Toll樣受體激動劑佐劑的研究進(jìn)展

年懸懸，李軍英綜述，張家友，楊曉明審校

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢430207；

2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430207；

3.中國生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司，北京100029

佐劑分為免疫刺激佐劑和遞送系統(tǒng)佐劑。免疫刺激佐劑來源于病原體，主要包括病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）［如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、單磷酰脂質(zhì)A（monophosphoryllipid A，MPLA）、胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）的細(xì)菌DNA（CpG DNA）］，通過細(xì)胞因子或模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而遞送系統(tǒng)主要將疫苗抗原靶向遞送給抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APC）。PRR的發(fā)現(xiàn)與樹突狀細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)意義一樣。1989年，耶魯大學(xué)教授Charles Janeway提出了天然免疫細(xì)胞PRR能特異性識別病原攜帶的非我組分PAMP，并預(yù)測PRR是先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁［1］。1996年，LEMAITRE等［2］發(fā)現(xiàn)Toll在果蠅對真菌感染的免疫中起著重要作用，從而確立了Toll的免疫學(xué)意義。1997，MEDZHITOV等［3］在果蠅胚胎背腹軸線發(fā)育的特殊分子中發(fā)現(xiàn)哺乳動物同源Toll蛋白，被命名為hToll，該蛋白能夠激活與適應(yīng)性免疫有關(guān)的基因。Toll受體的哺乳動物同源物相繼被鑒定為Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR），hToll被重命名為TLR4［4］。TLR家族現(xiàn)由10個成員組成（TLR1~TLR10）。TLR激動劑佐劑主要涉及TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9激動劑。

本文就TLR激動劑誘導(dǎo)的信號通路以及其作為疫苗佐劑的應(yīng)用作一綜述。

1 TLR結(jié)構(gòu)及信號通路

TLR是Ⅰ型跨膜蛋白，主要包括富含亮氨酸的胞外區(qū)、單個跨膜螺旋、含Toll／IL-1受體（Toll／IL-1 receptor，TIR）結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)：TLR胞外區(qū)的富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）是TLR與TLR配體識別結(jié)合的部分［5］。在三維結(jié)構(gòu)中，所有LRR呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)多個LRR組裝成蛋白時，形成螺線管結(jié)構(gòu)，呈馬蹄形，可形成同源或異源二聚體［6］。根據(jù)胞外區(qū)序列的同源性，脊椎動物TLR可分為6個亞家族：TLR1／2／6／10、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7／8／9、TLR11／12／13／21／22／23［7］?？缒^(qū)：TLR的跨膜結(jié)構(gòu)域包含1個典型的疏水殘基。胞內(nèi)區(qū)：TLR識別PAMP并通過其跨膜結(jié)構(gòu)域與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UNC93B相互作用，將PAMP從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上運(yùn)輸至溶酶體中［8］。TLR的胞質(zhì)部分與白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）受體家族高度相似，現(xiàn)被稱為TIR結(jié)構(gòu)域［9］。TLR信號通路的激活始于細(xì)胞質(zhì)TIR結(jié)構(gòu)域。在與適當(dāng)?shù)呐潴w結(jié)合后，TLR招募包含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，在TIR結(jié)構(gòu)域下游的信號通路中，銜接蛋白-髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）起著關(guān)鍵作用。

TLR信號通路包括MyD88依賴途徑及TLR3／4的MyD88非依賴途徑［10］。MyD88依賴途徑：MyD88蛋白在MyD88依賴途徑中起著重要作用，MyD88在C-末端有TIR結(jié)構(gòu)域，在N-末端有死亡結(jié)構(gòu)域。在一些PAMP刺激下，MyD88通過死亡結(jié)構(gòu)域的相互作用，招募IL-1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptorassociated kinase，IRAK）。IRAK通過磷酸化激活后，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）結(jié)合，激活兩種不同的信號通路，最終激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）或IL-6。MyD88非依賴途徑：TLR3／4激動劑通過銜接分子β干擾素（interferon，IFN）TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β，TRIF）誘導(dǎo)IRF-3的激活，從而誘導(dǎo)Ⅰ型IFN、炎癥因子／趨化因子的產(chǎn)生和DC的成熟［11-12］。見圖1［13］。

圖1 MyD88依賴和非依賴信號通路Fig.1 MyD88-dependent and-independent signal pathways

2 TLR激動劑佐劑

亞單位疫苗的免疫原性明顯低于減毒活疫苗，需要佐劑增加其免疫原性［14］。而TLR通常激活先天免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)適應(yīng)性免疫，具有成為疫苗佐劑的潛力。單磷酰脂質(zhì)A（monophosphoryllipid A，MPLA），通過降低細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的毒性獲得，是TLR4激動劑，也是第一個獲批用于疫苗佐劑的TLR激動劑［15］。2009年，由MPLA和鋁鹽組成的AS04佐劑，作為Cervarix疫苗的配伍佐劑獲批使用［16］。2017年，TLR9激動劑CpG ODN1018作為heplisavb疫苗的配伍佐劑獲批使用［17］。這兩個TLR激動劑作為佐劑用于上市疫苗導(dǎo)致了一系列有關(guān)TLR激動劑的研究。

2.1 TLR3激動劑TLR3主要在多種細(xì)胞和組織細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)，如神經(jīng)外胚層、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、APC等［18］。TLR3可識別病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物ds-RNA、合成的dsRNA分子聚肌苷-多胞苷酸（polyinosic-polycytidylic acid，Poly-IC）和相應(yīng)的優(yōu)化產(chǎn)物如Poly-IC12U、Poly-ICLC。Poly-IC通過TLR3和RIG-I-like受體（RIG-I-like receptors，RLR）信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)強(qiáng)IFN應(yīng)答。PolyI：C信號傳導(dǎo)主要依賴于TLR3和黑色素瘤分化相關(guān)基因-5（melanoma differentiation-associated gene-5，MDA-5），并強(qiáng)烈驅(qū)動細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和有效的Ⅰ型IFN反應(yīng)。Poly-IC12U是Poly-IC的優(yōu)化產(chǎn)物，其尿嘧啶和鳥苷殘基不匹配，似乎僅通過TLR3發(fā)出信號，而不誘導(dǎo)MDA-5信號通路［19］。體外研究證明，Poly-IC12U具有通過上調(diào)MHCⅠ／Ⅱ類分子、CD40、CD83、CCR7和CD86激活DC［20］。Poly-ICLC含有聚-L-賴氨酸羧甲基纖維素，可增加對核酸酶的抗性，從而增強(qiáng)和延長穩(wěn)定性［21］。在小鼠模型中，Poly-ICLC增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，對免疫缺陷病毒具有治療作用［22］。在卵巢癌疫苗的研究中，Poly-ICLC增強(qiáng)了疫苗誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答［23］。

2.2 TLR4激動劑LPS作為一種早期發(fā)現(xiàn)的TLR4激動劑，因其本身制熱特性，限制了其作為佐劑的使用［24］。LPS和MPLA均可激活TLR4，LPS可激活TRIF和MyD88信號通路發(fā)揮作用，而MPLA僅激活TRIF信號通路，觸發(fā)NF-κB，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α和IL-6［25］。MPLA通過誘導(dǎo)NFκB、細(xì)胞因子產(chǎn)生和抗原特異性T細(xì)胞活化直接激活A(yù)PC［26-27］。MPLA和皂苷形成AS01佐劑，是帶狀皰疹疫苗Shingrix的佐劑組分［28］。MPLA吸附在鋁鹽上，形成AS04佐劑，是人乳頭瘤病毒疫苗Cervarix和乙型肝炎疫苗Fendrix的佐劑組分［16，29］，MPLA也可作為狂犬病疫苗和癌癥疫苗的佐劑，并表現(xiàn)出較好的佐劑效果［30-31］。

葡萄糖吡喃糖脂類佐劑穩(wěn)定乳劑（glucopyranosyl lipid A in A stable emulsion，GLA-SE）是TLR4激動劑。GLA-SE具有增強(qiáng)Th1細(xì)胞免疫，保護(hù)老年人群對抗流感病毒的感染［32］，還可激活髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloid dendritic cells，mDCs）產(chǎn)生高水平的Th1細(xì)胞因子。GLA-SE具有劑量節(jié)約效應(yīng)，在大流行情況下尤其有益。GLA-SE作為融合蛋白ID93結(jié)核疫苗的佐劑，誘導(dǎo)了疫苗特異性體液和細(xì)胞反應(yīng)［33］；作為瘧疾疫苗佐劑，促進(jìn)了循環(huán)Tfh細(xì)胞中濾泡外抗體的增加及長期抗體的產(chǎn)生［34］。

2.3 TLR5激動劑TLR5存在于各種細(xì)胞上，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、DCs、上皮細(xì)胞［35］。革蘭陰性菌的鞭毛蛋白可通過TLR5和NAIP5／6激活先天免疫系統(tǒng)，鞭毛蛋白直接刺激上皮誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的募集和抗菌分子的產(chǎn)生，并且靶向刺激樹突細(xì)胞，激活天然免疫并促進(jìn)T和B細(xì)胞反應(yīng)［36-37］。鞭毛蛋白可通過MyD88依賴或非依賴途徑激活TLR5。MyD88依賴途徑會招募下游銜接蛋白，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和IkB激酶通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和NF-κB分別誘導(dǎo)，從而激活各種對宿主防御非常重要的基因［35，38］。MyD88非依賴途徑通過TRIF介導(dǎo)信號通路激活細(xì)胞。TRIF激活通過IRF3轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子IFN-β，IFN-β導(dǎo)致STAT1轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，iNOS）基因轉(zhuǎn)錄和一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生［39］。TLR5在一些天然免疫和適應(yīng)性的免疫細(xì)胞上的存在構(gòu)成其佐劑活性的基礎(chǔ)［40］。

鞭毛蛋白可與流感、HPV和手足口病等疫苗配伍，通過肌肉注射增強(qiáng)疫苗的免疫效果［41］。鞭毛蛋白可作為一種有效的黏膜佐劑，活化呼吸道上皮細(xì)胞分泌特定的抗菌分子和趨化因子，招募吞噬細(xì)胞誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答［42-43］。Entolimod是一種重組蛋白，一種藥理學(xué)上優(yōu)化的鞭毛蛋白衍生物，主要用于抗腫瘤治療［44］，也可用于急性輻射綜合征、精神疾病等臨床疾病的治療［45-46］。

2.4 TLR7／8激動劑TLR7、TLR8、TLR9表達(dá)于核內(nèi)體表面。人類TLR7和TLR8系統(tǒng)發(fā)育相似［47］。TLR7和TLR8可被富含嘌呤的ssRNA激活，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。TLR7主要在人漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cell，pDCs）中表達(dá)，并一定程度上在T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核／巨噬細(xì)胞中表達(dá)。TLR8在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、mDC中表達(dá)［47-48］。小分子TLR-7／8激動劑迅速進(jìn)入血液，激活免疫系統(tǒng)［49］。TLR7／8均通過MyD88發(fā)出信號，包括IL-1受體相關(guān)激酶-4（interleukin 1 receptor-associated kinase-4，IRAK-4）的募集，分別通過NF-kB和IRF7介導(dǎo)IFN的產(chǎn)生，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［50］。

一些TLR7／8激動劑佐劑正處于臨床前研究階段，見表1。Resiquimod作為一種常用的TLR7／8雙特異性激動劑，是一種典型的咪唑喹啉分子。Resiquimod主要誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫［51］。Resiquimod作為HIV疫苗佐劑，促進(jìn)了抗原特異性T細(xì)胞和抗體反應(yīng)；作為NY-ESO-1疫苗佐劑，用于治療高風(fēng)險黑色素瘤，臨床試驗(yàn)中顯示出較好的耐受性、CD4+T和抗體反應(yīng)［52］；在新型冠狀病毒疫苗的研究中，也顯示出了比較積極的佐劑效應(yīng)［53］。Resiquimod在人體試驗(yàn)中耐受性較差，常見的全身副反應(yīng)包括注射部位的反應(yīng)性和流感樣癥狀（發(fā)燒、頭痛和不適），這些癥狀均與全身免疫激活有關(guān)，如血液中高濃度的細(xì)胞因子［54］。3M-052作為TLR7／8雙特異性激動劑，可用于流感疫苗佐劑［55］。T7-EA作為新型TLR7激動劑，在小鼠試驗(yàn)中，顯示其可誘導(dǎo)HBsAg特異性IgG2a和T細(xì)胞反應(yīng)，并且打破了免疫耐受［56］。Imiquimod用于流感疫苗，在小鼠模型上，誘導(dǎo)了高滴度的IgG和IgM抗體［57］。Imiquimod通過誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子的表達(dá)和產(chǎn)生來改變免疫反應(yīng)，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步刺激T細(xì)胞，因此也可考慮作為新型冠狀病毒肺炎的治療藥物［58］。

表1 TLR7／8受體激動劑的組成及佐劑作用Tab.1 Composition and adjuvant effect of TLR7／8 agonists

2.5 TLR9激動劑TLR識別單鏈磷酸鹽修飾的CpG DNA或自然存在的磷化DNA［64］。非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸-脫氧寡核苷酸（cytidinephosphate-guanosine oligodeoxynucleotide，CpG ODN）模擬細(xì)菌DNA對TLR9的免疫刺激效應(yīng)，招募MyD88、IRAK和TRAF6。這導(dǎo)致MAPK和轉(zhuǎn)錄因子的激活，如NF-κB和AP-1，導(dǎo)致促炎趨化因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及分泌［65］。CpG ODN根據(jù)其結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)機(jī)制，可分為3類：k型CpG ODN（也稱為b型）、d型CpG ODN（也稱為a型）和c型CpG ODN［66］。所有的CpG ODN亞類均通過激活漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）和誘導(dǎo)細(xì)胞因子如TNF-α和IFNα來觸發(fā)免疫反應(yīng)。此外，CpG ODN可增強(qiáng)抗體反應(yīng)，但不同類型CpG ODN結(jié)構(gòu)差異誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有一定差異。

3′PD Poly-G延伸與CpG ODN形成，促進(jìn)了細(xì)胞的攝取并抑制了CpG ODN對核酸酶的敏感性［64］。CpG 1018作為乙肝疫苗Heplisav-B的佐劑，能更快地誘導(dǎo)保護(hù)性抗體滴度［67］。在一項(xiàng)隨機(jī)雙盲對照試驗(yàn)中，CPG 7909作為乙肝疫苗Engerix-B的佐劑，增強(qiáng)了細(xì)胞免疫，并具有較好的耐受性［68］。CpG 5805配伍乙肝疫苗，在小鼠模型上，增強(qiáng)了對疫苗的抗體反應(yīng)，誘導(dǎo)了B細(xì)胞表面TLR9向胞內(nèi)內(nèi)化，從而通過緩解表面TLR9對B細(xì)胞的負(fù)面調(diào)控效以激發(fā)B細(xì)胞活力，促進(jìn)CD80、CD86、CD40和MHCⅡ分子在B細(xì)胞表面表達(dá)，這可能是CpG ODN作為疫苗輔助劑增強(qiáng)抗體反應(yīng)的機(jī)制之一［69］。SD-101是一種合成的CpG ODN，通過TLR9參與刺激pDCs，主要用于腫瘤的治療［70］。ND-MPLA／CpG既是TLR4激動劑也是TLR9激動劑，促進(jìn)了APC的激活、抗體反應(yīng)和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，在抗腫瘤方面，也具有較好的潛力［71］。研究發(fā)現(xiàn)，在SARS-CoV或MERS-CoV亞單位疫苗中，與單用明礬或明礬與其他TLR激動劑聯(lián)合使用相比，CpG與鋁佐劑聯(lián)合使用可引起更高的中和抗體效價和更強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)［72］。CpG與鋁佐劑聯(lián)合配伍的新型冠狀病毒亞單位疫苗，主要誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答，并對疫苗突變株具有廣譜保護(hù)效果［73-74］，免疫倉鼠后的攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，倉鼠肺內(nèi)的病毒載量在檢測限以下［75］。

3 展望

新型佐劑的使用可能引發(fā)疫苗學(xué)的一場新革命［76］。TLR4和TLR9激動劑最先被發(fā)現(xiàn)，作為疫苗佐劑，研究也更為深入。含有TLR4激動劑的佐劑已被批準(zhǔn)作為幾種疫苗組分。TLR4激動劑已被用作傳染病疫苗佐劑、抗過敏治療藥物和癌癥免疫治療藥物。TLR9激動劑被用于乙肝疫苗heplisavb中。TLR9激動劑也被研究作為疫苗成分對抗感染性疾病和抗癌免疫調(diào)節(jié)。這些佐劑在免疫功能低下的個體中表現(xiàn)出劑量節(jié)約和誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的能力。TLR3激動劑作為抗癌、艾滋病和肌痛性腦脊髓炎／慢性疲勞綜合征（chronic fatigue ayndrome／myalgic encephalomyelitis，ME／CFS）的免疫治療藥物有一定的療效，但尚未被批準(zhǔn)用于疫苗［77-79］。TLR5激動劑已用于抗腫瘤免疫治療［80］。小分子TLR7／8激動劑已顯示出作為疫苗佐劑的巨大潛力［53］。TLR佐劑可誘導(dǎo)長期的免疫應(yīng)答。當(dāng)前新型冠狀病毒的變異和帶來的新型冠狀病毒大流行表明始終需要有效的疫苗佐劑以增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)或促進(jìn)疫苗產(chǎn)生廣譜性保護(hù)性抗體。新型佐劑對新發(fā)傳染病疫苗、既往傳染病疫苗以及癌癥疫苗的研制，均具有重大意義。