RP-HPLC法同時測定苓桂術(shù)甘湯中的甘草苷和原兒茶酸含量

孟 園，王來兵，于姝燕，郭曉宇，王 敏，于 娟，李 冰，劉 濤，陳建平＊

（1.巴彥淖爾市醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院）

苓桂術(shù)甘湯來自《傷寒雜病論》中的“金匱要略方劑”部分。苓桂術(shù)甘湯由四味常見藥材，即茯苓、桂枝、甘草、白術(shù)組成。此湯劑為祛濕劑，主治因中陽不足所致的心胸滿悶、短氣而咳、起則頭眩、氣上沖胸等癥[1，2]，具有健脾利濕、溫陽化飲等功效。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)上，苓桂術(shù)甘湯常用于治療慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、梅尼埃綜合征、神經(jīng)官能癥、慢性腎小球腎炎水腫、心源性水腫、慢性心力衰竭等癥，還可聯(lián)合短期低熱量飲食來控制Ⅱ型糖尿病患者的血糖[8，9]。苓桂術(shù)甘湯療效顯著、毒副作用低，具有較高的臨床應(yīng)用價值[3～10]。

據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前對苓桂術(shù)甘湯的研究主要集中在臨床應(yīng)用以及藥理作用方面，對其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報道相對缺乏。為了充分研究苓桂術(shù)甘湯中的有效化學(xué)物質(zhì)，本研究首次建立高效快速的反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定該方劑中甘草苷和原兒茶酸含量的方法，為苓桂術(shù)甘湯的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等研究提供新的依據(jù)及參考。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

AB135-S電子分析天平（瑞士，MettlerToledo）；Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國，ThermoFisher）；KM-410C型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品

茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草飲片購自內(nèi)蒙古天立藥業(yè)，所有藥材經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求。

甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號：G-009-181216，純度＞98%，成都瑞芬思公司），原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110809-201205，99.9%，中國食品藥品檢定研究院），乙腈（色譜純，美國，Merck），甲醇（美國，F(xiàn)isher，色譜純），磷酸（85%水溶液，北京伊諾凱），超純水為實(shí)驗(yàn)室自制，其余所用試劑藥品均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μM）；在260 nm波長處檢測，柱溫25℃，流速1.0 mL·min-1，梯度洗脫（見表1），流動相為乙腈-0.1%磷酸水，進(jìn)樣量為10 μL。此條件下，原兒茶酸及甘草苷能與其他化學(xué)成分完全分離，且原兒茶酸理論塔板數(shù)＞100000，甘草苷理論塔板數(shù)＞200000。

表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的甘草苷和原兒茶酸對照品。分別為4.23 mg和2.72 mg，置于燒杯中，加入少量甲醇溶液溶解后置于100 mL容量瓶中定容，配制成含42.3 μg·mL-1的甘草苷和27.2 μg·mL-1的原兒茶酸的甲醇混合液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末2.75 g（粉碎并過60目篩的茯苓1 g、桂枝0.75 g、甘草0.5 g、白術(shù)0.5 g），放置于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，在功率40 kHz，頻率為200 W，超聲處理30 min，放至室溫，補(bǔ)足差重，搖勻，濕法抽濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇至定容。按照“2.1”項(xiàng)下的條件檢測，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)。峰面積為縱坐標(biāo)，測繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，得甘草苷的回歸方程為Y=145.0X+0.089（r=0.9992；n=6）、原兒茶酸的回歸方程為Y=632.7X+0.074（r=0.9993；n=6）。結(jié)果表明，原兒茶酸、甘草苷濃度分別在1.36～13.60 μg·mL-1與2.12～21.15 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[11]。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取同一批樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定得甘草苷和原兒茶酸含量的RSD分別為0.18%、0.15%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取一定量的藥品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)行測定，測得甘草苷、原兒茶酸含量的RSD分別為0.33%、0.77%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批次藥材，按照“2.3”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法，平行制備6份溶液，并按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件檢測，結(jié)果測得甘草苷和原兒茶酸的平均含量分別為618.6 μg·g-1和49.09 μg·g-1，RSD均為0.9%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。（見表2）。

表2 含量測定結(jié)果Tab.2 Content determination results

2.8 干擾性試驗(yàn)

分別量取空白溶劑適量、供試品試液適量、混合對照品試液適量于樣品瓶中，按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件檢測。供試品溶液色譜圖，在混合對照品試液的甘草苷和原兒茶酸相應(yīng)的位置上，有保留時間相同的色譜峰，且空白溶劑中沒有相應(yīng)保留時間的色譜峰，空白溶劑對甘草苷及原兒茶酸的測定無干擾，說明該方法專屬性良好（見圖1）。

圖1 干擾性試驗(yàn)Fig.1 Interference test

2.9 回收率試驗(yàn)考察

精密稱取同批次已知含量的供試品6份，分別加入80%、100%、120%的甘草苷和原兒茶酸對照品試液各2份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測，測得甘草苷和原兒茶酸的平均回收率分別為98.37%，RSD=0.9%和98.51%，RSD=1.1%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法加樣回收率良好[12]（見表3）。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of sample addition rocovery

3 討論

3.1 提取方法的選擇

樣品溶液制備的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別采用甲醇、無水乙醇、70%乙醇和水作為溶劑超聲處理提取樣品。測定顯示，以甲醇作為提取溶劑，被測定成分溶解度好，提取率高，得到的兩成分色譜峰峰形、高度均良好。

3.2 流動相的選擇

分別采用了乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明用乙腈-0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，甘草苷及原兒茶酸均有較好的峰型和分離度；而用甲醇-0.1%磷酸水，甘草苷峰無法分開，僅原兒茶酸峰型和分離度良好。

3.3 檢測波長的選擇

在200～400 nm范圍內(nèi)用紫外-可見分光光度計對甘草苷和原兒茶酸進(jìn)行掃描，結(jié)果表明甘草苷和原兒茶酸分別在278 nm和260 nm處有最大吸收。由于苓桂術(shù)甘湯中原兒茶酸的含量比甘草苷的含量低，若以278 nm作為檢測波長時，原兒茶酸的峰面積太小，難以測量，而甘草苷在260 nm處峰型穩(wěn)定，故選擇260 nm作為檢測波長同時對兩組成分進(jìn)行測定。

本試驗(yàn)成功建立了RP-HPLC法同時測定苓桂術(shù)甘湯中原兒茶酸和甘草苷的含量，通過方法學(xué)考察表明，所建立的方法簡單靈敏、快速高效、易于操作，為苓桂術(shù)甘湯的質(zhì)量控制研究提供理論參考。