人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展

周永飛，楊敬鵬綜述，常軍亮，曹玉鋒，3審校

1.長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春130012；

2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局食品藥品審核查驗(yàn)中心，北京100044；

3.怡道生物科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州215151

最早的單克隆抗體（簡(jiǎn)稱單抗）是1975年Milstein和Kohler發(fā)明的鼠源單抗［1］，雖然其具有廣闊的應(yīng)用前景，但由于恒定區(qū)可被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別而產(chǎn)生免疫副反應(yīng)，誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouse antibody reaction，HAMA）［2］，鼠源單抗的應(yīng)用有諸多限制，目前主要應(yīng)用于診斷領(lǐng)域。近年來(lái)，抗體技術(shù)的研究方向逐漸向人源方向發(fā)展［3］，迄今全球已上市的治療性抗體藥物有130多種，在抗腫瘤、抗病毒等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用［4］?？贵w技術(shù)經(jīng)40多年的發(fā)展，目前已有人鼠嵌合抗體、人源化抗體及全人源單抗等［5-6］，兔源及駝源抗體也逐漸應(yīng)用于治療領(lǐng)域，同時(shí)也出現(xiàn)了不同于原始抗體結(jié)構(gòu)的抗體，如單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體等，它們?cè)趥鹘y(tǒng)抗體的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改進(jìn)，使抗體的應(yīng)用更具有靶向性、功能性和操作性，能夠?qū)崿F(xiàn)很多傳統(tǒng)抗體所不能實(shí)現(xiàn)的功能。本文對(duì)近年來(lái)單抗人源化技術(shù)及其發(fā)展形勢(shì)作一綜述。

1 單抗人源化技術(shù)

1.1 人鼠嵌合抗體（chimeric antibody）技術(shù) 人鼠嵌合抗體是抗體人源化進(jìn)程中最早研究的抗體，是一種基因工程表達(dá)的重組抗體［7］，通過(guò)將鼠源抗體可變區(qū)基因與人源抗體恒定區(qū)基因融合表達(dá)，使其人源序列占整個(gè)抗體的70%左右，大大降低了抗體的HAMA［8］。由于不同亞型的IgG恒定區(qū)與補(bǔ)體和Fc受體的作用能力不盡相同，篩選得到的抗體恒定區(qū)可產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）等多種功能［9］，目前應(yīng)用最多的為IgG形式的嵌合抗體。最早上市的人鼠嵌合抗體是Reopro，之后還有Sylant、Rituximab［10］、Infliximab等成功上市。

由于人鼠嵌合抗體所保留的鼠源序列較多，在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)仍會(huì)被人體的免疫系統(tǒng)所識(shí)別產(chǎn)生HAMA發(fā)生，同時(shí)，由于其免疫位點(diǎn)的改變，致使抗體的活性降低，在實(shí)際應(yīng)用中往往需多次免疫才能達(dá)到預(yù)期效果［11］。

1.2 人源化抗體技術(shù)

人源化抗體技術(shù)以人鼠嵌合抗體為基礎(chǔ)繼續(xù)進(jìn)行改造，鼠源序列進(jìn)一步減少，從而減少HAMA的發(fā)生［12］?？贵w的可變區(qū)包含3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining region，CDR）和4個(gè)框架區(qū)（framework region，F(xiàn)R），人源化抗體通過(guò)抗體重構(gòu)、框架區(qū)重構(gòu)等技術(shù)來(lái)達(dá)到減少鼠源序列的目的。目前上市的人源化抗體有Trastuzumab、Bevacizumab、Ranibizumab、Aletuzumab等。

1.2.1 抗體重構(gòu) 抗體重構(gòu)也稱為CDR移植，與嵌合抗體不同的是，抗體重構(gòu)是將人源的FR序列克隆至抗體的相應(yīng)部位，僅保留了鼠源的CDR序列。重構(gòu)抗體的人源化程度可達(dá)90%以上，目前該方法是單抗人源化過(guò)程中最常用的方法［13］。由于重構(gòu)抗體移植區(qū)域明顯少于人鼠嵌合抗體，該抗體中異源序列的含量進(jìn)一步減少，免疫原性顯著降低，臨床療效良好。但抗體重構(gòu)在實(shí)際應(yīng)用中仍存在潛在的免疫原性，因此，CDR移植的發(fā)展方向是減少不必要的CDR的引入。

1.2.2 特異性決定殘基（specificity determining residue，SDR）移植 隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)CDR區(qū)并非所有的氨基酸序列均具有免疫原性，CDR區(qū)的某些特定的氨基酸殘基可與抗原接觸，從而識(shí)別特定抗原，但還有其他氨基酸序列未參與該過(guò)程，這些與抗原接觸的氨基酸序列被稱為SDR。在構(gòu)建重組抗體的過(guò)程中，只需將SDR克隆至抗體的框架中，即可獲得目標(biāo)抗體，從而進(jìn)一步降低鼠源序列［14］。

1.2.3 框架區(qū)重構(gòu) 在CDR移植過(guò)程中，對(duì)FR進(jìn)行的篩選選擇與鼠源抗體序列最相似的人FR基因序列使該抗體具有更高的活性［15］。FR的修飾包括表面重塑與糖基化修飾兩方面：表面重塑即將鼠源抗體FR表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化，而這些氨基酸殘基在免疫應(yīng)答中并不能起到重要作用；糖基化修飾即改變?cè)械奶腔稽c(diǎn)，從而使抗體的作用效力更高?？蚣軈^(qū)重構(gòu)可得到親和活性明顯提升的抗體，是重構(gòu)抗體中經(jīng)常用到的手段［16］。

1.3 全人源抗體技術(shù)

人源化單抗仍具有潛在的免疫原性，而且各種氨基酸的替換需要大量的實(shí)驗(yàn)，而全人源抗體的氨基酸序列均由人源抗體基因序列編碼，理論上可達(dá)到100%的人源化［17］，見圖1。目前應(yīng)用最多的全人源抗體技術(shù)有轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)和抗體庫(kù)技術(shù)［18］。目前已上市的全人源抗體有Nivoluma、Pembrolizumab、Denosumab等。

圖1 多種抗體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of different antibody structures

1.3.1 轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)1994年，美國(guó)首先利用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人源化單抗。轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)將優(yōu)化的編碼人抗體DNA序列導(dǎo)入至免疫缺陷小鼠的基因組中［19］，由于缺乏鼠源性免疫球蛋白基因，在抗原免疫后，小鼠分泌的抗體均由人抗體的DNA序列編碼，同時(shí)產(chǎn)生的抗體也不會(huì)被小鼠的免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生其抗體［20-21］。由于該抗體是在體內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)歷了正常的抗體裝配和成熟，從而保證了產(chǎn)生的抗體具有很高的靶結(jié)合能力。已上市的Nivolumab、Denosumab、Panitumumab等均是由轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)的。但比較顯示，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的全人源單抗并沒有野生型抗體產(chǎn)生的作用明顯，另外，由于轉(zhuǎn)基因小鼠免疫系統(tǒng)仍為小鼠本身的系統(tǒng)，不能產(chǎn)生和人體完全相同的抗體。

1.3.2 抗體庫(kù)技術(shù)

抗體庫(kù)技術(shù)首先需建立抗體庫(kù)，目前有免疫抗體庫(kù)和非免疫抗體庫(kù)兩種［22］。免疫抗體庫(kù)的建立首先要通過(guò)疫苗注射等途徑進(jìn)行免疫，再?gòu)捏w內(nèi)采集抗體，通過(guò)單細(xì)胞克隆技術(shù)等建立抗體庫(kù)［23-24］。非免疫抗體庫(kù)有半合成抗體庫(kù)、全合成抗體庫(kù)和天然抗體庫(kù)3種：半合成抗體庫(kù)是合成隨機(jī)的CDR序列；全合成抗體庫(kù)則是整個(gè)可變區(qū)完全由人工合成；天然抗體庫(kù)的抗體基因來(lái)源于未免疫個(gè)體的淋巴細(xì)胞，由于未用特異性抗原免疫，可用于多種抗原的篩選，但所得抗體由于未經(jīng)抗體親和力成熟等過(guò)程，親和力較低［25］。

1.3.2.1 噬菌體展示技術(shù)（phage dispay） 噬菌體展示技術(shù)將抗體庫(kù)中可變區(qū)基因在噬菌體表面表達(dá)，經(jīng)抗原抗體結(jié)合后，篩選出親和力最高的抗體，從而用于制備人源化單抗產(chǎn)品［26］。由于該方法是在體外篩選，更易于自動(dòng)化與高通量化。體外篩選還克服了免疫耐受性，能夠篩選出識(shí)別高度保守靶點(diǎn)的蛋白。Necitumumab及Adalimumab等均是由噬菌體庫(kù)篩選的［27］。但庫(kù)容量的限制、宿主對(duì)氨基酸修飾的限制、細(xì)胞毒蛋白的限制等仍會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.3.2.2 核糖體展示技術(shù)（ribosome display） 與噬菌體展示技術(shù)不同的是，核糖體展示技術(shù)所產(chǎn)生的抗體不會(huì)存在于噬菌體表面，而是直接在非細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達(dá)。該技術(shù)首先需利用PCR擴(kuò)增目的基因DNA文庫(kù)，再導(dǎo)入一系列轉(zhuǎn)錄元件進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中進(jìn)行翻譯，使靶基因的翻譯產(chǎn)物展示在核糖體表面，形成mRNA-蛋白質(zhì)-核糖體三元復(fù)合體，再向翻譯混合物中加入抗原進(jìn)行篩選，以獲得親和力最高的蛋白質(zhì)。核糖體展示技術(shù)作為一種無(wú)細(xì)胞展示系統(tǒng)，經(jīng)20多年的發(fā)展，已成功應(yīng)用于體外篩選特異性結(jié)合抗體［28］。與噬菌體展示技術(shù)相比，核糖體展示技術(shù)解決了噬菌體展示技術(shù)的抗體庫(kù)容量問(wèn)題，可表達(dá)包含毒性蛋白在內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了更高庫(kù)容量的表達(dá)。

1.3.2.3 mRNA展示（mRNA display）技術(shù)mRNA展示技術(shù)的原理與核糖體展示技術(shù)基本相似，不同的是，mRNA展示系統(tǒng)翻譯出來(lái)的蛋白是與mRNA通過(guò)接頭連接在一起的，由于無(wú)核糖體的存在，更有利于篩選，而核糖體展示由于mRNA、多肽和核糖體三位一體，可能會(huì)影響接下來(lái)的篩選，丟失部分抗體，同時(shí)，由于其結(jié)合的不穩(wěn)定性，很有可能導(dǎo)致篩選失?。?9］，因此，mRNA展示技術(shù)是核糖體展示技術(shù)的改良與延伸。

1.3.2.4 酵母展示技術(shù)（yeast display） 酵母展示技術(shù)利用酵母作為載體，將外源基因通過(guò)融合表達(dá)的形式定位至酵母細(xì)胞表面，從而展現(xiàn)出最完整的蛋白結(jié)構(gòu)以進(jìn)行篩選。酵母作為一種真核生物，既能實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)過(guò)程中的翻譯后修飾過(guò)程，又能將蛋白的表位完全呈現(xiàn)出來(lái)，還可通過(guò)熒光素等標(biāo)志物標(biāo)記酵母細(xì)胞，繼而利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)和定量篩選。

1.3.2.5 單細(xì)胞技術(shù) 隨著基因測(cè)序技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)單細(xì)胞技術(shù)研究火熱，在人源化抗體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。該技術(shù)可從建立好的抗體庫(kù)內(nèi)根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記分子篩選出單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞富集后利用RT-PCR直接獲得抗體的重鏈和輕鏈基因［30］。免疫過(guò)疫苗的人外周血抗體庫(kù)篩選出來(lái)的高特異性抗體可用來(lái)制備全人源抗體，免疫過(guò)疫苗的兔脾臟可用來(lái)篩選兔源單抗，經(jīng)抗體人源化后即可應(yīng)用于人體，Brolucizumab為全球首個(gè)獲批的兔源單抗［31］。

綜上所述，抗體庫(kù)技術(shù)徹底改變了單抗的制備方法，擺脫了對(duì)鼠源細(xì)胞的依賴，產(chǎn)生的抗體完全人源化，是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

2 新型抗體

隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，抗體的結(jié)構(gòu)也不僅局限于最原始的結(jié)構(gòu)，逐漸發(fā)展出單鏈抗體、雙特異性抗體、納米抗體以及以DNA編碼的單抗等。目前已有多種不同類型的人源化單抗上市。

2.1 單鏈抗體（single-chain Fv） 單鏈抗體由于不含抗體恒定區(qū)，其相對(duì)分子質(zhì)量要小于正常的抗體，同時(shí)也失去了與Fc受體結(jié)合的功能，但也因此，其可塑性非常強(qiáng)，可與多種分子結(jié)合，從而介導(dǎo)不同的殺傷作用，如制備靶向作用的“生物炮彈”、抗體融合蛋白［32］、抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）［33］等，同時(shí)，由于其相對(duì)分子質(zhì)量小，產(chǎn)生HAMA的幾率非常低［34］，已上市的單鏈抗體有Bren-tuximab vedotin和Ado-trastuzumabemtansine等。單鏈抗體人源化的技術(shù)有多種，以噬菌體展示和核糖體展示技術(shù)最為常用，鼠源抗體經(jīng)蛋白質(zhì)測(cè)序后進(jìn)行CDRs移植的方法也有文獻(xiàn)報(bào)道［35］。但單鏈抗體也存在抗原性弱、效果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中往往存在諸多限制。

2.2 雙特異性抗體（bispecific antibody）雙特異性抗體的可變區(qū)含有兩種不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)［36-37］，這兩種結(jié)合位點(diǎn)可以是分別與效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合的，從而激發(fā)出具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)［38-39］，也可以是靶向兩種腫瘤位點(diǎn)的，以減少用藥量以及臨床審批的步驟，也會(huì)起到更強(qiáng)的免疫作用。目前雙特異性抗體制備最常規(guī)的手段是基因工程方法，也可利用兩種雜交瘤細(xì)胞融合、化學(xué)偶聯(lián)法等方法制備［40］，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，在腫瘤治療及抗病毒領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［41］。同時(shí)靶向CD19和CD3的Blinatumomab以及治療血友病的Emicizumab均為該類抗體藥物［42］。

2.3納米抗體（nanobody）納米抗體是1993年最早從羊駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗體，其天然缺失輕鏈和CH1恒定區(qū)。由于其相對(duì)分子質(zhì)量小，體內(nèi)組織滲透性好，可很輕易地穿過(guò)血管到達(dá)靶標(biāo)。天然的羊駝納米抗體與人源抗體相比，其氨基酸殘基差別并不大。目前已有利用噬菌體展示技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)制備全人源化納米抗體的報(bào)道。針對(duì)von Willebrand因子的Caplacizumab-Yhdp作為全球首個(gè)獲批的納米抗體藥物，為納米單抗藥物的研發(fā)提供了廣闊的前景。由于目前上市的產(chǎn)品較少，未來(lái)納米抗體的長(zhǎng)期使用是否會(huì)產(chǎn)生免疫副反應(yīng)仍需觀察。

2.4 DNA編碼的單抗（DNA-encoded monoclonal antibody，dMAb）DNA編碼的單抗是新興起的一種全人源單抗技術(shù)。與當(dāng)前常規(guī)治療性抗體不同，其是在人體內(nèi)產(chǎn)生，而并非在體外合成。與DNA疫苗類似，dMAb首先需構(gòu)建出一種序列優(yōu)化的質(zhì)粒，用于編碼一種單抗，借助CELLECTRA?等公司的電穿孔技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至人體內(nèi)，使該單抗基因在人體中表達(dá)。dMAb可進(jìn)行序列優(yōu)化，從而使抗體在體內(nèi)表達(dá)量顯著提升，刺激強(qiáng)大的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)還能保持以往的抗原抗體結(jié)合能力。dMAb技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，當(dāng)前現(xiàn)有的人源化單抗均可由基因編碼后在人體內(nèi)表達(dá)，是一種抗體全人源化的全新手段。dMAb技術(shù)由于興起較晚，目前還處于研發(fā)階段，暫時(shí)無(wú)上市的單抗［43］。

3 國(guó)內(nèi)外抗體藥物發(fā)展趨勢(shì)

目前國(guó)外人源化單抗的生產(chǎn)以創(chuàng)新為主，全球已有80多種單抗類藥物獲批上市，其中美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)50多種。截至2019年5月，國(guó)內(nèi)共批準(zhǔn)單抗藥品36個(gè)，其中國(guó)產(chǎn)14個(gè)，進(jìn)口22個(gè)，與美國(guó)差距明顯。隨著多種原研單抗藥物的專利到期，近年來(lái)國(guó)外生物類似藥獲批數(shù)量也逐漸增多，呈井噴式發(fā)展。截止目前，歐盟已有17種單抗類生物類似藥獲批上市，美國(guó)已有10種。最早獲批上市的生物類似藥是歐盟2013年批準(zhǔn)的英夫利西單抗，2016年，美國(guó)安進(jìn)公司（Amgen）阿達(dá)木單抗的生物類似藥AMJEVITA在美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局獲批上市，這也是阿達(dá)木單抗首個(gè)獲批的抗體生物類似藥。國(guó)內(nèi)人源化單抗由于起步較晚，研發(fā)水平與發(fā)達(dá)國(guó)家存在較大差距，目前以進(jìn)口藥為主，但自研藥以及生物類似藥的研究也發(fā)展迅速。2015年2月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局正式頒布《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行），規(guī)范了生物類似藥的申報(bào)程序、注冊(cè)類別和申報(bào)資料等相關(guān)注冊(cè)要求，為生物類似藥的研發(fā)提供了基本指導(dǎo)和依據(jù)。在政府的大力支持及行業(yè)和市場(chǎng)的合力驅(qū)動(dòng)下，國(guó)內(nèi)的生物類似藥研究呈指數(shù)上升趨勢(shì)，靶點(diǎn)主要集中在CD20、EFGR、VEGF、TNF和HER2，包括阿達(dá)木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗及英夫利昔單抗等在內(nèi)的多種專利已過(guò)期或即將過(guò)期的原研單抗藥物成為國(guó)內(nèi)藥企爭(zhēng)先研發(fā)的熱點(diǎn)。2019年2月，由上海復(fù)宏漢霖生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)的首個(gè)國(guó)產(chǎn)利妥昔單抗生物類似藥漢利康?上市，意味著在生物類似藥開發(fā)領(lǐng)域，我國(guó)生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)已處在從“跟跑歐美”轉(zhuǎn)向“與歐美并跑”的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

4 展望

近年來(lái)，在全球批準(zhǔn)的新藥中，人源單抗類藥物所占比例越來(lái)越大，可見人源單抗具有很高的應(yīng)用價(jià)值，為腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病的治療提供了新的思路。雖然抗體人源化后理論上能降低HAMA，但目前尚無(wú)法完全消除，越來(lái)越多的報(bào)道顯示，人源化抗體在應(yīng)用過(guò)程中仍可產(chǎn)生HAMA［44］，因此，合理運(yùn)用上述方法和技術(shù)創(chuàng)新，在原有的基礎(chǔ)上減少抗體異源性，不斷提高抗體的親和力，開發(fā)出針對(duì)全新靶點(diǎn)的人源抗體，是抗體藥物發(fā)展的必由之路，必將為新藥開發(fā)開辟新的道路。另一方面，隨著生物類似藥的逐漸上市，未來(lái)以外企為主的競(jìng)爭(zhēng)格局將逐漸被打破，鑒于生物類似藥較原研藥具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，加上國(guó)家醫(yī)保政策的強(qiáng)力支持，生物類似藥將更好、更廣泛地惠及患者，對(duì)醫(yī)療大健康產(chǎn)業(yè)持續(xù)性地產(chǎn)生積極影響。