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    NRF2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD相關(guān)性研究

    2021-11-29 00:22:53
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激因素

    李 黎

    (喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,新疆 喀什 844000)

    慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)屬于臨床較為常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。據(jù)報(bào)道,近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈逐年上升趨勢(shì),預(yù)計(jì)到2030年將居于全球致死原因第3位[1]。而近年來我國新疆南疆地區(qū)COPD患病率也呈逐年增長趨勢(shì),尤其作為維吾爾族人群聚居地的新疆喀什地區(qū),COPD患病率普遍較高,且中老年人高發(fā),與該地區(qū)特殊的地域特點(diǎn)及干燥寒冷的氣候環(huán)境有關(guān)[2]。而COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,不僅與環(huán)境因素有關(guān),還與氧化-抗氧化失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、遺傳易感性等有關(guān)[3]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,NRF2)作為細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子,參與肺臟大多數(shù)抗氧化蛋白和細(xì)胞保護(hù)基因表達(dá)調(diào)控過程,可預(yù)防炎癥所致氧化應(yīng)激損傷;一旦機(jī)體受到外界刺激而發(fā)生氧化損傷時(shí),NRF2會(huì)與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控下游氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá),在COPD氧化-抗氧化平衡中意義重大[4]。有研究表明,COPD病人肺組織NRF2表達(dá)明顯下調(diào),而啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控NRF2表達(dá)及其穩(wěn)定性,故這些區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)變化可能會(huì)引起NRF2表達(dá)改變,并影響其對(duì)疾病的易感性[5]。但目前尚無報(bào)道分析NRF2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與喀什地區(qū)維吾爾族COPD的相關(guān)性。為此,本研究通過探討NRF2基因rs6706649位點(diǎn)多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD的遺傳易感性,旨在揭示世居喀什的維吾爾族COPD病人疾病發(fā)生的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制,為其基因診斷和治療提供新思路,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2017-09~2019-09喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸科門診、急診收治的世居喀什維吾爾族COPD病人200例納入研究對(duì)象,設(shè)為病例組;另外選取同期收治的體檢健康志愿者300例納入研究對(duì)象,設(shè)為對(duì)照組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2016年最新慢性阻塞性肺疾病全球倡議(Global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)指 南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],吸入支氣管擴(kuò)張劑后,第1秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(forced expiratory volume in the first second is the percentage of forced vital capacity,F(xiàn)EV1/FVC)<70%,經(jīng)詢問病史、胸部CT或X線胸片等檢查確診;(2)年齡>18歲;(3)民族均為維吾爾族(世居喀什地區(qū)且無外族通婚史)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有受試者均為喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院維吾爾族健康體檢者;(2)肺功能檢查FEV1/FVC>80%;最大呼氣中期流速、50%用力呼氣流速、75%用力呼氣流速中任意兩項(xiàng)占預(yù)計(jì)值百分比>65%;(3)X線胸片或胸部CT提示未發(fā)現(xiàn)肺氣腫、慢性支氣管炎等表現(xiàn);(4)年齡>18歲;(5)民族均為維吾爾族(世居喀什地區(qū)且無外族通婚史)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他肺疾病史,如肺纖維化、哮喘、支氣管擴(kuò)張癥、肺結(jié)核等;(2)既往有一個(gè)或一個(gè)以上肺葉切除史,肺容量顯著降低;(3)急性心肌梗死;(4)合并進(jìn)展期惡性腫瘤;(5)處于嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷等嚴(yán)重應(yīng)急狀態(tài);(6)疑似或確實(shí)存在藥物濫用及酒精依賴史;(7)妊娠、哺乳期婦女。本研究符合《赫爾辛基宣言》,且研究對(duì)象均對(duì)本研究知情同意。

    1.2 方法

    1.2.1 研究方法 統(tǒng)計(jì)兩組基礎(chǔ)資料信息,包括年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、居住地區(qū)、文化程度及有無吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史,觀察兩組NRF2基因rs6706649位點(diǎn)多態(tài)性,并分析世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

    1.2.2 NRF2基因rs6706649位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)(1)主要儀器與試劑。主要儀器包括UNOⅡ48型聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀(德國Biometra公司);Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司);AM100電子分析天平(北京賽多利斯公司);微型離心機(jī)(德國Effendorf公司);其他儀器如超高速離心機(jī)、高壓滅菌器、-80℃冰箱等均購自日本Sanyo公司。主要試劑包括全血基因組DNA提取試劑盒(荷蘭Qiagen公司);沙丁胺醇?xì)忪F劑(西班牙Glaxo Wellcome S.A公司);其他試劑如無水乙醇、異丙醇等均由寶生物工程(大連)有限公司提供。(2)檢測(cè)方法。所有研究對(duì)象抽取2 mL空腹靜脈血,乙二胺四乙酸抗凝,按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書快速提取DNA,保存于-80℃超低溫冰箱。使用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)行DNA濃度和純度測(cè)定,采用260 nm與280 nm處的吸光度比值(A260/A280)及260 nm與230 nm的吸光度比值(A260/A230)評(píng)價(jià)DNA純度,確保A260/A280值處在1.8~2.0范圍內(nèi),A260/A230值大于2.0。使用Sequenom公司引物設(shè)計(jì)軟件MassARRAY Assay Design 3.0設(shè)計(jì)待測(cè)rs 6706649位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物與單堿基延伸引物,并在生物工程(上海)有限公司合成。PCR引物:上游5'-ATCTGT GGCGTGGTGGCTGCGCTTTGG-3',下 游5'-AGCTC GTGTTCGCAGTCACCCTGAGCG-3'。利用多重PCR技術(shù)對(duì)該位點(diǎn)基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:94℃4 min;94℃20 s,56℃30 s,72℃1 min,共計(jì)45個(gè)循環(huán);72℃3 min;4℃保持。于PCR儀上放置PCR反應(yīng)板,啟動(dòng)PCR反應(yīng)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后用SAP(Shrimp alkaline phosphatase,蝦堿性磷酸酶)處理PCR產(chǎn)物。堿性磷酸酶處理結(jié)束后行單堿基延伸反應(yīng),完畢后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜基因分型技術(shù),測(cè)定基因分型結(jié)果。NRF2基因rs6706649位點(diǎn)有3種基因型,即為CC、CT、TT基因型;存在2個(gè)等位基因,即等位基因C和等位基因T。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用率或百分比表示,采用χ2檢驗(yàn);單因素分析有意義的因素賦值后引入多因素Logistic分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 影響世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的單因素分析

    兩組性別、BMI、居住地區(qū)、文化程度對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組年齡≥60歲、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史、攜帶NRF2基因rs6706649位點(diǎn)CT和TT基因型及T等位基因占比顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

    2.2 影響世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

    將世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD作為因變量,將表1中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目作為自變量,納入Logistic回歸分析模型,行量化賦值(見表2)。多因素Logistic回歸分析顯示,年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史及攜帶NRF2基因rs6706649位點(diǎn)CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表3)。

    3 討論

    COPD是最為常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其患病率在不同地區(qū)存在很大差異,如湖北省COPD的患病率為8.92%,而重慶市渝中區(qū)COPD患病率為12.50%,推測(cè)可能與不同地區(qū)環(huán)境危險(xiǎn)因素的暴露率差異有關(guān)[7,8]。目前COPD發(fā)病機(jī)制尚不明確,主要認(rèn)為與蛋白酶與抗蛋白酶失衡、炎癥反應(yīng)、氧化與抗氧化失衡、自身免疫、細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān),其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是COPD發(fā)病的關(guān)鍵促發(fā)因素,氧化應(yīng)激損傷不僅可直接誘發(fā)肺組織和氣道損傷,還可導(dǎo)致蛋白酶-抗蛋白酶失衡,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生;而NRF2屬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子,在COPD的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。新疆維吾爾自治區(qū)處于我國西北邊陲,秋冬季寒冷、少雪、少雨,空氣較干燥,屬COPD高發(fā)區(qū)。雖然年齡、性別、民族等個(gè)體因素已被臨床研究證實(shí)與COPD的發(fā)病密切相關(guān),但目前鮮有報(bào)道分析世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,關(guān)于性別、居住地區(qū)、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史等因素與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)病的相關(guān)性尚未完全明確,且關(guān)于NRF2啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD的相關(guān)性鮮有報(bào)道[10]。因此,本研究對(duì)此展開初步探討。

    本研究結(jié)果顯示,年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與既往報(bào)道[11,12]相似。推測(cè)原因,隨著年齡的增長,機(jī)體各個(gè)器官功能逐漸衰退,會(huì)減少肺泡與肺彈力纖維彈性,致使胸廓順應(yīng)性降低、肺功能下降,故高齡本身會(huì)引發(fā)COPD。吸煙時(shí)產(chǎn)生的苯并芘、尼古丁等多種有害物質(zhì),會(huì)反復(fù)刺激氣道及肺泡,引起支氣管黏膜下細(xì)胞肥大和增生,致使粘膜下腺體分泌亢進(jìn),同時(shí)會(huì)引起氣道上皮細(xì)胞損傷,促使纖毛運(yùn)動(dòng)減弱、氣道阻力加重。另外,香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧可形成較多的氧自由基,促使細(xì)胞分泌破壞能力較強(qiáng)的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶,致使肺彈力纖維分解、肺泡壁破壞,最終形成肺氣腫,誘發(fā)COPD。而COPD屬一種受環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的多基因疾病,其發(fā)病具有家族聚集性,故COPD家族史也是COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外,個(gè)人呼吸道疾病史也是增加COPD患病風(fēng)險(xiǎn)的因素之一,既往有呼吸道疾病史可能會(huì)影響肺功能,加速COPD進(jìn)程,推測(cè)與肺組織損傷、結(jié)構(gòu)改變和肺順應(yīng)性降低有關(guān)。同時(shí),有害氣體或粉塵接觸史也是COPD的重要危險(xiǎn)因素,有害氣體或職業(yè)性呼吸道粉塵的慢性暴露可誘發(fā)氣道阻塞,引起COPD。

    本研究結(jié)果顯示,攜帶NRF2基因rs6706649位點(diǎn)CT、TT基因型及T等位基因是世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與Cui W等[13]報(bào)道相似。NRF2廣泛表達(dá)于腎臟、肺臟、肌肉等多個(gè)組織,對(duì)多種抗氧化物酶基因表達(dá)具有調(diào)控作用,參與COPD的發(fā)生及發(fā)展[14]。生理情況下NRF2會(huì)結(jié)合胞漿蛋白分子伴侶Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1而存在于細(xì)胞漿中,活性呈相對(duì)抑制狀態(tài);一旦受外界刺激而出現(xiàn)氧化損傷時(shí),其會(huì)與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),并與抗氧化反應(yīng)元件啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,調(diào)節(jié)下游抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá),維護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。Kubo H等[15]研究表明,NRF2基因敲除的小鼠吸煙所致肺氣腫較野生型小鼠更為嚴(yán)重,可更早進(jìn)展為肺氣腫,出現(xiàn)更加嚴(yán)重的肺組織損害,提示NRF2參與了對(duì)抗機(jī)體氧化應(yīng)激的過程。Chi Y等[16]報(bào)道COPD病人支氣管上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NRF2 mRNA表達(dá)水平較正常人低,提示NRF2參與COPD的發(fā)病過程。NRF2參與的主要細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路有蛋白激酶、活化B細(xì)胞的核因子K-輕鏈增強(qiáng)子、磷酸肌醇-3-激酶、促分裂原活化蛋白激酶等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,推測(cè)NRF2可能通過參與這些途徑誘導(dǎo)COPD的發(fā)生。而NRF2基因上存在諸多SNP位點(diǎn)。付聰麗等[17]報(bào)道NRF2單核苷酸多態(tài)性與COPD肺功能FEV1水平相關(guān)。張寶華等[18]認(rèn)為rs6706649可能是阿爾茨海默病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。筆者推測(cè),攜帶NRF2基因rs6706649位點(diǎn)CT、TT基因型及T等位基因與世居喀什地區(qū)維吾爾族COPD顯著相關(guān),但關(guān)于該位點(diǎn)是如何對(duì)COPD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生作用,目前仍尚未清楚,今后仍需進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)的功能研究,培養(yǎng)基因敲除鼠,經(jīng)熏煙造模成COPD,行NRF2基因rs6706649位點(diǎn)蛋白基因?qū)用嫜芯?,以便進(jìn)一步了解COPD發(fā)病機(jī)制,為COPD防治提供思路。

    綜上所述,世居喀什地區(qū)維吾爾族人群COPD的發(fā)生不僅與年齡、吸煙史、飲酒史、COPD家族史、個(gè)人呼吸道疾病史、有害氣體或粉塵接觸史有關(guān),還與NRF2基因rs6706649位點(diǎn)多態(tài)性密切相關(guān),臨床應(yīng)引起足夠重視。但本文由于選取病例數(shù)偏少,研究結(jié)果可能存在偏倚,故今后需作進(jìn)一步深入研究。

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