鉤藤堿固體脂質納米粒對小鼠氣道平滑肌細胞增殖及TGF-β1/Smad通路的影響

王盟 畢倩宇 李慧 呂傳峰

摘要 目的：觀察鉤藤堿固體脂質納米粒（Rhy-SLN）對小鼠氣道平滑肌細胞（ASMC）的增殖細胞核抗原（PCNA）表達以及TGF-β1/Smad信號通路的影響。方法：將小鼠ASMC體外分離培養(yǎng)，用Rhy-SLN干預ASMC，用免疫熒光法測定小鼠ASMC的PCNA的表達;Western Blotting法檢測小鼠ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達。結果：Rhy-SLN在一定程度上可以降低小鼠氣道平滑肌細胞中PCNA的表達1.80±0.12比1.50±0.15（P<0.05），顯著下調Smad2蛋白1.09±0.20、p-Smad2蛋白1.97±0.70、p-Smad3蛋白4.47±0.35、p-Smad4蛋白1.42±0.20相對表達（P<0.05），顯著上調Smad7蛋白0.65±0.15相對表達（P<0.05），效果與通路阻滯劑SB431542組相似。結論：Rhy-SLN可以抑制小鼠ASMC的增殖，其機制可能與調節(jié)TGF-β1誘導的Smad信號通路有關。

關鍵詞 鉤藤堿;固體脂質納米粒;哮喘;支氣管平滑肌細胞;增殖細胞核抗原;轉化生長因子-β1

Effects of Rhynchophylline Solid Lipid Nanoparticles on Proliferation and TGF-β1/Smad Pathway in Airway Smooth Muscle Cells of Mice

WANG Meng1，2， BI Qianyu2， LI Hui1， LYU Chuanfeng1

（1 Jining NO.1 People′s Hospital， Jining 272000， China; 2 College of Chinese Traditional Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

Abstract Objective：To observe the effect of Rhy-SLN on the expression of PCNA and TGF-β1/Smad signal pathway of ASMC in mice. Methods：Mouse ASMC were isolated and cultured in vitro， Rhy-SLN interfered with ASMC， and the expression of PCNA in mouse ASMC was determined by immunofluorescence method; the expression of Smad2， p-Smad2， Smad3， p-smad3， Smad4， Smad7 in ASMC was detected by Western blot. Results：To a certain extent， Rhy-SLN can reduce the expression of PCNA in airway smooth muscle cells of mice [（1.80±0.12） VS （1.50±0.15）] （P<0.05）， significantly down regulate the relative expression of Smad2 （1.09±0.20）， p-Smad2（1.97±0.70）， p-Smad3（4.47±0.35）， p-Smad4（1.42±0.20） protein （P<0.05）， significantly up regulate the relative expression of Smad7 （0.65±0.15） protein （P<0.05）， the effect was similar to that of SB431542. Conclusion：Rhy-SLN can inhibit the proliferation of ASMC in mice， and its mechanism may be related to the regulation of Smad signal pathway induced by TGF-β1.

Keywords Rhynchophylline; Solid lipid nanoparticles; Asthma; Airway smooth muscle cell; Proliferating cell nuclear antigen; TGF-β1

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.010

支氣管哮喘涉及多種細胞及其組分，以可逆性的氣流阻塞和氣道的高反應為特征的慢性炎癥疾病，其炎癥反應的不斷發(fā)展刺激氣道平滑肌細胞（Airway Smooth Muscle Cell，ASMC）的增殖及肥大[1]。因此如何抑制AMSC的增殖，進而抑制氣道重塑的過程，已經成為了治療哮喘疾病新的研究方向。

鉤藤堿為中藥鉤藤的重要有效成分之一，具有抗高血壓、抗心肌缺血、抗心肌重構等一系列藥理作用[2-6]。前期研究表明，鉤藤堿固體脂質納米粒（Rhynchophylline-loaded Solid Lipid Nanoparticles，Rhy-SLN）可以緩解小鼠的哮喘反應，降低支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥介質IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒細胞以及血清中IgE的水平，并且可以降低小鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[7]。為進一步明確Rhy-SLN緩解小鼠哮喘的分子作用機制，本實驗通過Rhy-SLN對小鼠氣道平滑肌細胞PCNA表達的影響以及對TGF-β1/Samd信號通路的影響，為鉤藤堿緩解支氣管哮喘提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c雌性小鼠24只，8周齡，體質量18～24 g，由濟寧醫(yī)學院動物中心提供，動物合格證號：20030011。倫理批號：2021倫審研第（032）號。動物飼養(yǎng)條件：動物飼養(yǎng)溫度20～23 ℃，相對濕度40%～70%，動物自由進食飲水，晝夜節(jié)律正常[8]。

1.1.2 藥物 鉤藤堿固體脂質納米粒（濟寧市第一人民醫(yī)院藥學部自制，批號：20161114）。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國，批號：12100-46）;TGF-β1（USCN公司，批號：RPA124Mu01）;PCNA（Proteintech公司，美國，批號：10205-2-AP）;鉤藤堿（阿拉丁公司，批號：R102720）;TGF-β1抗體（博斯特生物公司，批號：BA0290）;Smad2抗體（Cell Signaling公司，美國，批號：5339）、Smad3（Cell Signaling公司，美國，批號：9523）、細胞外蛋白調節(jié)激酶ERK（Cell Signaling公司，美國，批號：4695）;Smad4抗體（上海生工生物工程公司，批號：D120124）、Smad7（上海生工生物工程公司，批號：D160746）、p38（上海生工生物工程公司，批號：D151619）;SB431542（阿拉丁公司，批號：S125924）;倒置相差顯微鏡（麥克奧迪公司，型號：AE31）;CO2培養(yǎng)箱（上海力申，型號：HF-90）;凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國，型號：AV-1000）;酶標儀（BIOTEK公司，美國，型號：ELx800）;熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：IXplore SpinSR）。

1.2 方法

1.2.1 Rhy-SLN的制備 按照處方量精密稱取鉤藤堿、脂質、卵磷脂，采用納米乳法制備鉤藤堿固體脂質納米粒，4 ℃條件下密封保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 ASMC的培養(yǎng)及傳代 取5周齡的小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉處死，無菌條件下取出支氣管組織，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，將支氣管剪碎，加入0.1%膠原酶和0.1%胰蛋白酶的混合消化液，轉移至15 mL離心管中，放入37 ℃水浴鍋中進行水浴消化20 min。用含雙抗的DMEM沖洗100目濾網，過濾消化混合液至15 mL離心管中離心。離心后棄上清液，細胞用完全培養(yǎng)基重懸，接種至12孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞密度達到90%時，將培養(yǎng)板中培養(yǎng)基上清液棄去，PBS清洗2遍后棄去。加入一定體積的胰酶消化細胞，待細胞變圓加入一定量的完全培養(yǎng)基終止消化。

1.2.3 分組與給藥 收集4～6代小鼠ASMC，分為4個組，空白組，健康ASMC;TGF-β1組，加入5 ng/mL TGF-β1處理24 h;Rhy-SLN組，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L Rhy-SLN處理24 h;SB431542組，加入5 ng/mL TGF-β1及10 μmol/L SB431542作用24 h。TGF-β1組、Rhy-SLN組和SB431542組在加藥前，使用0.2% BSA/DMEM serum-free的培養(yǎng)基培養(yǎng)ASMC使細胞增殖停滯。

1.2.4 免疫熒光檢測ASMC中PCNA的表達 取ASMC，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，加4%多聚甲醛固定液固定15 min，清除4%多聚甲醛，PBS清洗3次，滴加0.1%tritonX-100至完全覆蓋細胞，室溫孵育30 min，PBS清洗3次，0.5%牛血清清蛋白封閉30 min。滴加一定量的山羊血清完全覆蓋細胞，室溫15 min。一抗用PBS按1∶50稀釋，滴加到完全覆蓋細胞，在4 ℃條件下過夜孵育。清除一抗，PBS清洗3次。滴加熒光二抗，稀釋比例為1∶200，滴加到完全覆蓋細胞，在室溫下孵育60 min。清除二抗，PBS清洗3次。滴加DAPI到完全覆蓋細胞復染細胞核。清除DAPI，PBS清洗3次。滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并進行拍照。

1.2.5 Western Blotting法檢測ASMC中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7水平 取對數(shù)生長期的小鼠ASMC以2.0×105/孔接種于6孔板中，加入適量RIPA裂解液勻漿至充分裂解，BCA法進行蛋白定量得出上樣量。取20 μg的蛋白加樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），隨后開始電轉，轉印后的PVDF膜加入5%的脫脂奶粉TBST封閉1 h。將膜置于1∶1 000稀釋的相應一抗中，4 ℃冰箱過夜。PBS洗滌后，將膜放入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗（1∶2 000）孵育1 h。加入ECL化學發(fā)光試劑，室溫條件下反應1～2 min，使用凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ASMC的鑒定 ASMC成長條形或者梭形，呈典型的峰谷狀生長。對平滑肌細胞特異的α-肌動蛋白免疫熒光染色陽性。見圖1～2。

2.2 Rhy-SLN對TGF-β1誘導的ASMC中PCNA表達的影響 與空白組比較，TGF-β1組、Rhy-SLN組、SB431542組細胞PCNA蛋白的表達有顯著上調（P<0.05），與TGF-β1細胞組比較，Rhy-SLN與SB431542組細胞PCNA蛋白的表達有顯著下調（P<0.05）。見表1和見圖3。

2.3 Western Blotting法檢測ASMC中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7的表達 與空白組比較，TGF-β1能顯著上調Samd信號通路中Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達，顯著下調Smad7蛋白相對表達（P<0.05）;與TGF-β1組比較，Rhy-SLN與SB431542組顯著下調Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達，顯著上調Smad7蛋白相對表達（P<0.05）。見表2～4和見圖4。

3 討論

鉤藤是我國傳統(tǒng)中草藥，鉤藤堿是鉤藤中含量最大的生物堿成分，具有降低血壓、抗血栓、抗血小板聚集等功效[10-11]。在前期的實驗中將鉤藤堿制成固體脂質納米粒，并進行了藥效和部分機制的動物體內實驗，發(fā)現(xiàn)鉤藤堿固體脂質納米粒在一定程度上可以緩解小鼠的哮喘反應，降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13、嗜酸性粒細胞含量以及血清中IgE的水平，還可以降低小鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4的蛋白水平[3]。

哮喘是一種以氣道慢性炎癥和支氣管平滑肌細胞異常增殖為病理特征的常見疾病[12-13]。增殖細胞核抗原（PCNA）主要表達于細胞的增殖期，與細胞的分裂增殖有著密切的關系，常作為評價細胞增殖狀態(tài)的標志物[14-16]。本研究結果顯示，鉤藤堿固體脂質納米粒在一定程度上可以降低小鼠氣道平滑肌細胞中PCNA蛋白的表達，說明鉤藤堿固體脂質納米?？梢砸种破交〖毎脑鲋场?/p>

轉化生長因子β（TGF-β）有3種亞型，其中TGF-β1在哮喘發(fā)生演變的過程中起著重要的作用。Smads蛋白家族是TGF-β1信號轉導通路中一個重要的基因家族，它受到激活后再將TGF-β1的信號從細胞表面的受體傳到細胞核的過程中起著重要作用。Smads蛋白家族有9種Smad蛋白，其中Smad2、Smad3為受體調節(jié)性蛋白，可以被磷酸化;Smad4為共同調節(jié)性蛋白，Smad7為抑制性蛋白，不可以被磷酸化[17-20]。為進一步探討鉤藤堿固體脂質納米粒緩解哮喘的作用機制，本研究利用鉤藤堿固體脂質納米粒作用于小鼠氣道平滑肌細胞，檢測TGF-β1誘導的Smads蛋白表達的變化情況。結果顯示，鉤藤堿固體脂質納米粒顯著下調Smad2、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4蛋白相對表達，顯著上調Smad7蛋白相對表達，效果與通路阻滯劑SB431542組相似，說明鉤藤堿固體脂質納米?？梢哉{控TGF-β1/Smad通路。

綜上所述，鉤藤堿固體脂質納米粒在一定程度上可以調控TGF-β1/Smad信號通路，進而抑制小鼠氣道平滑肌細胞的增殖，從而發(fā)揮緩解哮喘的作用，為進一步深入研究鉤藤堿固體脂質納米粒緩解哮喘的作用機制以及探尋哮喘治療新靶點提供了一定基礎。

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（2020-07-01收稿 責任編輯：楊覺雄）