禽源奇異變形桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因型檢測與質(zhì)粒分析

趙世玉，焦嘉杰，董寧寧，潘圓月，崔孟梅，潘玉善

禽源奇異變形桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶基因型檢測與質(zhì)粒分析

趙世玉1，焦嘉杰1，董寧寧1，潘圓月2，崔孟梅1，潘玉善1

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002

【】研究禽源奇異變形桿菌攜帶ampC基因的分型和CMY-2陽性接合質(zhì)粒pC12的序列結(jié)構(gòu)，為防控多重耐藥禽源奇異變形桿菌的傳播提供理論基礎(chǔ)。利用頭孢西丁三維試驗和PCR方法對21株奇異變形桿菌進(jìn)行AmpC酶的檢測和基因分型研究；對CMY-2陽性菌株進(jìn)行脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型和接合試驗；利用高通量測序技術(shù)獲得pC12的核苷酸序列并進(jìn)行比較分析。頭孢西丁三維試驗表明21株禽源奇異變形桿菌中有6株產(chǎn)AmpC酶。6株產(chǎn)AmpC酶奇異變形桿菌對氨芐西林、頭孢西丁、多西環(huán)素、氟苯尼考、粘菌素全部耐藥，而對頭孢他啶、阿米卡星全部敏感。耐藥基因PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果表明，6株菌均攜帶CMY-2，檢出率為28.6%。接合試驗表明，1株奇異變形桿菌C12接合成功并獲得接合子，其余5株接合不成功。PFGE分型結(jié)果表明，酶切圖譜分為3個型別，CMY-2在禽源變形桿菌中存在垂直和水平傳播。測序結(jié)果表明菌株C12含有一個1b型IncC質(zhì)粒，其全長161 319 bp，GC含量為52.45%，預(yù)測有161個開放閱讀框，提交NCBI并獲得序列號MT320534。該質(zhì)粒包含3個耐藥區(qū)：第一個抗生素耐藥區(qū)（antibiotic resistance islands，ARI-B）攜帶、(A)、、和；第二個耐藥區(qū)是一個典型的IS-CMY-2--結(jié)構(gòu)，其中的IS被一個插入的IS截斷；第三個耐藥區(qū)（ARI-A）是一個雜合的Tn-pDU轉(zhuǎn)座子，包含一個1類整合子基因盒（|||）和汞抗性基因簇，其插入到質(zhì)粒骨架產(chǎn)生兩個重復(fù)序列TTGTA，該耐藥區(qū)也是1型IncC耐藥區(qū)變化最大的區(qū)域。6株產(chǎn)AmpC酶禽源奇異變形桿菌均攜帶CMY-2，其酶切圖譜分為3個PFGE型別，其中一株菌攜帶了一個流行的CMY-2陽性1型IncC可接合質(zhì)粒。廣宿主的IncC質(zhì)粒是CMY-2、(A)、等多個耐藥基因及整合子的重要載體之一，該質(zhì)粒在動物源奇異變形桿菌的傳播擴(kuò)散進(jìn)一步增加了治療該菌感染的難度，應(yīng)引起足夠的重視。

奇異變形桿菌；IncC質(zhì)粒；AmpC β-內(nèi)酰胺酶；CMY-2；Tn轉(zhuǎn)座子

0 引言

【研究意義】奇異變形桿菌（）是一種條件性致病菌，是引起人尿路、傷口、血液等感染的重要病原之一[1-2]。獸醫(yī)臨床中，奇異變形桿菌可以感染雞、獼猴、狐貍、水貂、大熊貓、斷奶仔豬等多種動物[3]。近幾年，動物感染奇異變形桿菌的病例屢見報道，但有關(guān)奇異變形桿菌的流行調(diào)查比較少。近幾年，楊睿等[4]對腹瀉仔豬、王道寧等[5]對腹瀉犬、路佳琦等[6]對某鴿場、袁東芳[7]對健康肉雞進(jìn)行了奇異變形桿菌的流行性調(diào)查，分離率在10%—30%。β-內(nèi)酰胺酶是腸桿菌科細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制，AmpC酶屬于β-內(nèi)酰胺酶的一個重要分支。目前，人源奇異變形桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率明顯升高[8-9]，但有關(guān)產(chǎn)AmpC酶動物源奇異變形桿菌的研究比較少。因此，本試驗對禽源奇異變形桿菌進(jìn)行AmpC酶檢測與質(zhì)粒分析，對掌握AmpC酶基因在該菌中的傳播規(guī)律具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根據(jù)Bush-Jacoby-Medeiros的分類方法，AmpC β-內(nèi)酰胺酶屬第一組，是一類不被克拉維酸和乙二胺四乙酸抑制的頭孢菌素酶，按分子結(jié)構(gòu)類型屬于C類，也稱為AmpC酶[10]。按的來源分為染色體編碼的AmpC酶和質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶。對于染色體介導(dǎo)AmpC酶來說，是該酶的結(jié)構(gòu)基因，另外是幾個不連鎖的調(diào)節(jié)基因、、、等，可被β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)，主要見于陰溝腸桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、鮑曼不動桿菌、粘質(zhì)沙雷菌及銅綠假單胞菌[11-12]。奇異變形桿菌染色體雖也能編碼AmpC酶，但主要是位于整合接合元件（integrating conjugative elements，ICEs）上，能進(jìn)一步在大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌中轉(zhuǎn)移[2,13]。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶主要出現(xiàn)在肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、沙門菌及奇異變形桿菌，這些菌株無論有無β-內(nèi)酰胺類抗生素存在均能持續(xù)高水平產(chǎn)AmpC酶。攜帶的質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合方式在同種屬和不同種屬菌之間傳播，這是快速傳播的一個重要途徑[11]。質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶已在世界范圍內(nèi)流行，CMY-2是其最流行的酶型[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】奇異變形桿菌是一種常見的條件性致病菌。目前，有關(guān)禽源奇異變形桿菌產(chǎn)AmpC酶的研究比較少。前期研究中，對臨床分離的21株禽源奇異變形桿菌已完成了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測和CTX-M基因的上下游環(huán)境研究[3]，但有關(guān)AmpC酶的檢測、基因亞型、質(zhì)粒特征還未深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對臨床分離的21株禽源奇異變形桿菌進(jìn)行AmpC β-內(nèi)酰胺酶和耐藥基因檢測，利用接合試驗和脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）技術(shù)研究CMY-2在奇異變形桿菌中垂直和水平傳播規(guī)律，利用高通量測序技術(shù)獲得接合質(zhì)粒的全序列，解析攜帶CMY-2質(zhì)粒的分子特征，為防控多重耐藥禽源奇異變形桿菌的傳播提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本研究于2017至2020年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院完成。

1.1 菌株材料

1.1.1 菌株 2009年5—10月，從河北、山東、河南、四川、江西、浙江等8省12個地區(qū)收集的43例病死肉雞、蛋雞、鵪鶉肝臟中分離，并經(jīng)實驗室VITEK-32全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的21株奇異變形桿菌，其中10株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended- spectrum β-lactamases，ESBLs），檢出率為47.6%[3]。沙門菌H9812用于PFGE的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，為實驗室保存菌株。耐利福平大腸桿菌C600作為接合試驗的受體菌，由河南省人民醫(yī)院惠贈。大腸埃希菌（ATCC 25922），購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、MH瓊脂、MH肉湯、營養(yǎng)肉湯均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；質(zhì)粒中量提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；Marker 2000、Premix EX Taq購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 藥品 氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、黏菌素，均為國產(chǎn)原料藥，使用時均在有效期內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 頭孢西丁三維試驗 通過三維試驗檢測21株奇異變形桿菌分離菌是否產(chǎn)生AmpC酶[14]。具體步驟如下：將0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊拇竽c桿菌ATCC 25922 按臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的K-B 法均勻涂布在M-H 平板上，在平板的中央貼一張頭孢西?。?0 mg/片）紙片，從距離紙片5 mm處用無菌刀片在平板瓊脂上向外緣方向切一裂隙，在裂隙中加入25 μL 的一種待檢菌株的β-內(nèi)酰胺酶粗提物，35℃培養(yǎng)24 h，觀察裂隙的內(nèi)側(cè)端（頭孢西丁紙片的抑菌環(huán)內(nèi)）周圍有無細(xì)菌生長。結(jié)果判斷：頭孢西丁紙片的抑菌環(huán)有缺失者為陽性，提示待檢菌株產(chǎn)AmpC酶。

1.2.2 MIC值的測定 采用肉湯微量稀釋法，測定受試菌株的最小抑菌濃度（MIC），相同過程重復(fù)3次，其結(jié)果根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥和敏感的判斷[15]。

1.2.3 耐藥基因檢測 依據(jù)文獻(xiàn)[16]，由上海生工生物工程公司合成6對通用引物。利用水煮法制備細(xì)菌DNA模板，對ampC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，最后由凝膠成像系統(tǒng)攝像。將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，對疑似CMY-2利用CMY-2-F/R進(jìn)行擴(kuò)增、測序，確定其基因亞型（表1）。

1.2.4 接合試驗 以耐頭孢西丁奇異變形桿菌為供體菌，耐利福平大腸桿菌C600為受體菌進(jìn)行接合試驗。先把供體菌、受體菌分別接種到5 mL的LB肉湯中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜。然后取供體菌0.1 mL、受體菌1 mL接種到5 mL LB肉湯中混勻，37℃低速振蕩培養(yǎng)4 h。將混合培養(yǎng)后的菌液涂布在含藥的麥康凱瓊脂平板（利福平500 μg·mL-1，頭孢西丁20 μg·mL-1），于37℃培養(yǎng)18 h，篩選陽性接合子。通過PCR和藥物敏感性試驗測定接合子的耐藥基因和最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.5 PFGE分型 利用PFGE技術(shù)對耐頭孢西丁的奇異變形桿菌進(jìn)行分型[17]。先將耐頭孢西丁奇異變形桿菌和沙門菌H9812復(fù)蘇、單菌落37℃過夜培養(yǎng)，然后制備含菌膠塊、利用蛋白酶K進(jìn)行菌體裂解、膠塊洗滌、再利用I酶切奇異變形桿菌、用I酶切沙門菌H9812，最后凝膠電泳、成像。CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的電泳參數(shù)設(shè)置為：片段大小為10—1 000 kb，電壓6 V，角度120°，脈沖時間2.2—64 s，電泳時間18 h。

1.2.6 質(zhì)粒測序與序列分析 利用Qiagen質(zhì)粒中提試劑盒對獲得的陽性接合子進(jìn)行DNA提取，然后送天津生物芯片技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。用NovaSeq 6000系統(tǒng)進(jìn)行二代測序，測序結(jié)果用SOAP denovo v2.04 軟件組裝，然后用二代組裝結(jié)果校正PacBio RSII三代測序結(jié)果，矯正后的三代測序結(jié)果用SMRT v2.3.0軟件進(jìn)行組裝，最終獲得質(zhì)粒的完整序列[18]。質(zhì)粒的全序列先用RAST v2.0服務(wù)器（http:// rast.nmpdr.org）進(jìn)行注釋，然后利用BLASTn和BLASTp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）比對矯正，利用CGE服務(wù)器（https://cge.cbs.dtu.dk/services/）對質(zhì)粒的復(fù)制子類型和耐藥基因進(jìn)行鑒定，利用ISFINDER服務(wù)器（https://isfinder.biotoul.fr/）對轉(zhuǎn)座子和插入序列元件進(jìn)行鑒定，最后利用Easyfig軟件對質(zhì)粒進(jìn)行比較分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 AmpC酶與基因亞型檢測

三維試驗結(jié)果顯示，6株奇異變形桿菌的頭孢西丁紙片的抑菌環(huán)有缺失，即這些菌株產(chǎn)AmpC酶。PCR擴(kuò)增和測序表明，6株耐頭孢西丁的奇異變形桿菌均攜帶CMY-2耐藥基因，陽性率為28.6%（6/21）。

2.2 接合試驗

6株CMY-2陽性奇異變形桿菌中，只有菌株C12攜帶的CMY-2發(fā)生了接合轉(zhuǎn)移，獲得的相應(yīng)接合子命名為TC12，其余5株接合不成功。藥敏試驗和PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，接合子TC12攜帶CMY-2，具有頭孢西丁耐藥表型（MIC=32 μg·mL-1），說明CMY-2位于一個可接合型質(zhì)粒上，該質(zhì)?？蓮钠娈愖冃螚U菌轉(zhuǎn)移到大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗

6株CMY-2陽性禽源奇異變形桿菌及接合子TC12對12種受試藥物敏感性檢測結(jié)果見表2。由表2可以看出，6株奇異變形桿菌對氨芐西林、頭孢西丁、多西環(huán)素、氟苯尼考、粘菌素全部耐藥；對頭孢他啶、阿米卡星全部敏感；但有兩株對頭孢噻肟耐藥，3株中介，1株敏感；有5株對環(huán)丙沙星、卡那霉素耐藥，1株敏感。接合子TC12與原菌C12一樣呈現(xiàn)出對氨芐西林、頭孢西丁、多西環(huán)素、氟苯尼考、卡那霉素、慶大霉素耐藥。

2.4 PFGE分型

對上述檢測到的6株CMY-2陽性奇異變形桿菌進(jìn)行PFGE分型，根據(jù)菌株同源性判別標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為3種PFGE型別，記為A—C，其中CY12、CY32和C12屬于A型，S31和S52屬于B型，WS2屬于C型。CY12和CY32，S31和S52分別是分離自同一個養(yǎng)殖場的奇異變形桿菌菌株，這說明在一個養(yǎng)殖場里存在同一克隆菌株，耐藥基因CMY-2存在垂直傳播，如圖1。

2.5 質(zhì)粒的分子特征

為進(jìn)一步研究接合菌TC21攜帶的CMY-2陽性質(zhì)粒的分子特征，利用全基因組測序技術(shù)對提取的質(zhì)粒進(jìn)行全序列測定。序列分析表明該接合菌含有一個廣宿主的1b型IncC質(zhì)粒，命名為pC12，其全長161 319 bp，GC含量為52.45%，預(yù)測有161個開放閱讀框，提交NCBI并獲得序列號MT320534。進(jìn)一步序列分析表明，該質(zhì)粒包含了基本的骨架區(qū)和3個耐藥區(qū)。骨架區(qū)包含負(fù)責(zé)質(zhì)粒復(fù)制、接合和穩(wěn)定的功能基因。3個耐藥區(qū)分散在質(zhì)粒骨架區(qū)中：第一個耐藥區(qū)ARI-B（antibiotic resistance islands，ARI-B）攜帶、(A)、、、；第二個耐藥區(qū)是一個典型的IS-CMY-2--結(jié)構(gòu)，其中的IS被插入的IS截斷；第三個耐藥區(qū)ARI-A包含一個1類整合子基因盒（|||）和汞抗性基因簇，其插入到質(zhì)粒骨架區(qū)產(chǎn)生兩個重復(fù)序列TTGTA（圖2）。ARI-A是一個Tn-pDU雜合型轉(zhuǎn)座子，與Tn的（序列號，U12338）序列相似性達(dá)100%，汞抗性基因簇與質(zhì)粒pDU1358的汞抗性基因簇相似度達(dá)99.6%。ARI-A兩端的38 bp末端反向重復(fù)序列（IR和IR）分別由IS和IS插入而被截斷，如圖2。

3 討論

3.1 奇異變形桿菌的流行特征

奇異變形桿菌是動物源常見細(xì)菌之一。2019年楊睿等[4]從107份腹瀉仔豬肛門拭子樣本中分離出15株奇異變形桿菌，分離率為14.02%。2020年王道寧等[5]從62份犬腹瀉糞便中分離得到12株奇異變形桿菌，分離率為19.35%。同年，路佳琦等[6]從某鴿場采集72份樣品，分離獲得22株奇異變形桿菌，分離率為30.6%；袁東芳[7]從肉雞場采集健康雞泄殖腔肛拭子516份，鑒定出61株奇異變形桿菌，分離率為11.8%。本研究從臨床43份病死雞中分離獲得21株禽源奇異變形桿菌，分離率達(dá)48.84%。這些研究表明動物源奇異變形桿菌已成為養(yǎng)殖中常見的條件性致病菌，特別是在疾病狀態(tài)下分離率更高。目前，人源奇異變形桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率明顯升高[8-9]。在一項連續(xù)10年（2001—2010年）監(jiān)測人源奇異變形桿菌耐藥性變遷的研究中，2008、2009、2010年產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株分別占45.63%、56.98%、37.2%[9]。另一項人源奇異變形桿菌β-內(nèi)酰胺酶檢測及耐藥性分析研究顯示，302株分離菌中有60株只產(chǎn)ESBLs，檢出率為19.87%；40株只產(chǎn)AmpC，檢出率為13.25%；36株同時產(chǎn)ESBLs及AmpC，檢出率為11.92%[8]。2015年馮福英等[19]從20株人源奇異變形桿菌中檢測到10株攜帶CMY-2，陽性率達(dá)50%。2016年中國學(xué)者LEI等[13]在125株動物源奇異變形桿菌中檢測到16株攜帶CMY-2，陽性率為12.8%。2019年楊睿等[4]在分離的15株豬源奇異變形桿菌中檢測到12株攜帶CMY-2，陽性率高達(dá)80%。在本課題組的前期研究[3]中，從21株禽源奇異變形桿菌中檢測到10株攜帶CTX-M，檢出率為47.6%，其中6株攜帶CTX-M-14，4株攜帶CTX-M-65。本試驗進(jìn)一步從21株菌中檢測到6株單產(chǎn)AmpC酶，均攜帶CMY-2，陽性率為28.6%（6/21）。雖然本試驗分離的禽源奇異變形桿菌數(shù)量有限，但一定程度上也反映出該菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率比較高。接合試驗顯示，6株耐頭孢西丁奇異變形桿菌中只有1株接合成功，并獲得了一株攜帶CMY-2陽性IncC型質(zhì)粒的接合子，另外5株接合失敗。CMY-2陽性菌株的酶切圖譜分為3個PFGE型別。本次試驗結(jié)果表明，CMY-2在禽源奇異變形桿菌中檢出率比較高，CMY-2在該菌中存在垂直和水平傳播。

奇異變形桿菌質(zhì)粒pC12 （MT320534），大腸桿菌質(zhì)粒pAR060302 （FJ621588）和pUMNK88 （HQ023862），沙門氏菌質(zhì)粒pSN254 （CP000604），pCVM22425 （CP009560）和pSD_174 （JF267651），肺炎克雷伯氏菌質(zhì)粒IncA/C-LS6（JX442976）

3.2 blaCMY-2在奇異變形桿菌的傳播方式

AmpC β-內(nèi)酰胺酶可以由染色體介導(dǎo)，也可以由質(zhì)粒介導(dǎo)。一般認(rèn)為介導(dǎo)AmpC酶的基因起源于弗勞地枸櫞酸桿菌的染色體，從染色體轉(zhuǎn)座到質(zhì)粒，再接合轉(zhuǎn)移到肺炎克雷伯菌和大腸桿菌[20-22]。攜帶基因的質(zhì)粒通過接合方式可以在不同細(xì)菌之間傳遞，這種方式是基因快速傳播的一個重要途徑[11]。CMY-2是基因的一種，與另外的基因BIL-1和LAT-2實際是同一個基因，與大多數(shù)的CMY和LAT一樣都來自于弗勞地枸櫞酸桿菌的[20]。CMY-2是腸桿菌科細(xì)菌攜帶中最流行的一種[23-24]。有研究顯示，117株人源AmpC陽性的腸桿菌科細(xì)菌中有78株攜帶CMY-2（66.7%），包括19株CMY-2陽性奇異變形桿菌，其中7株奇異變形桿菌基因組中含有攜帶CMY-2的ICEs（3株可發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，4株不接合），8株奇異變形桿菌攜帶CMY-2陽性IncC質(zhì)粒[2,24]。ABERKANE等[25]報道顯示，分離自法國的64株禽源和7株人源AmpC陽性奇異變形桿菌攜帶的全部是CMY-2，其中67株奇異變形桿菌中的CMY-2位于ICEs上，另外4株的CMY-2位于接合性IncC質(zhì)粒上。在中國，16株攜帶CMY-2的動物源奇異變形桿菌中檢測到8株攜帶CMY-2的ICEs[13]。這些研究表明，SXT/R391型ICEs是CMY-2基因在奇異變形桿菌中傳播的一種重要方式。本試驗中5株CMY-2奇異變形桿菌接合失敗，這些CMY-2的定位有待進(jìn)一步研究。

3.3 blaCMY-2陽性IncC質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征

早期一些研究常把質(zhì)粒IncA和IncC命名為IncA/C，但實際上IncA和IncC質(zhì)粒的骨架區(qū)有著顯著的序列差異[26-27]。IncC型質(zhì)粒屬廣宿主不相容群，在大腸桿菌、沙門菌、奇異變形桿菌等腸桿菌科細(xì)菌中分布廣泛[23-24]。近年來，作為多重耐藥質(zhì)粒類型之一的IncC型質(zhì)粒，由于常攜帶AmpC酶基因CMY和金屬β-內(nèi)酰胺酶基因NDM而備受關(guān)注[28-30]。IncC型質(zhì)粒可分為1型和2型，目前也有1/2雜合型IncC質(zhì)粒的報道[26,31]。根據(jù)1型IncC質(zhì)粒與基因之間序列的單核苷酸多態(tài)性（SNP），該型質(zhì)粒又進(jìn)一步劃分為1a和1b亞型[32]。ARI-B耐藥區(qū)在1型和2型IncC質(zhì)粒均有出現(xiàn)，但ARI-A和IS-CMY-2僅出現(xiàn)在1型IncC質(zhì)粒中。1型IncC質(zhì)粒是最流行的一種亞型，包含質(zhì)粒骨架區(qū)和耐藥區(qū)，其中質(zhì)粒骨架區(qū)負(fù)責(zé)復(fù)制、接合、穩(wěn)定等相關(guān)功能，3個耐藥區(qū)分散在質(zhì)粒骨架中，包括ARI-B、IS-CMY和ARI-A[26,30]。第一個耐藥區(qū)ARI-B由一個常見的IS--(A)---結(jié)構(gòu)組成。ARI-B被認(rèn)為來源于一個15 kb的基因島（genomic island GI）。整合入IncC骨架區(qū)的GI的右端被保留，中間片段被-(A)--耐藥區(qū)取代，左端丟失，由于IS介導(dǎo)的插入或缺失導(dǎo)致產(chǎn)生不同大小的ARI-B[26]。第二個耐藥區(qū)IS-CMY-2--是一個典型的結(jié)構(gòu)，IS對CMY-2從弗勞地枸櫞酸桿菌染色體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒和表達(dá)發(fā)揮了重要作用。IS可以是完整的，也可以被其他插入序列元件IS，IS，IS等截短[12,33]，部分IncC質(zhì)粒在這個區(qū)域有兩個拷貝的CMY-2，如pSN254、pCVM22425、pSD_174（圖2）。第三個耐藥區(qū)ARI-A由一個復(fù)合轉(zhuǎn)座子構(gòu)成。在pC12和其他IncC質(zhì)粒pAR060302、pSN254、pCVM22425、pSD_174、pUMNK88和IncA/C-LS6中，ARI-A均由一個雜合的Tn-pDU轉(zhuǎn)座子組成，并插入到質(zhì)粒骨架區(qū)產(chǎn)生兩個重復(fù)序列TTGTA（圖2）。ARI-A是多重耐藥IncC質(zhì)粒進(jìn)化的主要耐藥區(qū)，主要包含I型整合子盒，汞抗性基因簇以及與IS相關(guān)的耐藥模塊。整合子是耐藥基因的主要載體之一，可以攜帶多個不同耐藥基因，進(jìn)一步整合到IncC質(zhì)粒的ARI-A耐藥區(qū)，能夠使質(zhì)粒成為一個多重耐藥基因散播的更大載體，加速耐藥基因的擴(kuò)散。馮福英等[19]從20株人源奇異變形桿菌中檢測到10株攜帶CMY-2，陽性率達(dá)50%，19株攜帶I型整合子，陽性率達(dá)95%。楊睿等[4]對15株豬源奇異變形桿菌的分離鑒定與耐藥基因分析中發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素、磺胺類抗生素、四環(huán)素類抗生素、氨基糖苷類抗生素和氯霉素類抗生素的耐藥性主要是由CMY-2、、(A)、和耐藥基因所導(dǎo)致，特別是CMY-2陽性率高達(dá)80%。本試驗對一株禽源奇異變形桿菌攜帶的1型IncC質(zhì)粒的全序列分析結(jié)果表明，IncC質(zhì)粒是CMY-2、(A)、等多個耐藥基因及整合子的重要載體之一，該質(zhì)粒在動物源奇異變形桿菌的傳播擴(kuò)散進(jìn)一步增加了治療該菌感染的難度，應(yīng)引起足夠的重視。

4 結(jié)論

本研究中，21株禽源奇異變形桿菌中有6株產(chǎn)AmpC β-內(nèi)酰胺酶且均攜帶CMY-2，檢出率為28.6%。6株CMY-2陽性菌株中有5株菌的CMY-2不發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，1株菌的CMY-2可以通過接合而發(fā)生水平傳遞。PFGE分型顯示有3種型，CMY-2在同一場區(qū)中有垂直傳播現(xiàn)象。序列分析表明，接合菌包含一個1b型IncC多重耐藥質(zhì)粒。該質(zhì)粒攜帶了、(A)、、、、CMY-2和一個雜合的Tn-pDU轉(zhuǎn)座子，其中轉(zhuǎn)座子又?jǐn)y帶了一個包含、、、、的1型整合子盒。應(yīng)該注意的是，雖然頭孢西丁在獸醫(yī)臨床應(yīng)用很少，但在其他藥物的選擇壓力下，動物源奇異變形桿菌中攜帶CMY-2的多重耐藥IncC質(zhì)粒會通過和其他基因的共轉(zhuǎn)移而得到傳播和擴(kuò)散。

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Analysis of Plasmid-Mediated AmpC β-lactamases Gene and Plasmid in PoultryStrains

1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002

【】 The aim of this study was to probe the genotype of AmpC β-lactamases gene and the complete nucleotide sequence of the conjugative plasmid carryingCMY-2 in poultry P. mirabilis strains, so as to provide a theoretical basis for the prevent spreading ofmultidrug-resistant poultrystrains. 【】 Twenty-onestrains were characterized for the confirmation of AmpC β-lactamases genes by using three-dimensional test, polymerase chain reaction (PCR) amplification and sequencing. TheCMY-2-carryingstrains were further evaluated using pulse field gel electrophoresis (PFGE) and conjugation experiments. The complete nucleotide sequence of conjugative plasmid pC12 was determined by using high-throughput sequencing platform and compared with closely related plasmids. 【】 Six of twenty-onestrains produced AmpC enzymes, all of which carried theCMY-2gene and the detection rate was 28.6%. Antimicrobial susceptibility testing showed that sixstrains exhibited high resistance to ampicillin, cefoxitin,doxycycline, florfenicol and colistin, but were susceptible to ceftazidime and amikacin. Conjugation assay revealed theCMY-2gene was successfully transferred fromC12 toC600 recipient strain, however, conjugation experiments failed to obtain transconjugants for otherCMY-2-bearing strains, despite repeated attempts. Three PFGE patterns of sixstrains were determined. The findings demonstrated the vertical and horizontal dissemination ofCMY-2gene in poultryisolates. Sequence analysis revealed theC12 harbored a conjugative plasmid, designated as pC12. pC12 was found to be a multi-drug resistant type 1b IncC plasmid with 161 319-bp size and an average GC content of 52.45%, and had at least 161 predicted open reading frames. The complete sequence of pC12 has been submitted to GenBank with the accession number MT320534. The pC12 harbored three antibiotic resistance regions: the first region, antibiotic resistance island ARI-B, carried,(A),,, andgenes; the second region, IS-CMY-2--, was a typical structure, and the ISEwas truncated by IS; the third region, ARI-A, was a hybrid Tn-pDUmodule. The ARI-A contained a-containing class 1 integron with cassette array(),and a mercury resistance cluster, and inserted into the plasmid backbone generating 5-bp direct repeats (TTGTA). 【】All the AmpC-producingstrains carried theCMY-2gene, and one of them harbored an epidemic type 1 IncC conjugative plasmid. Three PFGE patterns were identified. The findings demonstrated the vertical and horizontal dissemination ofCMY-2gene in poultryisolates. IncC plasmid was one of the predominant vehicles for the dissemination of multiple resistance genes, such asCMY-2,(A),or class 1 integron cassette, which further increased the difficulty for the treatment of the infection caused by. More attention should be paid on the epidemiology of IncC plasmid in pathogenic bacteria.

; IncC plasmid; AmpC β-lactamases;CMY-2; Tntransposon

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.018

2020-08-28；

2021-01-25

國家自然科學(xué)基金-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金（U1504326）、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科教學(xué)實驗室開放創(chuàng)新訓(xùn)練項目

趙世玉，E-mail：zsmzhao@163.com。通信作者潘玉善，E-mail：pylearn21@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）