疫苗中鋁含量紫外分光光度測定法的建立及驗證

王平，張學(xué)峰，陳美麗，馮帆，邵帥，劉梅影

1.國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京101111；

2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京100176

鋁佐劑是目前使用最廣泛的人用疫苗佐劑，主要包括氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑和二者混合系統(tǒng)及與其他佐劑成分組成的佐劑系統(tǒng)（如AS04），多數(shù)預(yù)防性疫苗采用氫氧化鋁作為佐劑［1］，鋁佐劑的含量對預(yù)防性疫苗的安全性和免疫原性具有重要影響，存在誘導(dǎo)過敏反應(yīng)及神經(jīng)毒性的可能，因此在不影響免疫原性的前提下，應(yīng)采用能夠達(dá)到預(yù)期人體有效性的最小劑量，盡可能降低疫苗中鋁佐劑的含量，從而降低發(fā)生臨床不良反應(yīng)的風(fēng)險［2-4］。

WHO和歐盟規(guī)定，鋁佐劑的安全性限度標(biāo)準(zhǔn)為不超過1.25 mg／劑［1］，《美國藥典》為不超過0.85mg／劑［1］，最低0.125 mg／劑［4］，《中國藥典》三部（2020版）各論規(guī)定為0.17~0.52 mg／劑［5］。目前，疫苗中鋁含量檢測方法為《中國藥典》三部（2020版）推薦的乙二胺四乙酸鈉絡(luò)合滴定法［5-7］。該方法根據(jù)指示劑顏色變化通過目測確定滴定終點，易受人為因素影響，所需樣品量大（一般需要合并5~10劑疫苗），無法檢測單支疫苗的鋁含量。因此，本實驗采用高溫干烤加酸的方法處理樣品，將疫苗中的氫氧化鋁膠體顆粒轉(zhuǎn)化為可溶性Al3+，與Tiron試劑在酸性條件下形成有紫外光發(fā)色團(tuán)的衍生物［8-11］，用紫外分光光度計檢測A310，并對該方法進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 疫苗 吸附百白破聯(lián)合疫苗、吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）及實驗用流感病毒裂解疫苗（不含佐劑）由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；實驗用乙型肝炎疫苗由國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司第三研究室提供。

1.2 主要試劑及儀器 硫柳汞由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司提供；氫氧化鋁佐劑由國藥中生研究院第三研究室提供；氯化鋁溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BW00764-1）及氫氧化鋁溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BW21554）購自北京盛世康普化工技術(shù)研究院；衍生試劑Tiron（4，5-二羥基-1，3苯二磺酸一水合磷酸氫二鈉，172553-100G）及乙酸銨（17836-250G）購自美國Fluka公司；磷酸鋁佐劑（Cas7784-30-7）購自德國Brenntag公司；紫外分光光度計（UV-2550）購自日本島津公司。

1.3 衍生物檢測波長的確定 將Tiron溶液（用乙酸銨緩沖液溶解為9.8 mg／L）、氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液（用乙酸銨緩沖液將氯化鋁溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至以Al3+計10 μg／mL）、Tiron溶液與氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后（按1∶1體積比例混合，反應(yīng)5 min）的衍生物溶液，采用紫外分光光度計分別于波長200~700 nm范圍進(jìn)行測定，以乙酸銨緩沖液作為空白對照，進(jìn)行擬合，以確定衍生物的最適光譜吸收波長。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液（以Al3+計10 μg／mL）0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補(bǔ)加乙酸銨緩沖液至1.0 mL，加入乙酸銨緩沖液2 mL及Tiron試劑1 mL，放置5 min，紫外分光光度計檢測A310。以A310為縱坐標(biāo)，氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，獲得回歸方程。

1.5 樣品前處理方法的確定

1.5.1 干烤溫度 精確量取氫氧化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液（用乙酸銨緩沖液將氫氧化鋁溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至以Al3+計70 μg／mL）0.1 mL，加入1.5 mL樣品瓶中，分別于120、140、160、180、200、220℃干烤60 min；加入1 mol／L鹽酸100 μL，乙酸銨緩沖液補(bǔ)至1.0 mL；后續(xù)步驟同1.4項。

1.5.2 鹽酸加入量 精確量取氫氧化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液（以Al3+計50 μg／mL）0.1 mL，加入1.5 mL樣品瓶中，200℃干烤60 min；分別加入10、20、50、100、200、300、400和500 μL 1 mol／L鹽酸，補(bǔ)乙酸銨緩沖液至1.0 mL；后續(xù)步驟同1.4項。

1.6 方法的驗證

1.6.1 準(zhǔn)確性 用乙酸銨緩沖液將氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為2.5 μg／0.5 mL的氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分別加入80%、100%、120%的氯化鋁溶液（分別為2、2.5、3.0 μg／0.5 mL），每個濃度平行制備4份樣品。按1.4項方法檢測鋁含量，并計算回收率。

1.6.2 精密性

1.6.2.1 重復(fù)性 將氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至低（以Al3+計2 μg／mL）、中（以Al計5 μg／mL）、高（以Al3+計8 μg／mL）3個濃度，每個濃度平行制備8份樣品，按1.4項方法進(jìn)行檢測，計算SD和CV。

1.6.2.2 中間精密性 將氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至低（以Al3+計，2 μg／mL）、中（以Al計，5 μg／mL）、高（以Al3+計，8 μg／mL）3個濃度，每個濃度平行制備12份樣品，分別由3名實驗員（A、B、C）按1.4項方法進(jìn)行檢測，每名實驗員檢測高、中、低濃度各4份樣品，并計算SD和CV。

1.6.3 專屬性

1.6.3.1 紫外分光光度法測定 將實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）及實驗用流感病毒裂解疫苗（不含佐劑）樣品按1.5項確定的樣品處理方法進(jìn)行處理，按1.4項方法檢測鋁含量。

1.6.3.2 光譜測定 將實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）及實驗用流感病毒裂解疫苗（不含佐劑）樣品按1.5項確定的樣品處理方法處理后，在波長200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜測定，同時測定硫柳汞溶液及磷酸緩沖鹽溶液，進(jìn)行擬合，確定以上樣品在波長310 nm處的吸收情況。

1.7 方法的應(yīng)用 取氫氧化鋁佐劑、磷酸鋁佐劑、吸附百白破聯(lián)合疫苗、吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、實驗用重組乙型肝炎疫苗及實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）樣品，按1.5項確定的樣品處理方法進(jìn)行處理后，按1.4項方法檢測鋁含量，并與《中國藥典》三部（2020版）［5］通則3106氫氧化鋁（或磷酸鋁）測定法檢測結(jié)果或商品化產(chǎn)品說明書標(biāo)示值進(jìn)行比較，其中實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）重復(fù)檢測9支。

2 結(jié)果

2.1 最適衍生物檢測波長 氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液在光度測定范圍內(nèi)無明顯吸收，Tiron溶液和Tiron溶液與氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)后的衍生物溶液在波長310 nm處吸收峰有明顯吸收差異，且Tiron溶液吸收光值較小。見圖1。因此確定最適衍生物檢測波長為310 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 鋁含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液鋁含量在1～10 μg／mL范圍內(nèi)，與A310值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=0.009 41X+0.009 97，R=0.998 29。

圖2 鋁含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for determination of aluminium content

2.3 最適樣品處理方法

2.3.1 干烤溫度 干烤溫度為120、140、160、180、200、220℃時，氯含量分別為6.17、5.92、6.11、6.16、6.34、6.35 μg／mL。干烤溫度在120～220℃之間，鋁含量的檢測值差異較小，且200℃時信號最強(qiáng)，反應(yīng)最完全。因此確定最適干烤溫度為200℃。

2.3.2 鹽酸加入量 加入10、20、50、100、200、300、400和500 μL 1 mol／L鹽酸時，鋁含量分別為4.76、5.12、5.07、4.86、4.33、2.61、3.65、2.77 μg／mL。加入量在20～100 μL范圍內(nèi)，鋁含量的檢測值差異較小；高于200 μL時改變了溶液pH，使檢測結(jié)果降低。在確保樣中氫氧化鋁充分反應(yīng)的前提下，為盡量不改變?nèi)芤簆H，鹽酸加入量應(yīng)盡量少，因此確定1 mol／L鹽酸最適加入量為50 μl。

圖1 最適衍生物檢測波長的確定Fig.1 Optimization of detection wavelength of derivatives

2.4 方法的驗證

2.4.1 準(zhǔn)確性 加入80%、100%、120%的氯化鋁溶液樣品的回收率為100.36%～108.40%，均在80%～115%之間，見表1。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 準(zhǔn)確性的驗證結(jié)果（n=12）Tab.1 Verification for accuracy（n=12）

2.4.2 精密性

2.4.2.1 重復(fù)性 低、中、高濃度的氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液8份樣品重復(fù)測定結(jié)果的CV分別為2.10%、3.08%和1.12%，均＜6%，見表2。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果Tab.2 Verification for reproducibility

2.4.4.2 中間精密性3名實驗人員A、B、C檢測低、中、高濃度氯化鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果的CV分別為3.46%、2.28%和1.55%，均＜6%，見表3。表明該方法具有良好的中間精密性。

表3 中間精密性驗證結(jié)果Tab.3 Verification for intermediate precision

2.4.3 專屬性

2.4.3.1 紫外分光光度法測定 實驗用流感病毒裂解疫苗（不含佐劑）及實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）鋁含量分別為2.30和111.18 μg／mL，差異較大，表明該方法具有良好的專屬性。

2.4.3.2 光譜測定 實驗用流感病毒裂解疫苗（不含佐劑）樣品、硫柳汞溶液和磷酸緩沖鹽溶液于310 nm波長處無明顯吸收峰，實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）樣品有明顯吸收峰，見圖3。表明該方法專屬性良好。

圖3 專屬性的光譜測定Fig.3 Spectrometric determination in specificity test

2.5 方法的應(yīng)用 用紫外分光光度法測定氫氧化鋁佐劑、吸附百白破聯(lián)合疫苗、吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、實驗用乙型肝炎疫苗中鋁含量結(jié)果分別為1.01、1.34、1.28、1.00 mg／mL，藥典測定方法結(jié)果分別為1.08、1.40、1.30、1.06 mg／mL，兩者差異較?。涣姿徜X佐劑鋁含量用紫外分光光度法測定結(jié)果為4.92 mg／mL，符合商品化的磷酸鋁佐劑鋁含量說明書標(biāo)示值（4.5～5.5 mg／mL）。9支實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）測定結(jié)果分別為0.11、0.11、0.11、0.09、0.10、0.09、0.09、0.10、0.09 mg／mL，均值為0.10 mg／mL，與藥典測定方法結(jié)果一致。

3 討論

鋁佐劑在增強(qiáng)抗原遞呈、提高機(jī)體固有免疫應(yīng)答和激活B細(xì)胞誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要作用，國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）發(fā)布的《預(yù)防用含鋁佐劑疫苗技術(shù)指導(dǎo)原則》中明確指出，必須對疫苗添加佐劑的必要性進(jìn)行嚴(yán)格論證，并應(yīng)保證添加的佐劑不會引起不可接受的毒性，且使用佐劑所帶來的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的潛在利益必須超過其所帶來的風(fēng)險［1］。目前，中國已上市含鋁佐劑疫苗共有17種，包括百白破系列疫苗、甲／乙／戊肝疫苗、大流行流感疫苗及森林腦炎滅活疫苗、腎綜合征出血熱滅活疫苗及腸道病毒疫苗［12-13］，涉及滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程重組蛋白疫苗和聯(lián)合疫苗等多種類型疫苗，其中鋁含量檢測是重要的質(zhì)控指標(biāo)。

《預(yù)防用含鋁佐劑疫苗技術(shù)指導(dǎo)原則》［1］及《中國藥典》三部（2020版）［5］將鋁佐劑和含鋁疫苗粒徑大小及分布納入質(zhì)量特性研究和日常控制的要求，因此，鋁佐劑制備工藝和抗原吸附工藝需不斷優(yōu)化和改進(jìn)，以提高抗原吸附效果和吸附后的粒徑均一性，從而進(jìn)一步降低疫苗中鋁佐劑使用量。環(huán)境和食品行業(yè)多采用分光光度法、原子吸收光譜法和色譜技術(shù)進(jìn)行微量鋁的檢測，其中國內(nèi)食品行業(yè)采用的鉻天青S分光光度法需濃硝酸、高氯酸等強(qiáng)氧化性酸微波消解供試品，加入鉻天青S、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTMAB）、抗壞血酸、聚乙二醇辛基苯基醚等試劑反應(yīng)，再進(jìn)行比色測定，這種方法結(jié)果準(zhǔn)確、成本較低，缺點是檢測過程步驟繁瑣，易受多種因素影響，且使用大量有毒有害試劑，造成環(huán)境污染。原子吸收光譜法（atomic ab-sorption spectrometry，AAS）尚未大量應(yīng)用于檢測領(lǐng)域，主要是由于安全性不達(dá)標(biāo)，且許多關(guān)鍵部件消耗較大，處于研發(fā)階段［14-15］。國際上采用的高效液相色譜-紫外檢測法［16］、LC-MS法［17］、離子色譜-紫外檢測［18］等，可大幅提高鋁檢測的靈敏度和精確度，此類技術(shù)相較于滴定法，顯著減少了人為操作誤差，且可實現(xiàn)樣本的高通量檢測，具有審計追蹤功能，有利于質(zhì)量控制。但該方法尚未見應(yīng)用于生物制品領(lǐng)域，可能是由于疫苗的成分復(fù)雜，對樣品進(jìn)行預(yù)濃縮和／或凈化等前處理成為該方法用于疫苗中鋁含量檢測的關(guān)鍵。

本實驗用高溫干烤加酸的方法處理樣品，結(jié)果表明，最適干烤溫度為200℃，1 mol／L鹽酸最適加入量為50 μL。該步驟可將疫苗中不溶性的氫氧化鋁膠體顆粒轉(zhuǎn)化成可溶性的Al3+，排除了疫苗其他成分對檢測的干擾。Al3+與Tiron試劑在酸性條件下在波長310 nm處形成特異吸收峰的衍生物，實現(xiàn)了對鋁離子的定量檢測。本實驗方法驗證結(jié)果顯示，氯化鋁的加樣回收率在100.36%～108.40%之間；重復(fù)性及中間精密性RSD均＜6%，符合規(guī)定。采用建立的方法檢測氫氧化鋁佐劑、百白破疫苗、實驗性乙型肝炎疫苗和實驗用流感病毒裂解疫苗（佐劑）的鋁含量，結(jié)果表明，紫外分光光度法與傳統(tǒng)滴定法測定結(jié)果差異較小，且操作簡便，方法可靠，減少了人為判斷誤差。本方法實現(xiàn)了單支疫苗中鋁含量的檢測，為研發(fā)過程中鋁佐劑制備工藝、抗原吸附工藝和分裝工藝優(yōu)化提供了有效的監(jiān)測手段。另外，針對不同佐劑疫苗中所含抗原成分的不同，可在本研究基礎(chǔ)上，考慮采用柱后反應(yīng)的高效螯合離子色譜技術(shù)進(jìn)行分離和測定復(fù)雜樣品中鋁含量［19］。