物膜含量。

1.4.9 生物膜光學(xué)顯微鏡觀察

利用光學(xué)顯微鏡觀測生物膜，研究精油在亞抑菌濃度下對(duì)紫色桿菌生物膜形態(tài)和含量的影響。實(shí)驗(yàn)參考Packiavathy IASV的方法［20］并做一些修改。試驗(yàn)在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。將精油用5%吐溫溶液配制成濃度1/2MIC、1/4MIC、1/8 MIC、1/16MIC的精油稀釋液。在6孔板每孔放入規(guī)格1 cm×1 cm的蓋玻片，加入5 mL的LB液體培養(yǎng)基、1%（v/v）活化12 h的紫色桿菌菌液、6%（sub-MIC，v/v）不同濃度的精油稀釋液。試驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照，以5%吐溫溶液代替精油稀釋液?？装逶?0℃條件下培養(yǎng)48 h。蓋玻片用1%的結(jié)晶紫（Crystal Violet）染色，染色方法同上。將蓋玻片翻轉(zhuǎn)覆蓋于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察生物膜分布情況。

1.4.10 已形成生物膜抑制檢測

為了確定迷迭香精油對(duì)已形成生物膜的破壞能力，進(jìn)行了生物膜破壞試驗(yàn)，方法參照Packiavathy I A S V等［19］。試驗(yàn)在無菌工作臺(tái)中進(jìn)行。在無菌96孔板，每孔加入200μL含有1%活化12 h的紫色桿菌菌液的LB液體培養(yǎng)基，置于30℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。在超凈工作臺(tái)移除孔中培養(yǎng)液并用無菌水清洗3次去除浮游細(xì)胞。隨后加入200μL含有不同濃度（Sub-MIC，6% v/v）的迷迭香精油，于30℃條件下靜置培養(yǎng)18～24 h，生物膜測量方法參考1.4.8。精油對(duì)C.violaceum已形成生物膜的抑制率按下式計(jì)算：

A0為對(duì)照組生物膜含量；A1為處理組生物膜含量。

1.4.11 信號(hào)分子（AHLs）測定

信號(hào)分子提取采用Renée S Blosser等［23］的方法，利用酸化乙酸乙酯（乙酸乙酯含0.1%冰醋酸）從細(xì)菌培養(yǎng)上清液中提取AHLs。具體為：在無菌工作臺(tái)中，50 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入1%（v/v）活化12 h紫色桿菌菌液、6%（sub-MIC，v/v）不同濃度的精油，30℃，150 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。將混合液在12000 r·min-1、4℃離心10 min，去除沉淀物。上清液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，得到100 mL乙酸乙酯萃取液。在旋蒸儀中將萃取液旋蒸至100μL，用同體積色譜甲醇溶解，得到200 μLAHLs提取液，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

AHLs定性分析采用CV 026型生物傳感器檢測，采用Joshi等［24］的方法。將紫色桿菌CV 026活化12 h后，按1%（v/v）接種于加熱融化的20 mLLB固體培養(yǎng)基中，倒入培養(yǎng)皿。凝固后，在培養(yǎng)基上打6 mm的孔。將保存的AHLs提取液用色譜甲醇稀釋100倍后，取40μL加入孔內(nèi)。同時(shí)設(shè)置色譜甲醇代替AHLs提取液的陰性對(duì)照。觀察孔周圍紫色圈的直徑并拍照。

1.4.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism8多重比較，顯著性差異P＜0.05。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上。圖表制作工具為Excel和GraphPad Prism8。

2 結(jié)果與分析

2.1 迷迭香精油主要成分測定

利用水蒸氣蒸餾法提取迷迭香枝條揮發(fā)油，稱量并計(jì)算得到精油提取率為0.78%。通過GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，通過氣相質(zhì)譜聯(lián)用的方法測定得到了迷迭香精油主要成分構(gòu)成和組分比例，結(jié)果如表1所示。由表1可見，主要成分α-蒎烯占比27.89%、桉葉油醇占比18.98%、馬鞭草烯醇占比7.56%、龍腦占比5.45%。根據(jù)表中物質(zhì)種類可知，該品種迷迭香枝條精油成分主要為萜烯類化合物，并且以單萜衍生物為主，其次為萜烯類化合物中的倍半萜衍生物和二萜衍生物。得知迷迭香精油成分構(gòu)成，可以進(jìn)一步探索迷迭香精油抑制QS的有效成分，為研究QS抑制活性成分在抑制QS的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

表1 迷迭香精油主要成分測定Table 1 Determination of main components of Sub-MIC Rosmarinusofficinalis EO

2.2 迷迭香精油抑菌廣譜性檢測

對(duì)6種細(xì)菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)6種細(xì)菌活化12 h后細(xì)菌濃度均在1×109CFU·mL-1以上，后續(xù)試驗(yàn)將菌液細(xì)菌濃度控制在1×108CFU·mL-1后使用。隨后測定了迷迭香精油對(duì)6種細(xì)菌的抑菌活性。由圖1可見，孔中精油濃度25%～3.125%（v/v）時(shí)，隨著濃度的提高，精油對(duì)6種細(xì)菌的抑菌活性隨之提高。與陽性對(duì)照相比，最高測試濃度25%（v/v）的迷迭香精油抑菌活性強(qiáng)于Kan（1 mg·mL-1）。說明迷迭香精油對(duì)于多種細(xì)菌具有較強(qiáng)抑菌活性，是一種潛在的抑菌活性物質(zhì)，可以應(yīng)用于植物病害防治工作。

圖1 迷迭香精油廣譜抑菌活性測定Fig.1 Determination of R.officinalis EO by broad-spectrum antimicrobial activity

2.3 MIC測定

試驗(yàn)采用二倍稀釋法，用濃度梯度（80‰、40‰、20‰、10‰、5‰、2.5‰、1.25‰）的精油稀釋液對(duì)紫色桿菌進(jìn)行了MIC測定。培養(yǎng)12～24 h后觀察并拍照，結(jié)果如圖2所示，精油濃度在10‰以下的各組混合液有明顯的渾濁現(xiàn)象或色素產(chǎn)生，10‰及以上濃度混合液則同樣清澈。通過酶標(biāo)儀測得混合液OD600值證實(shí)精油濃度在10‰及以上各組OD600為0.05～0.08之間，基本無菌生長，而精油濃度在10‰以下各組混合液OD600值均在0.85～0.95之間，細(xì)菌生長到達(dá)平臺(tái)期。因此測得迷迭香精油對(duì)紫色桿菌C.violaceumATCC31532）的MIC為10‰。在后續(xù)試驗(yàn)中，以MIC試驗(yàn)結(jié)果為參考，精油試驗(yàn)濃度控制在10‰以下，以確保不對(duì)細(xì)菌生長造成影響。

圖2 迷迭香精油對(duì)紫色桿菌MIC測定Fig.2 Determination of MIC of R.officinalis EO against C.violaceum

2.4 生長曲線測定

試驗(yàn)測定了Sub-MIC下，紫色桿菌在不同濃度精油處理下24 h的生長曲線，結(jié)果如圖3所示。因?yàn)樵诟鹘M混合培養(yǎng)液中精油稀釋液所占比例為6%（v/v），所以混合液中精油的終濃度遠(yuǎn)小于MIC。由圖4可見，細(xì)菌生長對(duì)數(shù)期（3～9 h），各組的OD600值變化趨勢相同，穩(wěn)定期（12～24 h）每組OD600值基本相同?？梢员ＷC在一定處理時(shí)間內(nèi)（12 h以上），Sub-MIC（20‰、10‰、5‰、2.5‰和1.25‰（6% v/v））迷迭香精油不會(huì)影響C.violaceum的正常生長。

圖3 Sub-MIC迷迭香精油處理下C.violaceum的生長曲線Fig.3 Growth curve of C.violaceum under Sub-MIC R.officinalis EO treatment

圖4 Sub-MIC處理對(duì)C.violaceum群集運(yùn)動(dòng)的影響Fig.4 Effects of EO on C.violaceum cluster motion under Sub-MIC concentration

2.5 群集運(yùn)動(dòng)檢測

群集運(yùn)動(dòng)是指細(xì)菌在培養(yǎng)基表面依賴于鞭毛的由接種點(diǎn)向周圍擴(kuò)散的群體遷移方式，對(duì)細(xì)菌的定殖和侵染有幫助且受QS參與調(diào)控。試驗(yàn)測定了Sub-MIC下，不同濃度精油（10‰、5‰、2.5‰（6% v/v））對(duì)C.violaceum群集運(yùn)動(dòng)的影響。由圖5可以看出，Swimming和Swamming試驗(yàn)中，隨著精油濃度提高，兩種運(yùn)動(dòng)遷移距離隨之變小，且與精油濃度呈負(fù)相關(guān)。說明在不影響細(xì)菌正常生長的前提下，迷迭香精油能夠抑制C.violaceum群集運(yùn)動(dòng)。

2.6 紫色桿菌素定量測定

紫色桿菌素的產(chǎn)生受QS調(diào)控，是衡量迷迭香精油對(duì)C.violaceumQS抑制性的一個(gè)指標(biāo)。試驗(yàn) 測 定 了Sub-MIC（10‰、5‰、2.5‰、1.25‰（6% v/v））下，迷迭香精油對(duì)紫色桿菌素含量的影響。由圖5可見，隨著精油濃度的提高，紫色桿菌素含量減少，抑制率提高。在10‰濃度的精油處理下，C.violaceum的紫色桿菌素含量減少85%。說明在不影響細(xì)菌正常生長情況下，迷迭香精油會(huì)對(duì)降低C.violaceum紫色桿菌素的含量。

圖5 Sub-MIC下迷迭香精油對(duì)C.violaceum色素含量的影響Fig.5 Effects of Rosmarinus officinalis EO on pigment content of C.violaceum under Sub-MIC condition

2.7 生物膜定量測定

QS參與調(diào)控C.violaceum生物膜形成，所以測定迷迭香精油對(duì)C.violaceum生物膜含量的影響。試驗(yàn)測定了迷迭香精油在Sub-MIC（10‰、5‰、2.5‰、1.25‰（6% v/v））下C.violaceum生物膜含量。在酶標(biāo)儀550 nm處測得混合液的生物膜含量，計(jì)算得到抑制率。由圖6可見，精油濃度為10‰和5‰時(shí)，生物膜抑制率相差不大且明顯大于其他兩組，抑制率分別為44%和39%，說明在不影響細(xì)菌生長條件下，迷迭香精油會(huì)對(duì)紫色桿菌的生物膜含量造成影響。但是，生物膜的減少除了精油抑制了紫色桿菌QS系統(tǒng)的可能，是否有精油降解了已經(jīng)形成的生物膜的因素，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

圖6 Sub-MIC迷迭香精油對(duì)C.violaceum生物膜含量的影響Fig.6 Effects of EO at sub-MIC concentration on C.violaceum biofilm content

2.8 生物膜光學(xué)顯微鏡觀測

對(duì)生物膜進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，可以更加直觀的看到迷迭香精油對(duì)于C.violaceum生物膜結(jié)構(gòu)和分布的影響。將經(jīng)Sub-MIC（20‰、10‰、5‰、2.5‰、1.25‰（6% v/v））精油處理過，附著有C.violaceum生物膜的蓋玻片染色后放在光學(xué)顯微鏡下觀察。在10×物鏡下觀察，結(jié)果如圖7所示。與對(duì)照相比，精油處理過的生物膜含量降低，且生物膜含量與精油濃度呈反比；結(jié)構(gòu)松散，聚集性降低，且松散程度與精油濃度呈正比。說明迷迭香精油能降低C.violaceum生物膜含量，并破壞生物膜穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

圖7 光學(xué)顯微鏡觀測Sub-MIC下，迷迭香精油對(duì)C.violaceum生物膜定殖的影響Fig.7 Optical microscope observation of the effect of Rosmarinus officinalis EO on C.violaceum biofilm colonization under Sub-MIC condition

2.9 已形成生物膜降解檢測

為探究迷迭香精油降低紫色桿菌生物膜含量的原因，本文還檢測了迷迭香精油對(duì)已形成生物膜的影響。由圖8可以看出，迷迭香精油具有明顯的清除生物膜的作用，Sub-MIC（20‰、10‰、5‰、2.5‰（6% v/v））精油處理下，精油對(duì)C.violaceum生物膜的清除率為64.0%～50.3%，且清除能力與精油處理濃度成正比。以上結(jié)果表明迷迭香精油除可能抑制生物膜形成外，還能夠清除C.violaceum已形成生物膜。

圖8 Sub-MIC下，迷迭香精油對(duì)C.violaceum已形成生物膜含量的影響Fig.8 Effects of Rosmarinus officinalis EO on the content of C.violaceum biofilm under Sub-MIC condition

2.10 信號(hào)分子（AHLs）生物檢測

C.violaceumQS類型是CviI/CviR，由CviI（自誘導(dǎo)劑合成酶）和CviR（轉(zhuǎn)錄受體蛋白）組成。CviI合成信號(hào)分子C6-HSL，該物質(zhì)對(duì)于QS監(jiān)測群體密度、激活下游基因（包括一些毒力因子）表達(dá)必不可少。因此，有必要測定迷迭香精油對(duì)C6-HSL含 量 的 影 響。在Sub-MIC（10‰、2.5‰（6% v/v））精油處理下，各平板紫色桿菌素圈直徑大小反應(yīng)了AHLs含量。如圖9所示，與CK無精油處理相比，在精油處理后，平板中AHLs含量減少，AHLs含量與精油濃度呈反比。說明精油會(huì)降 低C.violaceumQS的AHLs含量。

圖9 利用紫色桿菌CV 026檢測Sub-MIC下，迷迭香EO對(duì)C.violaceum AHL含量的影響Fig.9 The effects of Rosmarinusofficinalis EO on the content of C.violaceum AHL under Sub-MIC condition was detected by C.violaceum CV 026

3 討論

本研究所使用迷迭香產(chǎn)自上海，GC-MS測得主成分為α-蒎烯和桉葉油醇，占比分別27.89%和18.98%，這與潘巖等［25］測得貴州產(chǎn)迷迭香成分組成相似。植物精油作為一種廣譜抑菌劑，具有高效低毒的特點(diǎn)，不同精油之間具有協(xié)同作用［26］。Prabuseenivasan等［27］研究了21種植物精油在不同濃度下對(duì)6種細(xì)菌的抗菌活性，其中1/6、1/11（v/v）的迷迭香精油對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到15.1 mm和9.1 mm，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。程偉賢等［28］測定了從迷迭香分離得到的迷迭香酚和鼠尾草酚的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種物質(zhì)對(duì)大腸桿菌抑菌活性明顯強(qiáng)于銅綠假單胞菌，這與本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)測定了迷迭香精油對(duì)6種細(xì)菌的抑制活性，均表現(xiàn)出明顯的抑制效果，表明迷迭香具有廣譜抑菌活性，與以上研究結(jié)果相似。

群體感應(yīng)是基于一定群體數(shù)量的作用機(jī)制，在細(xì)菌數(shù)量達(dá)到臨界值才會(huì)起作用。據(jù)吳紅等報(bào)道，在細(xì)菌濃度達(dá)到107CFU·mL-1以上，信號(hào)分子的濃度就會(huì)超過一個(gè)閾值水平（大約10 nmol·L-1），才會(huì)引起群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用［29］。本研究使用細(xì)菌經(jīng)活化后，細(xì)菌濃度均在109CFU·mL-1以上，符合研究要求。紫色桿菌素是C.violaceum重要的次生代謝產(chǎn)物，它的產(chǎn)生和分泌是由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的。有研究表明：在不影響細(xì)菌正常生長的情況下，能夠明顯降低C.violaceum紫色桿菌素含量的化合物可被視為潛在的群體感應(yīng)抑制劑［30，31］。試驗(yàn)測定結(jié)果顯示迷迭香精油能降低紫色桿菌素含量，這與王錦利等［11］對(duì)阿魏精油影響紫色桿菌群體感應(yīng)的研究結(jié)果相似。生物膜作為粘附在宿主表面的由多糖、蛋白質(zhì)和核酸包裹著的微生物群體，在細(xì)菌致病性和耐藥性形成方面扮演了重要的角色，生物膜一旦形成，在生物膜中微生物的抗性會(huì)增至10～1000倍，此時(shí)，微生物的耐藥性變大并難以清除［32］。試驗(yàn)測定了精油對(duì)C.violaceum生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)生物膜的含量和聚集形態(tài)都發(fā)生變化，這與王文婷等［13］對(duì)千層金精油抑制紫色桿菌群體感應(yīng)的研究結(jié)果相似。

細(xì)菌的群集運(yùn)動(dòng)有Swimming和Swamming，一般來說，基于鞭毛的群集運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為是形成成熟生物膜結(jié)構(gòu)的重要因子，同時(shí)還有助于增強(qiáng)細(xì)菌的QS行為［33］。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)迷迭香精油對(duì)C.violaceum和P.c.c.的群集運(yùn)動(dòng)都有顯著抑制效果，這與王文婷等［14］對(duì)香樟精油抑制紫色桿菌群體感應(yīng)的研究結(jié)果相似。QS依靠信號(hào)分子濃度來感知細(xì)菌濃度，并且通過信號(hào)分子結(jié)合受體蛋白，激活毒力因子的表達(dá)。試驗(yàn)測定迷迭香精油會(huì)降低C.violaceum產(chǎn)生的AHLs含量，說明迷迭香精油對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)存在QS淬滅能力，這與王文婷等［13］測定千層金精油能夠減少C.violaceum的AHLs含量結(jié)果相似，并且該研究通過GC-MS定量檢測發(fā)現(xiàn)，減少的AHLs為C6-HSL。

植物精油影響細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的方式有3種：（1）利用信號(hào)分子類似物，與信號(hào)分子競爭受體結(jié)合蛋白位點(diǎn)。使下游基因無法被激活［34］；（2）利用信號(hào)分子合成底物類似物或者抑制信號(hào)分子合成酶活性。使信號(hào)分子合成酶無法或者錯(cuò)誤的合成信號(hào)分子，從而抑制了群體感應(yīng)調(diào)控毒力因子；（3）降解信號(hào)分子。信號(hào)分子數(shù)量在閾值以下，就不會(huì)和轉(zhuǎn)錄受體蛋白結(jié)合，從而無法激活下游毒力因子表達(dá)［35］。本研究結(jié)果顯示，精油處理后AHL含量降低，據(jù)此推斷迷迭香精油抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制可能是抑制信號(hào)分子合成酶活性、充當(dāng)AHL的底物或者降解信號(hào)分子，又因?yàn)锳HL信號(hào)分子合成底物為酰基-?；d體蛋白（Acy1．ACP）和S-腺 苷 甲 硫 氨 酸（SAM）［35］，SAM屬于氨基酸類物質(zhì)，而本研究測定迷迭香精油成分幾乎沒有這類物質(zhì)，所以推測精油可能抑制了信號(hào)分子合成酶活性的活性，這需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，本文在測定迷迭香精油的成分組成及抑菌活性的基礎(chǔ)上，檢測了迷迭香精油對(duì)C.violaceumQS抑制活性，對(duì)QS參與調(diào)控的多種致病因子檢測，并對(duì)QS的AHLs含量做生物檢測，結(jié)果表明，在亞抑菌濃度下，迷迭香精油會(huì)對(duì)C.violaceum的群體感應(yīng)系統(tǒng)及其所參與調(diào)控的相關(guān)致病因子產(chǎn)生抑制作用，證明迷迭香精油具有QS抑制活性，可以作為一種以群體感應(yīng)為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥繼續(xù)深入研究。下一步試驗(yàn)會(huì)以迷迭香精油作為QS抑制劑，研究迷迭香精油對(duì)植物細(xì)菌性病害致病菌QS及相關(guān)毒力因子的抑制活性，并找出迷迭香精油中，起QS抑制作用的主效成分，為探究迷迭香精油抑制細(xì)菌QS的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。