代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)L-絲氨酸

李旋,王加初,劉益寧,蔣帥,吳鶴云,謝希賢,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457) 2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457) 3(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)

L-絲氨酸(L-serine,L-Ser)可以促進(jìn)脂肪以及脂肪酸的合成,同時(shí)還是半胱氨酸和色氨酸等物質(zhì)的合成前體,具有重要的生理功能[1],被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。目前L-Ser的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法,其中微生物發(fā)酵法原料來源廣泛,能耗低,對(duì)環(huán)境友好,是L-Ser生產(chǎn)研究的重點(diǎn)。

生物體中L-Ser合成途徑受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,且生成的L-Ser很容易被降解(圖1)。另外,胞內(nèi)L-Ser積累不僅會(huì)抑制細(xì)胞分裂和肽聚糖的合成[2],還會(huì)轉(zhuǎn)化為丙烯酸酯等有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[3]。這些因素限制了L-Ser的過量合成。因此,L-Ser高產(chǎn)菌株的構(gòu)建策略主要包括3個(gè)方面：(1)解除反饋調(diào)控作用以增強(qiáng)L-Ser合成通量。BELL等[4]通過去除3-磷酸甘油脫氫酶(PGDH,serA基因編碼)的調(diào)控域,所得PGDH突變體不受L-Ser反饋抑制,有效促進(jìn)了L-Ser的合成。(2)阻斷L-Ser降解的途徑。L-Ser可被降解為丙酮酸和甘氨酸,直接阻斷L-Ser向丙酮酸的降解有利于L-Ser的積累,同時(shí)不影響細(xì)胞正常代謝[5]；但是L-Ser向甘氨酸裂解過程中產(chǎn)生的5,10-亞甲基四氫葉酸對(duì)于嘌呤的合成有著關(guān)鍵作用,直接阻斷此途徑會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。STOLZ等[6]為了弱化L-Ser向甘氨酸的降解,敲除了谷氨酸棒狀桿菌中pabAB和pabC基因,構(gòu)建了葉酸缺陷性菌株,經(jīng)過60 h發(fā)酵,可積累L-Ser約36 g/L。但是在發(fā)酵過程中需添加適量葉酸來調(diào)控絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT,glyA基因編碼)的活性,并且生長(zhǎng)也受到明顯抑制。(3)提高細(xì)胞對(duì)L-Ser的耐受性。一是通過適應(yīng)性進(jìn)化的方式逐步提升菌株對(duì)L-Ser的耐受性,如MUNDHADA等[7]對(duì)菌株進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化,提高了菌株對(duì)高濃度L-Ser的耐受性,最終耐受菌經(jīng)過48 h補(bǔ)料分批發(fā)酵,產(chǎn)物積累量為37 g/L,L-Ser產(chǎn)量提高了3倍,對(duì)進(jìn)化菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)thrA基因突變對(duì)減緩L-Ser對(duì)細(xì)胞毒性有重要的作用。二是選擇合適的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)胞內(nèi)L-Ser分泌,從而減緩胞內(nèi)L-Ser積累對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制。ZHANG等[8]通過對(duì)基因eamA進(jìn)行同源檢索,發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌中蛋白SerE可高效轉(zhuǎn)運(yùn)L-Ser,菌株經(jīng)過118 h補(bǔ)料分批發(fā)酵,終產(chǎn)量達(dá)到50 g/L,這是目前報(bào)道的L-絲氨酸的最高產(chǎn)量。

目前,L-Ser菌株構(gòu)建取得了一定的成效,但是一些關(guān)鍵問題如L-Ser向甘氨酸的降解以及菌株對(duì)L-Ser的耐受性等還未得到很好的解決。為此本研究以野生型大腸桿菌MG1655為出發(fā)菌,通過減弱L-Ser降解途徑,增強(qiáng)L-Ser的合成酶類的表達(dá),以及改造L-Ser的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),獲得了1株穩(wěn)定高產(chǎn),無質(zhì)粒的非缺陷型大腸桿菌L-Ser生產(chǎn)菌株(圖1)。其中,為了減弱絲氨酸向甘氨酸的降解,采用啟動(dòng)子Ptrp啟動(dòng)glyA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),通過調(diào)整色氨酸的添加時(shí)間和添加量對(duì)SHMT的活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控,有效促進(jìn)了L-Ser的積累,且未對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響,可為L(zhǎng)-Ser高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供新的借鑒和參考。

圖1 L-Ser生物合成途徑和本研究的代謝工程改造策略Fig.1 Biosynthetic pathway of L-Ser and the metabolic engineering strategies used in this study

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒以及主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒見表1。Primer STAR HS DNA聚合酶,大連寶生物科技有限公司；2×Rapid Taq Mix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit,南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA凝膠純化回收試劑盒,美國Omega公司；引物及基因均由蘇州金唯智科技有限公司合成。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 工程菌株構(gòu)建

根據(jù)LI等[9]報(bào)道的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)E.coli基因組進(jìn)行編輯。操作體系包含pGRB和pREDCas9這2個(gè)質(zhì)粒。其中pREDCas9帶有g(shù)RNA質(zhì)粒的消除系統(tǒng),λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)及Cas9蛋白表達(dá)系統(tǒng),擁有奇霉素抗性,32 ℃培養(yǎng)；pGRB質(zhì)粒是以pUC18為骨架,質(zhì)粒含有啟動(dòng)子J23100,gRNA-Cas9結(jié)合區(qū)域序列和終止子序列,具有氨芐青霉素抗性,37 ℃培養(yǎng)。通過構(gòu)建pGRB質(zhì)粒,使其轉(zhuǎn)錄相應(yīng)gRNA,從而與Cas9蛋白形成復(fù)合體,通過堿基配對(duì)與PAM識(shí)別目的基因,實(shí)現(xiàn)目的DNA雙鏈斷裂。

1.2.1 重組片段獲得以及重組pGRB質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)目的基因的序列,利用軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì),通過PCR獲得目的基因片段。以待整合或待敲除位點(diǎn)上下游序列為模板,設(shè)計(jì)合適的PCR引物,擴(kuò)增500 bp左右的上、下游同源臂片段。對(duì)目的基因片段、上下游同源臂片段進(jìn)行重疊PCR,以獲得基因整合用的重組DNA片段。進(jìn)行基因敲除時(shí),只需對(duì)上下游同源臂片段進(jìn)行重疊PCR構(gòu)建。

使用含有靶序列的DNA雙鏈片段與線性化的載體片段利用同源重組的方法構(gòu)建pGRB重組質(zhì)粒。使用CRISPR RGEN Tools網(wǎng)站設(shè)計(jì)靶序列,設(shè)計(jì)引物：5-線性化載體末端序列(15 bp)-酶切位點(diǎn)-靶序列(不包括PAM序列)-線性化載體末端序列(15 bp)-3’及其反向互補(bǔ)的引物,單鏈DNA通過退火獲得包括目的序列的DNA雙鏈片段。利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit重組酶將靶序列與線性化的pGRB載體進(jìn)行重組連接,通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入E.coliDH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài),篩選陽性轉(zhuǎn)化子,得到含目標(biāo)靶序列的pGRB載體。

1.2.2 構(gòu)建重組菌株

將pREDCas9質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中,平板培養(yǎng)并篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性菌株接種到含LB培養(yǎng)基的搖管中培養(yǎng)12 h,再接種于2 XYT培養(yǎng)基(蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 5 g/L,奇霉素100 mg/L)中培養(yǎng),待OD600長(zhǎng)到0.1～0.2時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,OD600長(zhǎng)到0.3～0.4時(shí)收集菌體,用10%的甘油洗滌,制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)[10]。將pGRB質(zhì)粒以及重組片段同時(shí)電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中,在含氨芐青霉素抗性和奇霉素抗性的LB平板上,32 ℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出單菌落后,通過菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子,再消除pGRB和pREDCas9質(zhì)粒,獲得目標(biāo)菌株。

1.3 L-絲氨酸工程菌株發(fā)酵

1.3.1 搖瓶發(fā)酵

首先將菌種接種在固體斜面培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,NaCl 10 g/L,牛肉膏10 g/L,蔗糖1 g/L,瓊脂粉20 g/L),置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)移至新的固體斜面培養(yǎng)基再培養(yǎng)12 h。用接種環(huán)刮取一環(huán)菌體,接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底三角瓶中,用九層紗布封口,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h。種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L,酵母粉2 g/L,蛋白胨2 g/L,KH2PO4·3H2O 1.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO410 mg/L,維生素B11.3 mg/L,維生素B31.3 mg/L,維生素B51.3 mg/L,維生素B71.3 mg/L,維生素B91.3 mg/L,維生素H 1 mg/L,苯酚紅8 mg/L,消泡劑1滴,pH維持在7.0～7.2。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照10%的接種量接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：葡萄糖20 g/L,KH2PO4·3H2O 2 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,FeSO4·7H2O 20 mg/L,MnSO420 mg/L,維生素B12 mg/L,維生素B32 mg/L,維生素B52 mg/L,維生素B72 mg/L,維生素B92 mg/L,維生素H 2 mg/L,苯酚紅8 mg/L,消泡劑1滴。在發(fā)酵過程中,根據(jù)培養(yǎng)基中苯酚紅的顏色指示,補(bǔ)加氨水,使發(fā)酵液pH值維持在7.0左右。每當(dāng)葡萄糖耗盡后,補(bǔ)加1 mL 600 mg/mL葡萄糖溶液維持發(fā)酵進(jìn)行,發(fā)酵周期為24 h。

1.3.2 發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵

將菌株活化之后使用無菌水沖洗菌體,接種于發(fā)酵罐中,發(fā)酵罐的種子培養(yǎng)基與搖瓶種子培養(yǎng)基相同。培養(yǎng)過程中通過自動(dòng)流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%氨水,將pH值穩(wěn)定在7.0左右,溫度恒定在37 ℃,溶氧在20%～30%。菌體OD600達(dá)到10～12時(shí),按照20%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基與搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相同。整個(gè)發(fā)酵過程溶氧維持在20%～30%,pH值維持在7.0,溫度維持在37 ℃,當(dāng)罐中的葡萄糖耗盡時(shí),通過流加質(zhì)量濃度800 mg/mL的葡萄糖溶液,維持罐中葡萄糖的質(zhì)量濃度在0.1～2 g/L內(nèi)。

1.3.3 發(fā)酵過程中的檢測(cè)與分析

利用分光光度計(jì)測(cè)量發(fā)酵液在600 nm處的吸光度(OD600),根據(jù)已有測(cè)試實(shí)驗(yàn),將菌株OD600值乘以0.39換算為細(xì)胞干重(dry cell weight,DCW)值。發(fā)酵液中的殘?zhí)橇渴褂蒙飩鞲衅鬟M(jìn)行檢測(cè)。采用Sykam S433D氨基酸分析儀檢測(cè)發(fā)酵液中L-Ser濃度[11],具體檢測(cè)按照廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。

1.3.4 發(fā)酵數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用t檢驗(yàn)雙尾分布對(duì)改造菌和對(duì)應(yīng)出發(fā)菌的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行單向方差分析。0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 阻斷L-Ser向丙酮酸的降解途徑

大腸桿菌中L-Ser可由sdaA,sdaB以及tdcG基因編碼的絲氨酸脫氨酶降解為丙酮酸,也可由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT,由glyA基因編碼)降解為甘氨酸[12-13]。本研究先將野生型大腸桿菌MG1655中編碼絲氨酸脫氨酶的3個(gè)基因sdaA,sdaB以及tdcG進(jìn)行敲除,阻斷L-Ser向丙酮酸的降解,獲得菌株SER01。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示(圖2),發(fā)酵結(jié)束后,兩株菌的細(xì)胞干重沒有明顯的差異,而3個(gè)基因敲除后,SER01可積累0.12 g/L的L-Ser,是出發(fā)菌株的2.77倍,說明阻斷L-Ser向丙酮酸降解有效促進(jìn)了L-Ser的積累,且對(duì)菌體的生長(zhǎng)無影響。

圖2 阻斷L-Ser向丙酮酸的降解對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of blocking the degradation of L-Ser to pyruvate on L-Ser fermentation

2.2 強(qiáng)化L-Ser的合成酶類的表達(dá)

增加產(chǎn)物合成相關(guān)酶類的表達(dá)是構(gòu)建工程菌種的常見策略。胞內(nèi)3-磷酸甘油酸依次被磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH,由serA基因編碼),磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAST,由serC基因編碼)以及磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP,由serB基因編碼)催化生成L-Ser[14]。其中PGDH為L(zhǎng)-Ser合成限速關(guān)鍵酶,其活性受到L-Ser的反饋抑制。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15],將PGDH中的第344位的組氨酸以及第364位的天冬酰胺替換為丙氨酸,可解除終產(chǎn)物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制。因此,本研究將該突變體的編碼基因serA*整合到假基因位點(diǎn)yjiP,并由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,獲得菌株SER02。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,SER02的L-Ser產(chǎn)量為1.23 g/L,相比SER01提高了9.25倍；細(xì)胞干重為8.69 g/L,相比SER01降低了30.14%。結(jié)果說明serA*強(qiáng)化表達(dá)能增強(qiáng)L-Ser合成代謝,但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在一定程度的抑制作用。接著在SER02的假基因yjiV和ycjV位點(diǎn)分別整合了serC,serB基因,并由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,獲得菌株SER03。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖3),SER03的L-Ser產(chǎn)量達(dá)到5.41 g/L,是菌株SER02的4.39倍。

圖3 強(qiáng)化L-Ser合成酶的表達(dá)對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of enhancing the expression of L-Ser synthases on L-Ser fermentation

結(jié)果說明serC,serB基因表達(dá)的強(qiáng)化,顯著增強(qiáng)了L-Ser的合成途徑,有效促進(jìn)了L-Ser的積累。另外,相比于對(duì)SER02,SER03的細(xì)胞干重有所增加,說明serC,serB基因表達(dá)使L-Ser的合成途徑更為通暢,一定程度上緩解了關(guān)鍵基因serA*的單獨(dú)表達(dá)所造成的代謝不平衡。為了進(jìn)一步加強(qiáng)L-Ser的合成途徑,本研究在假基因rph位點(diǎn)對(duì)serA*進(jìn)行雙拷貝,由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,獲得菌株SER04。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖3),SER04的L-Ser產(chǎn)量和細(xì)胞干重都大幅降低,說明serA*基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的強(qiáng)度過大,會(huì)使胞內(nèi)代謝嚴(yán)重失衡,不利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。

2.3 L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造

轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)氨基酸生產(chǎn)有重要影響,促進(jìn)產(chǎn)物外排,減弱或阻斷產(chǎn)物吸收途徑是提高產(chǎn)物合成效率的重要舉措[16]。高濃度L-Ser會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生理毒性,及時(shí)將其從胞內(nèi)轉(zhuǎn)出有利于細(xì)胞正常生長(zhǎng)。L-Ser與半胱氨酸結(jié)構(gòu)相似,半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EamA也可向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)L-Ser[17]。本研究在菌株SER03的假基因tehB位點(diǎn)上,整合了eamA基因,由強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,獲得菌株SER05。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖4),SER05的L-Ser產(chǎn)量達(dá)到7.41 g/L,較SER03提高了36.96%,說明強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EamA的表達(dá),促進(jìn)了L-Ser向胞外轉(zhuǎn)運(yùn),有效促進(jìn)了L-Ser的合成。另外,SstT和SdaC也是L-Ser的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[18-19],可從胞外攝取L-Ser。于是本研究依次敲除了菌株SER05的sstT和sdaC基因,構(gòu)建了菌株SER06和SER07。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖4),SER06的L-Ser產(chǎn)量為8.65 g/L,相較于SER05提高了16.73%,SER07的L-Ser產(chǎn)量為11.23 g/L,相較于SER05提高了51.32%。結(jié)果表明sstT和sdaC基因的敲除顯著促進(jìn)了胞外L-Ser積累。

圖4 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)改造對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of transport system modifications on L-Ser fermentation

2.4 SHMT表達(dá)的調(diào)控

L-Ser可由SHMT降解為甘氨酸,制約著L-Ser的大量積累。為了阻斷該降解途徑,促進(jìn)L-Ser的合成,本研究首先嘗試將SER07的glyA基因敲除,構(gòu)建了菌株SER08。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示(圖5-a),敲除glyA基因后菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都顯著下降。這是因?yàn)長(zhǎng)-Ser裂解為甘氨酸的反應(yīng)是一碳循環(huán)的重要一環(huán)[20],對(duì)細(xì)胞代謝意義重大。因此選擇合適的方式調(diào)控SHMT表達(dá),平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物積累之間的關(guān)系,才會(huì)有效促進(jìn)L-Ser的積累。

目前通過調(diào)節(jié)glyA基因表達(dá)來增加L-Ser積累已有較多報(bào)道,包括構(gòu)建葉酸缺陷型[6]或者甘氨酸缺陷型[20]等方法,但是所得菌株在發(fā)酵過程中即便補(bǔ)加了適量的葉酸或者甘氨酸,菌體生長(zhǎng)還是會(huì)受到一定的抑制,導(dǎo)致這些方法對(duì)L-Ser產(chǎn)量提升的效果有限。大腸桿菌色氨酸的合成受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩嘀卣{(diào)控,在轉(zhuǎn)錄水平上,色氨酸操縱子基因的轉(zhuǎn)錄會(huì)受到轉(zhuǎn)錄弱化和轉(zhuǎn)錄阻遏兩種機(jī)制的調(diào)控。這兩種調(diào)控機(jī)制都和色氨酸操縱子的啟動(dòng)子Ptrp相關(guān),而Ptrp的強(qiáng)度受胞內(nèi)色氨酸濃度的負(fù)調(diào)控[21]。為此本研究將glyA基因自身啟動(dòng)子替換為Ptrp,使glyA基因在菌株生長(zhǎng)前期可以表達(dá),保證細(xì)胞正常生長(zhǎng),待發(fā)酵至一定階段后,通過向培養(yǎng)基中添加色氨酸弱化甚至阻斷glyA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),減少L-Ser向甘氨酸的代謝,以期增加L-Ser積累。

將菌株SER08的glyA基因整合到假基因位點(diǎn)yeep上,用Ptrp啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,獲得菌株SER09。發(fā)酵結(jié)果顯示(圖5-a),菌株SER09的L-Ser產(chǎn)量為12.23 g/L,比SER07(原啟動(dòng)子控制glyA基因)提高了8.28%,DCW為8.93 g/L,比SER07降低了15.43%。因此總體來看,SER09的單位菌體產(chǎn)酸相比SER07提高了50%。更為明顯的效果是,SER09的總耗糖為54.54 g/L,比SER07(109.0 g/L)降低了49.96%,因此糖酸轉(zhuǎn)化率提高了1.15倍。隨后本研究通過色氨酸的添加進(jìn)一步調(diào)控SHMT的表達(dá)。首先在0,4,8,12,16 h分別添加200 mg/L色氨酸,以不添加色氨酸作為對(duì)照組,考察了色氨酸添加時(shí)間對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響,結(jié)果顯示(圖5-b),發(fā)酵液中L-Ser積累量隨著色氨酸添加時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在發(fā)酵12 h時(shí)添加色氨酸效果最好。過早添加色氨酸可能會(huì)導(dǎo)致SHMT活性太弱,嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng),導(dǎo)致L-Ser產(chǎn)量也相應(yīng)降低；過晚添加色氨酸則無法有效調(diào)控SHMT的表達(dá),于是最終選擇在發(fā)酵12 h時(shí)添加色氨酸。接著對(duì)色氨酸的添加量進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果顯示(圖5-c),培養(yǎng)基中添加50 mg/L色氨酸即可滿足實(shí)驗(yàn)需求。最終在12 h添加50 mg/L色氨酸,SER09的L-Ser產(chǎn)量達(dá)到13.53 g/L,相比SER07,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了140%,單位菌體產(chǎn)酸提高了50%(表2)。

a-SHMT不同調(diào)控方式對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響；b-不同色氨酸添加時(shí)間對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響；c-不同色氨酸添加量對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響圖5 啟動(dòng)子Ptrp調(diào)控SHMT表達(dá)對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of SHMT expression regulated by Ptrp promoter on L-Ser fermentation.

表2 啟動(dòng)子Ptrp調(diào)控SHMT表達(dá)對(duì)L-Ser發(fā)酵的影響Table 2 The effect of SHMT expression regulated by Ptrp promoter on L-Ser fermentation

2.5 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵測(cè)試

為測(cè)試菌株的綜合性能,將菌株SER07和SER09進(jìn)行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵測(cè)試,在發(fā)酵12 h時(shí)添加50 mg/L色氨酸。發(fā)酵結(jié)果顯示,SER09雖然菌體生長(zhǎng)速度變慢,但是最終的DCW值和SER07差距不大,并且在發(fā)酵前期SER09產(chǎn)酸速率明顯高于SER07,28 h時(shí)SER09產(chǎn)酸達(dá)到最高值為22.31 g/L,SER07在32 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最高值22.07 g/L(圖6)。28 h時(shí)SER09的糖酸轉(zhuǎn)化率為0.19 g/(g葡萄糖),比菌株SER07(32 h)提高84.38%,發(fā)酵結(jié)束時(shí)SER09的單位菌體產(chǎn)酸為1.25 g/g DCW,比菌株SER07提高了25.19%。本研究利用Ptrp啟動(dòng)子啟動(dòng)glyA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),通過控制色氨酸的添加量和添加時(shí)間動(dòng)態(tài)調(diào)控SHMT的表達(dá),結(jié)果表明這種調(diào)控方式不會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)缺陷,可在滿足菌體正常生長(zhǎng)的前提下,有效降低SHMT的活性,顯著增強(qiáng)了L-Ser的合成途徑。另外,SER07和SER09在發(fā)酵后期L-Ser濃度達(dá)到20 g/L左右以后,L-Ser產(chǎn)量都不再增加,這可能跟胞內(nèi)高濃度L-Ser會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生理毒性有關(guān)。增強(qiáng)菌株對(duì)高濃度L-Ser的耐受性是后續(xù)菌種性能優(yōu)化的重點(diǎn)。適應(yīng)性進(jìn)化可有效提高菌株的耐受性,其近年也被成功地應(yīng)用于激活細(xì)胞潛在通路或者提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[22]。YONGZE等[23]通過進(jìn)化提高大腸桿菌KC01對(duì)乙醇耐受性,使所得突變體SZ407與對(duì)照菌株相比,細(xì)胞干重提高了67%,單位體積乙醇生產(chǎn)速率提高48%,最終產(chǎn)量提高94%,改造效果明顯。適應(yīng)性進(jìn)化的方法也用提高菌株對(duì)高濃度L-Ser耐受的菌株[7]。因此為提高工程菌株SER09L-Ser的產(chǎn)量,可對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中逐步增加培養(yǎng)基中L-Ser的添加量,獲得高耐L-Ser的菌株。

圖6 工程菌SER07和SER09在5 L發(fā)酵罐上分批 補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果Fig.6 Fed-batch fermentation results of the engineered strain SER07 and SER09 in a 5 L bioreactor.

3 結(jié)論

本研究對(duì)野生型大腸桿菌MG1655進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造,從頭構(gòu)建了1株L-Ser生產(chǎn)菌。主要是在基因組水平上,阻斷了L-Ser向丙酮酸降解,增強(qiáng)了L-Ser合成酶類的表達(dá)并對(duì)L-Ser轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行了改造。為進(jìn)一步促進(jìn)L-Ser的積累,本研究重點(diǎn)對(duì)SHMT的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)控：利用啟動(dòng)子Ptrp啟動(dòng)glyA基因的表達(dá),在發(fā)酵12 h,菌體生長(zhǎng)到一定程度后,通過外源添加50 mg/L的色氨酸,弱化glyA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這種調(diào)控方式有效抑制了SHMT的活性,且未對(duì)菌體生長(zhǎng)造成明顯影響,因而顯著提高了L-Ser的合成效率。工程菌株SER09是1株不含質(zhì)粒,遺傳背景清晰,無缺陷型的L-Ser生產(chǎn)菌株。最終所得工程菌株SER09在5 L罐上發(fā)酵28 h,可生產(chǎn)22.31 g/L的L-Ser,其糖酸轉(zhuǎn)化率以及單位菌體產(chǎn)酸相較對(duì)照菌株SER07分別提高84.38%以及25.19%,且培養(yǎng)過程中無需額外添加甘氨酸,改造效果明顯,適合作為平臺(tái)菌株用于進(jìn)一步的性能改良,具有較好的應(yīng)用前景。另外,胞內(nèi)高濃度L-Ser會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生理毒性,這可能是發(fā)酵中后期L-Ser的質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L左后停止增長(zhǎng)的原因,因此在后期研究中計(jì)劃利用適應(yīng)性進(jìn)化方法增強(qiáng)細(xì)胞的耐受性,利用高濃度L-Ser作為選擇壓力對(duì)工程菌株SER09進(jìn)行傳代培養(yǎng),篩選具有一定耐受性的菌株,進(jìn)一步提升菌株L-Ser的發(fā)酵性能。