NRF2啟動子區(qū)基因多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD相關(guān)性研究

李 黎

（喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆 喀什 844000）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）屬于臨床較為常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。據(jù)報道，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈逐年上升趨勢，預(yù)計到2030年將居于全球致死原因第3位[1]。而近年來我國新疆南疆地區(qū)COPD患病率也呈逐年增長趨勢，尤其作為維吾爾族人群聚居地的新疆喀什地區(qū)，COPD患病率普遍較高，且中老年人高發(fā)，與該地區(qū)特殊的地域特點及干燥寒冷的氣候環(huán)境有關(guān)[2]。而COPD發(fā)病機制復(fù)雜，不僅與環(huán)境因素有關(guān)，還與氧化-抗氧化失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、遺傳易感性等有關(guān)[3]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，NRF2）作為細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，參與肺臟大多數(shù)抗氧化蛋白和細(xì)胞保護基因表達(dá)調(diào)控過程，可預(yù)防炎癥所致氧化應(yīng)激損傷；一旦機體受到外界刺激而發(fā)生氧化損傷時，NRF2會與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件啟動子區(qū)，調(diào)控下游氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，在COPD氧化-抗氧化平衡中意義重大[4]。有研究表明，COPD病人肺組織NRF2表達(dá)明顯下調(diào)，而啟動子區(qū)調(diào)控NRF2表達(dá)及其穩(wěn)定性，故這些區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）變化可能會引起NRF2表達(dá)改變，并影響其對疾病的易感性[5]。但目前尚無報道分析NRF2啟動子區(qū)基因多態(tài)性與喀什地區(qū)維吾爾族COPD的相關(guān)性。為此，本研究通過探討NRF2基因rs6706649位點多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD的遺傳易感性，旨在揭示世居喀什的維吾爾族COPD病人疾病發(fā)生的相關(guān)分子生物學(xué)機制，為其基因診斷和治療提供新思路，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-09～2019-09喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸科門診、急診收治的世居喀什維吾爾族COPD病人200例納入研究對象，設(shè)為病例組；另外選取同期收治的體檢健康志愿者300例納入研究對象，設(shè)為對照組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2016年最新慢性阻塞性肺疾病全球倡議（Global initiative for chronic obstructive lung disease，GOLD）指 南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，吸入支氣管擴張劑后，第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比（forced expiratory volume in the first second is the percentage of forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）＜70%，經(jīng)詢問病史、胸部CT或X線胸片等檢查確診；（2）年齡＞18歲；（3）民族均為維吾爾族（世居喀什地區(qū)且無外族通婚史）。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有受試者均為喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院維吾爾族健康體檢者；（2）肺功能檢查FEV1/FVC＞80%；最大呼氣中期流速、50%用力呼氣流速、75%用力呼氣流速中任意兩項占預(yù)計值百分比＞65%；（3）X線胸片或胸部CT提示未發(fā)現(xiàn)肺氣腫、慢性支氣管炎等表現(xiàn)；（4）年齡＞18歲；（5）民族均為維吾爾族（世居喀什地區(qū)且無外族通婚史）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他肺疾病史，如肺纖維化、哮喘、支氣管擴張癥、肺結(jié)核等；（2）既往有一個或一個以上肺葉切除史，肺容量顯著降低；（3）急性心肌梗死；（4）合并進展期惡性腫瘤；（5）處于嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等嚴(yán)重應(yīng)急狀態(tài)；（6）疑似或確實存在藥物濫用及酒精依賴史；（7）妊娠、哺乳期婦女。本研究符合《赫爾辛基宣言》，且研究對象均對本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 統(tǒng)計兩組基礎(chǔ)資料信息，包括年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、居住地區(qū)、文化程度及有無吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史，觀察兩組NRF2基因rs6706649位點多態(tài)性，并分析世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的獨立危險因素。

1.2.2 NRF2基因rs6706649位點多態(tài)性檢測（1）主要儀器與試劑。主要儀器包括UNOⅡ48型聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（德國Biometra公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）；AM100電子分析天平（北京賽多利斯公司）；微型離心機（德國Effendorf公司）；其他儀器如超高速離心機、高壓滅菌器、-80℃冰箱等均購自日本Sanyo公司。主要試劑包括全血基因組DNA提取試劑盒（荷蘭Qiagen公司）；沙丁胺醇?xì)忪F劑（西班牙Glaxo Wellcome S.A公司）；其他試劑如無水乙醇、異丙醇等均由寶生物工程（大連）有限公司提供。（2）檢測方法。所有研究對象抽取2 mL空腹靜脈血，乙二胺四乙酸抗凝，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書快速提取DNA，保存于-80℃超低溫冰箱。使用Nanodrop 2000微量分光光度計行DNA濃度和純度測定，采用260 nm與280 nm處的吸光度比值（A260/A280）及260 nm與230 nm的吸光度比值（A260/A230）評價DNA純度，確保A260/A280值處在1.8～2.0范圍內(nèi)，A260/A230值大于2.0。使用Sequenom公司引物設(shè)計軟件MassARRAY Assay Design 3.0設(shè)計待測rs 6706649位點的PCR擴增引物與單堿基延伸引物，并在生物工程（上海）有限公司合成。PCR引物：上游5'-ATCTGT GGCGTGGTGGCTGCGCTTTGG-3'，下 游5'-AGCTC GTGTTCGCAGTCACCCTGAGCG-3'。利用多重PCR技術(shù)對該位點基因序列進行擴增。PCR反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃20 s，56℃30 s，72℃1 min，共計45個循環(huán)；72℃3 min；4℃保持。于PCR儀上放置PCR反應(yīng)板，啟動PCR反應(yīng)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后用SAP（Shrimp alkaline phosphatase，蝦堿性磷酸酶）處理PCR產(chǎn)物。堿性磷酸酶處理結(jié)束后行單堿基延伸反應(yīng)，完畢后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜基因分型技術(shù)，測定基因分型結(jié)果。NRF2基因rs6706649位點有3種基因型，即為CC、CT、TT基因型；存在2個等位基因，即等位基因C和等位基因T。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用率或百分比表示，采用χ2檢驗；單因素分析有意義的因素賦值后引入多因素Logistic分析，檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影響世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的單因素分析

兩組性別、BMI、居住地區(qū)、文化程度對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；病例組年齡≥60歲、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史、攜帶NRF2基因rs6706649位點CT和TT基因型及T等位基因占比顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

2.2 影響世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

將世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD作為因變量，將表1中有統(tǒng)計學(xué)意義的項目作為自變量，納入Logistic回歸分析模型，行量化賦值（見表2）。多因素Logistic回歸分析顯示，年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史及攜帶NRF2基因rs6706649位點CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）（見表3）。

3 討論

COPD是最為常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其患病率在不同地區(qū)存在很大差異，如湖北省COPD的患病率為8.92%，而重慶市渝中區(qū)COPD患病率為12.50%，推測可能與不同地區(qū)環(huán)境危險因素的暴露率差異有關(guān)[7，8]。目前COPD發(fā)病機制尚不明確，主要認(rèn)為與蛋白酶與抗蛋白酶失衡、炎癥反應(yīng)、氧化與抗氧化失衡、自身免疫、細(xì)胞凋亡等機制有關(guān)，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是COPD發(fā)病的關(guān)鍵促發(fā)因素，氧化應(yīng)激損傷不僅可直接誘發(fā)肺組織和氣道損傷，還可導(dǎo)致蛋白酶-抗蛋白酶失衡，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；而NRF2屬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在COPD的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。新疆維吾爾自治區(qū)處于我國西北邊陲，秋冬季寒冷、少雪、少雨，空氣較干燥，屬COPD高發(fā)區(qū)。雖然年齡、性別、民族等個體因素已被臨床研究證實與COPD的發(fā)病密切相關(guān)，但目前鮮有報道分析世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨立危險因素，關(guān)于性別、居住地區(qū)、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史等因素與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)病的相關(guān)性尚未完全明確，且關(guān)于NRF2啟動子區(qū)基因多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD的相關(guān)性鮮有報道[10]。因此，本研究對此展開初步探討。

本研究結(jié)果顯示，年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨立危險因素，與既往報道[11，12]相似。推測原因，隨著年齡的增長，機體各個器官功能逐漸衰退，會減少肺泡與肺彈力纖維彈性，致使胸廓順應(yīng)性降低、肺功能下降，故高齡本身會引發(fā)COPD。吸煙時產(chǎn)生的苯并芘、尼古丁等多種有害物質(zhì)，會反復(fù)刺激氣道及肺泡，引起支氣管黏膜下細(xì)胞肥大和增生，致使粘膜下腺體分泌亢進，同時會引起氣道上皮細(xì)胞損傷，促使纖毛運動減弱、氣道阻力加重。另外，香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧可形成較多的氧自由基，促使細(xì)胞分泌破壞能力較強的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，致使肺彈力纖維分解、肺泡壁破壞，最終形成肺氣腫，誘發(fā)COPD。而COPD屬一種受環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的多基因疾病，其發(fā)病具有家族聚集性，故COPD家族史也是COPD發(fā)生的獨立危險因素。此外，個人呼吸道疾病史也是增加COPD患病風(fēng)險的因素之一，既往有呼吸道疾病史可能會影響肺功能，加速COPD進程，推測與肺組織損傷、結(jié)構(gòu)改變和肺順應(yīng)性降低有關(guān)。同時，有害氣體或粉塵接觸史也是COPD的重要危險因素，有害氣體或職業(yè)性呼吸道粉塵的慢性暴露可誘發(fā)氣道阻塞，引起COPD。

本研究結(jié)果顯示，攜帶NRF2基因rs6706649位點CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨立危險因素，與Cui W等[13]報道相似。NRF2廣泛表達(dá)于腎臟、肺臟、肌肉等多個組織，對多種抗氧化物酶基因表達(dá)具有調(diào)控作用，參與COPD的發(fā)生及發(fā)展[14]。生理情況下NRF2會結(jié)合胞漿蛋白分子伴侶Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1而存在于細(xì)胞漿中，活性呈相對抑制狀態(tài)；一旦受外界刺激而出現(xiàn)氧化損傷時，其會與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與抗氧化反應(yīng)元件啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，維護機體免受氧化應(yīng)激損傷。Kubo H等[15]研究表明，NRF2基因敲除的小鼠吸煙所致肺氣腫較野生型小鼠更為嚴(yán)重，可更早進展為肺氣腫，出現(xiàn)更加嚴(yán)重的肺組織損害，提示NRF2參與了對抗機體氧化應(yīng)激的過程。Chi Y等[16]報道COPD病人支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NRF2 mRNA表達(dá)水平較正常人低，提示NRF2參與COPD的發(fā)病過程。NRF2參與的主要細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路有蛋白激酶、活化B細(xì)胞的核因子K-輕鏈增強子、磷酸肌醇-3-激酶、促分裂原活化蛋白激酶等細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，推測NRF2可能通過參與這些途徑誘導(dǎo)COPD的發(fā)生。而NRF2基因上存在諸多SNP位點。付聰麗等[17]報道NRF2單核苷酸多態(tài)性與COPD肺功能FEV1水平相關(guān)。張寶華等[18]認(rèn)為rs6706649可能是阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的SNP位點。筆者推測，攜帶NRF2基因rs6706649位點CT、TT基因型及T等位基因與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD顯著相關(guān)，但關(guān)于該位點是如何對COPD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生作用，目前仍尚未清楚，今后仍需進行相關(guān)位點的功能研究，培養(yǎng)基因敲除鼠，經(jīng)熏煙造模成COPD，行NRF2基因rs6706649位點蛋白基因?qū)用嫜芯?，以便進一步了解COPD發(fā)病機制，為COPD防治提供思路。

綜上所述，世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD的發(fā)生不僅與年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史有關(guān)，還與NRF2基因rs6706649位點多態(tài)性密切相關(guān)，臨床應(yīng)引起足夠重視。但本文由于選取病例數(shù)偏少，研究結(jié)果可能存在偏倚，故今后需作進一步深入研究。