海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼品質(zhì)的變化特征

馬玲玲，馮嘉，王晶，齊廣海，馬友彪，武書庚，張海軍，邱凱

海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼品質(zhì)的變化特征

馬玲玲，馮嘉，王晶，齊廣海，馬友彪，武書庚，張海軍，邱凱

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物產(chǎn)品質(zhì)量安全飼料源性因子風險評估實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081

【】通過觀察海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期（31—80周齡）雞蛋表觀指標、物理屬性和力學特性的變化規(guī)律，探究產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降的關鍵時期及蛋殼結(jié)構與組成的變化，為產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)的調(diào)控提供參考和依據(jù)。以84只30周齡健康的海蘭褐蛋雞為研究對象，隨機分為7個重復，每重復12只雞。試驗期飼喂玉米-豆粕型基礎日糧，自由采食、飲水，飼養(yǎng)50周。分別于31、36、41、46、50、55、60、65、70、75和80周齡時，每重復每天采集3枚雞蛋，連續(xù)采集3d。所有雞蛋樣品均檢測表觀指標、物理屬性和力學特性。選擇31、41、50、60、70和80周齡組蛋殼，使用掃描電子顯微鏡觀察蛋殼橫截面和內(nèi)表面的超微結(jié)構、X-射線衍射分析儀檢測蛋殼晶體結(jié)構，灼燒法檢測蛋殼有機物含量，考馬斯亮藍法檢測蛋殼總蛋白含量，電感耦合等離子體發(fā)射光譜法檢測蛋殼鈣和磷含量。（1）31—80周齡蛋重、長徑和蛋殼面積線性增加（＜0.01）；蛋殼重、蛋殼比例、蛋殼厚度和蛋殼指數(shù)隨蛋雞周齡先增加后降低（＜0.05）；50周齡后蛋殼強度和蛋殼韌性較31周齡顯著降低，65—80周齡各周齡均顯著低于之前各采樣時間點（＜0.05）。（2）蛋殼品質(zhì)主成分載荷分析中，在第一主成分（PC1）中，蛋殼強度、蛋殼比例、蛋殼韌性和蛋殼指數(shù)的載荷值高，而第二主成分（PC2）中，蛋殼重、蛋殼厚度和蛋殼面積的載荷值高；根據(jù)產(chǎn)蛋期蛋殼物理屬性和力學特性變化，可劃分為31—50和55—80周齡2個階段，后者還可劃分為55—60周齡和65—80周齡2個階段。（3）70和80周齡蛋殼乳突厚度和比例顯著低于31—60周齡各組（＜0.05）；乳突密度顯著低于31周齡組蛋殼（＜0.05）。（4）隨蛋雞周齡增加，蛋殼晶體大小無顯著變化（＞0.05）。（5）蛋殼有機物和總蛋白含量、單位蛋殼面積含量和每枚蛋殼含量均無顯著變化；每枚蛋殼鈣含量無顯著變化（＞0.05）；70和80周齡單位蛋殼面積鈣含量顯著降低（＜0.05）；60、70和80周齡蛋殼磷百分含量顯著低于之前各周齡組（＜0.05），而每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量顯著低于31周齡組（＜0.05）。（6）蛋殼力學特性與鈣化層厚度、有效層厚度、乳突密度、有效層比例、單位蛋殼面積鈣含量、磷百分含量、每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量均顯著正相關（＜0.05），與乳突比例顯著負相關（＜0.05）。根據(jù)蛋殼物理屬性和力學特性變化，海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋期可劃分為31—50周齡和55—80周齡2個階段，65周齡后蛋殼力學特性下降尤為明顯；超微結(jié)構層厚度和比例的變化可能導致了產(chǎn)蛋期蛋殼力學特性的下降；60—80周齡蛋殼力學特性降低可能與蛋殼磷含量下降有關，乳突層結(jié)構異常和蛋殼面積增大導致的單位蛋殼面積鈣含量下降加劇了70—80周齡蛋殼力學特性的下降。

產(chǎn)蛋期；蛋殼品質(zhì)；力學特性；超微結(jié)構；化學組成

0 引言

【研究意義】蛋殼是蛋雞蛋殼腺中形成的一種保障其繁衍子代的堅硬材料，具有抵抗外力使雞蛋內(nèi)容物免受污染和侵害的功能，為雞胚發(fā)育提供保護、氣體交換和礦物質(zhì)元素；同時，蛋殼也是運輸、銷售、購買雞蛋過程中的天然包裝，保障了雞蛋的完整性。蛋殼品質(zhì)是蛋雞生產(chǎn)中重要的經(jīng)濟性狀指標，其品質(zhì)降低導致的蛋殼破損問題給家禽生產(chǎn)業(yè)和雞蛋加工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降尤為嚴重，現(xiàn)代機械集蛋系統(tǒng)的使用更是大大增加了雞蛋的破損率，比人工撿蛋提高了1.5%—2%[1]。因此，提高蛋殼品質(zhì)，尤其是提高蛋雞產(chǎn)蛋后期的蛋殼品質(zhì)對于蛋雞養(yǎng)殖過程中，高效生產(chǎn)安全、優(yōu)質(zhì)雞蛋更加重要?！厩叭搜芯窟M展】產(chǎn)蛋后期一直是蛋殼品質(zhì)調(diào)控研究的熱點和難點。產(chǎn)蛋期蛋殼品質(zhì)周齡性變化的研究多集中于對比兩個或多個周齡階段，缺乏對同一品系蛋雞長期、連續(xù)的研究。此外，調(diào)控研究中在試驗雞只周齡選擇或試驗雞周齡區(qū)間選取方面存在較大差異，多集中于40—55周齡[2-5]、60—70周齡[6-8]和70—80周齡[9-10]，對調(diào)控產(chǎn)蛋雞蛋殼品質(zhì)，缺乏選擇蛋雞合適周齡的數(shù)據(jù)參考。了解產(chǎn)蛋期蛋殼品質(zhì)、蛋殼結(jié)構與組成的周齡性變化有助于選擇合適的時間點和更精確的靶向調(diào)控手段。蛋殼品質(zhì)的表觀指標和力學特性與蛋雞產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益息息相關，受其物理屬性、組成和結(jié)構的影響。前期研究表明，蛋重、長徑和蛋形指數(shù)（長徑與短徑之比）隨蛋雞周齡增加[11-12]，蛋殼強度降低[12]是常見的周齡性變化；關于短徑和蛋殼厚度[12-13]的報道不一。普遍認為蛋殼力學特性周齡性降低的直接原因可能是蛋殼重和蛋殼比例與蛋重變化速度不一致[14]。但對蛋殼組成和結(jié)構的周齡性變化的研究較少，僅有少數(shù)研究表明，60和78周齡蛋殼鈣含量較30周齡顯著降低，蛋殼磷含量未發(fā)生改變[13]。對蛋殼結(jié)構的研究表明，蛋殼超微結(jié)構異常可能是蛋殼力學特性周齡性降低的間接原因，如：乳突厚度增加[15]、乳突密度降低[13]和乳突間隙增大，柵欄層致密性降低和異常乳突體[15]（B型乳突體和A型乳突體）的出現(xiàn)也可能是原因之一?！颈狙芯壳腥朦c】關于蛋殼品質(zhì)周齡性變化的報道，缺乏長期連續(xù)性的研究，且未闡明導致產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降的具體問題?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過觀察海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼品質(zhì)變化規(guī)律，探究產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降的關鍵時期及蛋殼結(jié)構和組成的變化，為產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)的調(diào)控研究提供基礎數(shù)據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

養(yǎng)殖試驗于2018年10月6日至2019年9月22日在本課題組蛋雞試驗基地進行，樣品測定在中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所進行。

1.2 試驗設計和樣品采集

試驗采用單因素試驗設計，選取30周齡健康、體重相近的海蘭褐蛋雞84只，隨機分成7個重復，每重復12只。根據(jù)NRC（1994）、中國蛋雞飼養(yǎng)標準（NY/T 33-2004）和海蘭褐殼蛋雞飼養(yǎng)手冊（2018），配置玉米-豆粕型基礎日糧（鈣：0.36%，總磷：0.54%，均為實測值）。試驗雞自由采食、飲水充足。分別于蛋雞31、36、41、46、50、55、60、65、70、75和80周齡時，每重復每天采集3枚接近平均蛋重的雞蛋，連續(xù)采集3d。蛋樣無明顯缺陷，如破殼、軟殼、畸形等，盡量保證取樣代表性。本試驗包括11個采樣時間點，每個采樣時間點采集63枚，共采集693枚雞蛋樣品。所有雞蛋樣品均測定表觀指標、物理屬性和力學特性。分別于31、41、50、60、70和80周齡，每重復隨機選取6枚蛋殼，用于分析蛋殼超微結(jié)構、晶體結(jié)構和蛋殼組成。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 雞蛋表觀指標、蛋殼物理屬性和力學特性 雞蛋樣品采集當天，稱量蛋重；使用蛋形指數(shù)儀（FHK, 日本富士坪公司）測量雞蛋長徑和短徑，蛋殼厚度測定儀（Egg Shell Thickness Gauge，ESTG-1，Orka Food Ltd）測定鈍端、銳端和赤道3點蛋殼厚度，計算平均值；蛋殼強度測定儀（Force Reader，Orka Food Ltd）自動檢測蛋殼強度。雞蛋去除內(nèi)容物，室溫晾干，稱量蛋殼重。計算蛋形指數(shù)、蛋殼比例、蛋殼面積[12]、蛋殼韌性[16]和蛋殼指數(shù)。

蛋形指數(shù)=雞蛋長徑/短徑

蛋殼比例=（蛋殼重/蛋重）×100%

蛋殼面積=4.68×（蛋重）2/3

蛋殼韌性=Knd×（F/T3/2）

Knd=0.777×[2.388+(29.934×12/W]1/2

F=蛋殼強度（N）

T=蛋殼厚度

W=雞蛋寬度

蛋殼指數(shù)=蛋殼重/蛋殼面積

1.3.2 蛋殼超微結(jié)構 取赤道部碎片1 cm2，雙蒸水洗凈蛋殼內(nèi)外表面污漬，室溫晾干，蛋殼表面垂直固定在樣品臺上，噴金，抽真空，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8020，株式會社日立制作所，日本），180倍觀察蛋殼橫截面超微結(jié)構。測量有效層厚度（柵欄層、垂直晶體層和膠護膜）和乳突層厚度，計算乳突寬度。

乳突寬度=乳突總寬度/乳突數(shù)目

取赤道部碎片0.5 cm2，雙蒸水浸泡，去除內(nèi)殼膜。使用含6%次氯酸鈉、4.12%氯化鈉和0.15%氫氧化鈉溶液去除外殼膜[17]，雙蒸水洗凈，室溫晾干。蛋殼內(nèi)表面朝上，固定在樣品臺上，噴金，抽真空，使用掃描電鏡（SU8020，株式會社日立制作所，日本），150倍觀察蛋殼內(nèi)表面超微結(jié)構，500倍觀察B型乳突體。計算乳突密度。乳突密度為單位面積的乳突個數(shù)。

1.3.3 蛋殼晶體結(jié)構 取赤道部，雙蒸水洗凈蛋殼內(nèi)外表面，室溫晾干，粉碎，研磨。將蛋殼粉置于樣品臺上，壓平。使用強力轉(zhuǎn)靶全自動X射線衍射儀（D/MAX-2600pc，株式會社日立制作所，日本）檢測。衍射角度范圍為20°—80°。

1.3.4 蛋殼無機物和有機物含量 蛋殼用雙蒸水浸泡，去除殼膜，晾干，粉碎，過篩，稱取約1.0 g蛋殼粉末于坩堝中，110℃烘干5 h，稱重，馬弗爐灼燒12 h，放至室溫后稱重。計算有機物的百分含量，以及每枚蛋殼有機物含量和單位蛋殼面積有機物含量。

無機物百分含量=灰分重/烘干重×100%

有機物百分含量=100%-無機物含量

1.3.5 蛋殼總蛋白含量 每重復取250 mg蛋殼粉末分2次加入5 mL 20%醋酸，4℃持續(xù)震蕩過夜。萃取液加入超純水（1﹕1）凍干。凍干粉加入4.5 mL pH 5.8混合液包括：4 mol·L-1鹽酸胍、蛋白酶抑制劑（5 mmol·L-1苯甲脒鹽酸鹽、0.1 mol·L-1氨基己酸、0.1 mol·L-1苯甲基磺酰氟化物）、10 mmol·L-1EDTA、10 mmol·L-1醋酸鈉和0.5% Tween 20，4℃攪拌過夜。用0.3 mol·L-1氯化鈉、25 mmol·L-1乙酸鈉和0.1% Tween 20在透析袋內(nèi)進行透析，其間換水3—4次。透析后2 500×離心20 min，取上清液[18]。按照考馬斯亮藍法測定蛋殼中總蛋白含量，并計算單位蛋殼面積總蛋白含量。

1.3.6 蛋殼鈣、磷含量 蛋殼用溫熱蒸餾水擦洗干凈，烘干、粉碎，稱取1 g蛋殼于4 mL硝酸溶液中，110℃消化2 h，3 mL過氧化氫160℃消煮至溶液透亮。定容至100 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（7700，安捷倫科技有限公司，美國）測定蛋殼中鈣、磷含量，計算單位蛋殼面積鈣、磷含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件SAS 9.4檢驗方差齊性后，采用ANOVA程序進行方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較。結(jié)果用“平均值±標準差”表示，以＜0.05為差異顯著性標準，＜0.01為差異極顯著性標準。主成分分析和聚類分析采用R 軟件包（3.6.2）進行，結(jié)合載荷分析表，采用Ward法進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 雞蛋表觀指標的周齡性變化

周齡顯著影響海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期（31—80周齡）雞蛋表觀指標（表1，＜0.05）。隨蛋雞周齡增加，蛋重（線性效應，＜0.01）、長徑（線性效應，＜0.01）和蛋殼面積（線性效應，＜0.01）逐漸增加，蛋形指數(shù)并非隨周齡連續(xù)性變化而是呈臺階式增加，雞蛋短徑隨周齡無明顯變化規(guī)律。與31周齡雞蛋相比，36周齡蛋重、長徑和蛋殼面積等無顯著性變化，但從41周齡開始顯著增加（＜0.05），除75周齡外，36—80周齡各周齡雞蛋短徑均無顯著變化（＞0.05）。

2.2 蛋殼物理屬性和力學特性的周齡性變化

由表2可知，海蘭褐蛋雞31—80周齡，隨蛋雞周齡增加，蛋殼重、蛋殼比例、蛋殼指數(shù)和蛋殼厚度呈現(xiàn)先增加后降低的變化；除46和65周齡外，蛋殼強度和蛋殼韌性總體上隨周齡呈遞減變化。與31周齡蛋殼相比，41周齡蛋殼重、蛋殼比例和蛋殼指數(shù)顯著提高（＜0.05），46周齡蛋殼重、蛋殼指數(shù)和蛋殼厚度顯著增加（＜0.05），蛋殼厚度和蛋殼重分別在50和60周齡顯著增加（＜0.05）；而65周齡蛋殼比例與70周齡蛋殼比例和蛋殼厚度顯著低于31周齡（＜0.05）；其他各周齡蛋殼重、蛋殼指數(shù)較31周齡蛋殼未見顯著性下降（＞0.05）。蛋殼強度和韌性方面，31、36、41和46周齡蛋殼無顯著性變化，50周齡之后蛋殼較31周齡顯著降低（＜0.05），所有采樣點中80周齡最低。其中，65、70、75、80周齡蛋殼強度顯著低于50、55和60周齡（＜0.05）。

2.3 蛋殼品質(zhì)的主成分分析

根據(jù)特征值累積貢獻率大于85%的原則，選擇2個主成分，其特征值分別為4.51和1.64，方差貢獻率分別為64%和23%，累計貢獻率87%（表3）。在第一主成分（PC1）中，蛋殼強度、蛋殼比例、蛋殼韌性和蛋殼指數(shù)的載荷值高，在第二主成分（PC2）中，蛋殼重、蛋殼厚度和蛋殼面積的載荷值高。進一步，選取蛋殼強度、蛋殼比例、蛋殼韌性、蛋殼指數(shù)、蛋殼重、蛋殼厚度和蛋殼面積做聚類分析。如圖1所示，根據(jù)海蘭褐蛋雞蛋殼品質(zhì)的變化可將31—80周齡劃分為31—50周齡和55—80周齡2個階段，其中55—80周齡還可細分為55—60周齡和65—80周齡。

wk：周齡 wk: Weeks of age

表1 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期雞蛋表觀指標的變化

同行數(shù)據(jù)無字母或標相同字母表示差異不顯著(＞0.05)，不同字母表示差異顯著(＜0.05)。下同

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (＞0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (＜0.05) .The same as below

表2 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼物理屬性和力學特性的變化

表3 蛋殼品質(zhì)主成分載荷分析

2.4 蛋殼超微結(jié)構的周齡性變化

蛋殼橫截面超微結(jié)構如圖2所示。由表4可知，隨蛋雞周齡增加，蛋殼超微結(jié)構中乳突層厚度和比例逐漸增加，有效層厚度和比例逐漸降低，而鈣化層厚度、乳突寬度無顯著變化（＞0.05）。與31周齡相比，41、50和60周齡蛋殼乳突厚度和比例顯著增加（＜0.05），有效層厚度和比例顯著降低（＜0.05），但乳突密度無顯著變化（＞0.05）。70和80周齡蛋殼乳突厚度和比例最大，顯著高于之前各時間點（＜0.05），有效層厚度和比例最低，顯著低于之前各時間點（＜0.05）；乳突密度顯著低于31周齡蛋殼（＜0.05）。蛋殼內(nèi)表面超微結(jié)構如圖3所示，隨周齡增加，乳突排列越來越規(guī)則，但相鄰乳突之間縫隙增大；B型乳突體（圖4）在50周齡開始出現(xiàn)，隨周齡逐漸增加，尤其在70和80周齡數(shù)量較多。

wk：周齡；ML：乳突層；EL：有效層；電鏡尺子：300 μm；放大倍數(shù)：180×

2.5 蛋殼晶體結(jié)構的周齡性變化

由圖5可知，蛋殼粉末中主要為方解石晶體，蛋殼X衍射圖在23°、29°、32°、37°、39.5°、43°、48°、49°、57°、58°、61°和65°分別存在13個衍射峰，分別為（012）、（104）、（006）、（110）、（113）、（202）、（024）、（018）、（116）、（211）、（122）、（214）和（300）晶面。其中，（012）、（104）、（110）、（113）、（202）、（018）和（116）衍射峰尖銳，結(jié)晶純度高；產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼均在（104）晶面擇優(yōu)生長。由表5可知，各組晶粒大小無顯著差異（＞0.05）。

2.6 蛋殼化學組成的周齡性變化

隨蛋雞周齡，每枚雞蛋蛋殼鈣含量無顯著變化（＞0.05），但蛋殼鈣的百分含量和單位蛋殼面積鈣含量逐漸降低（表6）。與31周齡蛋雞蛋殼相比，41、50、60、70和80周齡蛋殼中鈣百分含量顯著降低（＜0.05），且41—80周齡各采樣點之間無顯著差異（＜0.05）；70和80周齡單位蛋殼面積鈣含量顯著降低（＜0.05）。此外，60、70和80周齡蛋殼磷百分含量較31、41和50周齡蛋殼顯著降低（＜0.05）；與31周齡相比，60、70和80周齡每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量顯著降低（＜0.05）。本試驗中，未觀察到31—80周齡海蘭褐蛋雞蛋殼有機物和總蛋白含量、單位蛋殼面積含量及每枚蛋殼含量的顯著性變化（＞0.05）。

wk：周齡；電鏡尺子：300 μm；放大倍數(shù)：150× wk: Weeks of age; Scale bar: 300 μm; Magnification: 150×

wk：周齡；電鏡尺子：100 μm；放大倍數(shù)：500× wk: Weeks of age; Scale bar: 100 μm; Magnification: 500×

表4 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼超微結(jié)構的變化

wk：周齡 wk: weeks of age

表5 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼晶粒大小及變異系數(shù)

2.7 蛋殼力學特性與超微結(jié)構和化學組成的相關性分析

由表7可知，蛋殼強度與有效層厚度、鈣化層厚度、乳突密度、磷百分含量、每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量極顯著正相關（＜0.01），與有效層比例和單位蛋殼面積鈣含量顯著正相關（＜0.05），與乳突比例極顯著負相關（＜0.01）；蛋殼韌性與有效層厚度、乳突密度、單位蛋殼面積鈣含量、磷百分含量、每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量極顯著正相關（＜0.01），與鈣化層厚度、有效層比例和每枚蛋殼鈣含量顯著正相關（＜0.05），與乳突比例顯著負相關（＜0.05）；蛋殼鈣百分含量與有效層比例極顯著正相關（＜0.01），有效層厚度顯著正相關（＜0.05），與乳突厚度和乳突比例極顯著負相關（＜0.01）；每枚蛋殼鈣含量與鈣化層厚度顯著正相關（＜0.05）；單位蛋殼面積鈣含量與有效層厚度和鈣化層厚度顯著正相關（＜0.05）；蛋殼磷百分含量與鈣化層厚度和乳突密度極顯著正相關（＜0.01），與有效層厚度顯著正相關（＜0.05）；每枚蛋殼磷含量與鈣化層厚度極顯著正相關（＜0.01），與有效層厚度和乳突密度顯著正相關（＜0.05）；單位蛋殼面積磷含量與鈣化層厚度極顯著正相關（＜0.01），與有效層厚度和乳突密度顯著正相關（＜0.05）；蛋殼有機物含量與乳突密度極顯著正相關（＜0 .01），每枚蛋殼有機物含量和單位蛋殼面積有機物含量與乳突寬度和乳突密度顯著正相關（＜0.05）；晶粒大小與每枚蛋殼有機物含量和單位蛋殼面積有機物含量顯著負相關（＜0.05）。

表6 海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼化學組成的變化

3 討論

蛋殼品質(zhì)是雞蛋重要的經(jīng)濟性狀和外觀性狀，蛋殼品質(zhì)的評價包括力學特性、表觀指標、物理屬性等。本研究中，海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰（31周齡）至后期（80周齡），蛋重均值在61—64.5 g范圍內(nèi)逐漸增加，蛋殼強度從48.6 N降至35.2 N，與海蘭褐蛋雞的前期研究報道一致[12,16,19]，符合海蘭褐殼蛋雞飼養(yǎng)標準（2018）[20]31—80周齡，產(chǎn)蛋率從94%降至74%，蛋重在59.9—66.1 g之間。蛋重隨周齡的增加，主要是由于蛋黃重量[11,21]和蛋黃比例增加[22]引起的。雞蛋長徑從41周齡開始顯著增加，表明蛋形指數(shù)和蛋殼面積的增加主要是由于雞蛋長徑的增加所致。本研究中，海蘭褐蛋雞高峰至后期（31—80周齡）蛋重每周增加0.065 g（y = 0.065x+59.181，2= 0.714，＜0.01，x = 周齡，y = 蛋重）；蛋殼面積每周增加0.047 cm2（y = 0.047x+71.259，2= 0.637，＜0.01，x = 周齡，y = 蛋殼面積），與前人研究結(jié)果相似[12]。產(chǎn)卵間隔隨蛋雞周齡增加而增加，產(chǎn)蛋率降低[23]，蛋重快速增加，蛋重增加速度與蛋殼重增加速度不一致，可能是后期蛋殼品質(zhì)降低的重要原因[14]。此外，雞蛋越重，運輸過程中的動能越高，越容易破裂[24]。

在產(chǎn)蛋后期，蛋殼破損問題尤為突出，雞蛋破損率可達高峰期的3倍（60周齡與20—29周齡相比）[25]，另有研究發(fā)現(xiàn)，在運輸過程中32—50周齡雞蛋破損率增加約5.5%，62—80周齡增加約8.3%，可見雞蛋破損率隨蛋雞周齡增大而增加[26]。蛋殼強度是目前評價蛋殼力學特性廣泛采用的指標，體現(xiàn)了蛋殼所能承受的最大外力[27-28]，與蛋殼破損率有關[29]。蛋殼韌性是基于蛋殼強度、厚度和雞蛋短徑計算而得，反映了蛋殼抵抗原有裂紋擴展的能力[30]。本研究中，隨海蘭褐蛋雞周齡增加，蛋殼強度（y = -0.276x+ 57.814，2= 0.671，＜0.01，x=周齡，y=蛋殼強度）和韌性（y= -2.406x+474.691，2= 0.642，＜0.01，x =周齡，y=蛋殼韌性）線性下降。由此可知，海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋高峰至后期（31—80周齡）蛋殼強度每周降低0.276 N，韌性每周降低2.406 N/mm3/2。同樣21—70周齡海蘭褐蛋殼強度約降低0.8 kg·cm-1[31]，30—81周齡蛋殼強度每周降低0.195 N（y = -0.195x+ 52.323，2= 0.803，＜0.01）[12]。不足的是，蛋殼強度等力學特性的差異顯著性在生產(chǎn)上的實際意義還有待商榷?，F(xiàn)有報道表明，蛋殼強度由38 N降低到36 N時，蛋殼毛細裂紋檢出率由3%增加至6%，蛋液滲出的發(fā)生由0.1%增至0.4%[32-33]。目前，蛋殼強度與破損率的對應關系未有系統(tǒng)研究，關于破損率或蛋殼缺陷陡增的蛋殼強度閾值還需要進一步確定。

ES：蛋殼強度；FT ：蛋殼韌性；MW：乳突寬度； ET：有效層厚度；MT：乳突厚度；CT：鈣化層厚度；ER：有效層比例；MR：乳突比例； MD ：乳突密度；CaP：每枚雞蛋蛋殼鈣含量；CaD：單位蛋殼面積鈣含量；PP：每枚雞蛋蛋殼磷含量；PD：單位蛋殼面積磷含量；OM：有機物；OMP：每枚雞蛋蛋殼有機物含量；OMD：單位蛋殼面積有機物含量；TP：總蛋白；TPP：每枚蛋殼總蛋白含量； TPD：單位蛋殼面積總蛋白含量；GS：晶粒大小

ES: Eggshell strength; FT: Eggshell fracture toughness; MW: Mammillary knob width; ET: Effective thickness; MT: Mammillary thickness; CT: Calcified layer; ER: Effective layer rate; MR: Mammillary layer rate; MD: Mammillary knob density; CaP: Ca content per eggshell; CaD: Calcium content per unit area; PP: Phosphorus content per eggshell; PD: Phosphorus content per unit area; OM: Organic matter; OMP: Organic matter per eggshell; OMD: Organic matter per unit area; TP: Total protein; TPP: Total protein per eggshell; TPD: Total protein per unit area; GS: Grain size

*表示差異顯著（＜0.05）；**表示差異極顯著（＜0.01）

*mean significant difference (＜0.05); ** mean extremely significant difference (＜0.01)

傳統(tǒng)觀點認為，產(chǎn)蛋后期蛋重增加，雞蛋表面積增大，蛋殼比例和單位面積蛋殼重（蛋殼指數(shù)）降低，蛋殼重未隨蛋重同比例增加，是導致后期蛋殼品質(zhì)下降的主要原因[14]。因此，前期研究者們選用蛋殼的物理屬性和表觀指標，如蛋殼重、蛋殼比例、蛋殼厚度和蛋殼指數(shù)等，預測和評價蛋殼力學特性[34]。本研究中，海蘭褐產(chǎn)蛋高峰至后期（31—80周齡）蛋殼強度與蛋殼重、蛋殼比例、指數(shù)、厚度變化趨勢不盡相同。此外，蛋殼強度和韌性直至50周齡出現(xiàn)顯著下降，65—80周齡蛋殼強度顯著低于之前各周齡，而蛋殼重、蛋殼比例、蛋殼指數(shù)和蛋殼厚度則是在不同周齡（41—60周齡）顯著增加。且除65和70周齡外，蛋殼重、百分比例、指數(shù)和厚度與31周齡相比并未出現(xiàn)明顯的下降。上述結(jié)果提示，蛋殼絕對質(zhì)量及相對比例的變化并不能充分解釋產(chǎn)蛋高峰至后期蛋殼力學特性的下降。與前人的研究相似，除58周齡外，30—76周齡，蛋殼重逐漸增加，30與81周齡并不顯著[12]，蛋殼重不受周齡影響，蛋殼比例顯著降低[23]。因此，除蛋殼物理屬性外，蛋殼結(jié)構和組成成分可能是產(chǎn)蛋后期力學特性降低的原因。

材料特性和結(jié)構特性是決定蛋殼力學特性的重要因素。材料特性取決于蛋殼的無機和有機成分及其相互作用，而結(jié)構特性取決于蛋殼的厚度、密度、蛋形和雞蛋大小[35]。本試驗中，主成分載荷分析顯示，蛋殼強度、蛋殼比例、蛋殼韌性和蛋殼指數(shù)對第一主成分（PC1）（64%）貢獻大；在第二主成分（PC2）（23%）中，蛋殼重、蛋殼厚度和蛋殼面積貢獻率大。進一步，我們采用聚類分析，根據(jù)蛋殼力學特性、物理屬性及其在產(chǎn)蛋周期（31—80周齡）中發(fā)生的相對變化對不同周齡蛋殼進行分類。結(jié)果顯示，依據(jù)蛋殼品質(zhì)，產(chǎn)蛋后期大致可細分為55—60和65—80周齡2個階段。另一項對海蘭褐品系雞蛋的物理特性分析顯示，44—81周齡蛋雞所產(chǎn)的雞蛋可分為44—53周和58—81周兩組[12]。雖然由于采樣點設計的局限，不能得出具體、準確的分界點，但根據(jù)該報道和本試驗結(jié)果，能夠推斷出海蘭褐蛋雞60周齡之后蛋殼整體屬性發(fā)生明顯變化，65周齡后蛋殼強度的下降尤為明顯。

蛋殼主要是由大于95%的方解石晶體和3%—6%的有機物組成，形成具有一定厚度和力學特性的多層結(jié)構[36]。前期研究者提出，產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)下降的一個重要原因是蛋殼碳酸鈣沉積的減少，系因雞體激素（甲狀旁腺激素、降鈣素、雌激素和1,25- (OH)2D3）[37-38]和24-羥化酶活性降低等造成的鈣代謝紊亂所致[39]。本試驗中，蛋殼力學特性與單位蛋殼面積鈣含量正相關（= 0.57，= 0.010）與蛋殼鈣百分含量無關（= 0.05，= 0.850）。殼腺鈣轉(zhuǎn)運分泌在整個產(chǎn)蛋周期中可能是相對穩(wěn)定的，表現(xiàn)為每枚蛋殼鈣總含量無顯著變化。41周齡時，蛋殼鈣的百分含量顯著下降，而后未觀察到41—80周齡期間的顯著變化；直到70和80周齡，隨著蛋殼面積的增大，單位蛋殼面積鈣含量的顯著降低。與前人研究相似，60和78周齡較30周齡蛋殼鈣百分含量明顯降低[13]，且蛋殼面積顯著增大。

蛋殼磷主要以磷酸鈣的形式存在，含量很少，卻在蛋殼形成和代謝中發(fā)揮重要的作用[40]。磷與蛋殼彈性和韌性有關[41]，其含量降低，蛋殼破損率增加[28]。一般認為，蛋殼腺中的磷和鈣均直接來源于血液，磷與鈣吸收和分泌存在負調(diào)節(jié)關系[42]，另有研究表明，青年雞蛋殼腺磷僅在鈣化最后階段急劇增加，而老齡雞蛋殼腺蛋殼磷在鈣化階段出現(xiàn)較早，鈣化末期最多[43]，這可能影響了產(chǎn)蛋后期蛋殼力學特性。本研究中，蛋殼磷含量與蛋殼力學特性顯著正相關（= 0.71，＜0.01），41周齡單位蛋殼面積磷含量增加，單位蛋殼面積蛋殼鈣含量降低。而60周齡每枚蛋殼磷含量和單位蛋殼面積磷含量均降低，與力學特性變化一致。有研究報道，蛋殼中磷酸鹽對碳酸鈣沉積具有雙向影響[43]，關于磷對蛋殼力學特性的影響有待繼續(xù)研究。

超微結(jié)構特征也對蛋殼力學特性存在重要影響。蛋殼的超微結(jié)構由六層組成，由內(nèi)至外分別為未鈣化的內(nèi)、外蛋殼膜、鈣化不規(guī)則的乳突層、柵欄層、垂直晶體層和膠護層[13]。柵欄層及晶體層是構成蛋殼強度和厚度的主要結(jié)構，而乳突層是蛋殼裂紋產(chǎn)生的初始位置。乳突單元的緊密連接和整齊排列可有效抑制裂紋擴展速度[44]。本研究相關性分析結(jié)果表明，蛋殼強度與有效層厚度（= 0.70，＜0.01）、鈣化層厚度（= 0.66，＜0.01）、乳突密度（= 0.64，＜0.01）和有效層比例（= 0.61，= 0.010）顯著正相關，與乳突層比例（= -0.63，= 0.010）負相關。值得注意的是，乳突密度極顯著影響蛋殼強度和韌性，但直至70和80周齡出現(xiàn)明顯降低。而乳突層比例和有效層比例隨周齡分別逐漸增加和降低，與蛋殼強度的逐周降低變化趨勢一致。該結(jié)果提示，蛋殼超微結(jié)構層的周齡性變化可能參與了高峰至后期蛋殼力學特性的逐漸下降，末期（70和80周齡）乳突密度的驟然降低進一步加劇了力學特性下降。此外，試驗中也觀察到60周齡開始乳突排列規(guī)則，70和80周齡排列較為規(guī)則，異常乳突體（B型乳突體）的發(fā)生率也在70和80周齡大量增加，B型乳突體是游離于正常乳突體之間小的圓形乳突。當外力壓迫蛋殼時，裂縫沿著乳突間隙延展，B型乳突體加速了裂縫的延展[44]。此外，蛋殼方解石晶體的優(yōu)先取向影響蛋殼力學特性，蛋殼裂紋更易沿著特定的晶體取向延展[36]。方解石晶體的大小和取向與融合位點、基質(zhì)蛋白的調(diào)控作用有關。本試驗未觀察到蛋雞周齡對蛋殼方解石晶體大小的影響。方解石晶體結(jié)構與蛋殼力學特性關系仍需進一步研究。

4 結(jié)論

4.1 依據(jù)蛋殼物理屬性和力學特性，可將海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋期劃分為31—50周齡和55—80周齡2個階段，其中后者還可細分為55—60周齡和65—80周齡2個階段，65周齡之后蛋殼強度和蛋殼韌性的下降更加明顯。

4.2 隨蛋雞周齡增加，蛋殼超微結(jié)構乳突層厚度及比例增加，有效層厚度及比例降低。超微結(jié)構層厚度和比例的變化可能參與了海蘭褐蛋雞高峰至后期（31—80周齡）蛋殼力學特性的逐漸下降。

4.3 蛋殼磷含量的下降可能參與60—80周齡蛋殼力學特性的下降，乳突層結(jié)構變異以及蛋殼面積變大導致的單位蛋殼面積鈣含量下降，加劇了70—80周齡蛋殼力學的下降。

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The Changes of Eggshell Quality in the Laying Cycle of Hy-Line Brown Layers

MA LingLing, FENG Jia, WANG Jing, QI GuangHai, MA YouBiao, WU ShuGeng, ZHANG HaiJun, QIU Kai

Laboratory for Risk Assessment of Animal Product Quality and Safety, Ministry of Agriculture and Rural Affairs /Key Open Laboratory of Feed Biotechnology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081

【】In this study, the changes of egg physical and eggshell quality properties from peak to late phase of production (31 to 80-wk-old) of Hy-Line Brown layers were observed to investigate the critical period when eggshell quality deteriorated and the changes of eggshell structure and components, so as to provide reference for improving the eggshell quality of the late phase of production. 【】A total of 84 healthy 30-wk-old Hy-Line Brown layers were randomly divided into 7 replicates with 12 birds each. All hens had free access to corn-soybean meal basal diet and water for 50 weeks. Three eggs per replicate were collected every day for 3 consecutive days at the hen age: 31, 36, 41, 46, 50, 55, 60, 65, 70, 75 and 80-wk-old, and then eggshell physical and mechanical properties were tested. Eggshell from the hens aged: 31, 41, 50, 60, 70 and 80-wk-old was tested the following items, eggshell ultrastructure of cross section and inner surface by scanning electron microscope, the crystal structure by X-ray diffraction analyzer, organic content by burning method, total eggshell protein content by Coomassie brilliant blue method, and eggshell calcium and phosphorus content by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. 【】(1) Egg weight, egg length and eggshell area of 31 to 80-wk-old were increased linearly (＜0.01). Eggshell weight, eggshell percentage, eggshell thickness and eggshell index were increased and then decreased with hen age increasing (＜0.05). After 50-wk-old, eggshell strength and eggshell fracture toughness were decreased significantly (<0.05), and reached the lowest value from 65 to 80-wk-old (＜0.05). (2)Based on the principal component loading analysis of eggshell quality, in PC1, the load values of eggshell strength, eggshell percentage, eggshell fracture toughness and eggshell index were higher, while in PC2, the loading values of eggshell weight, eggshell thickness and eggshell area were higher. According to properties of eggshell quality, the laying cycle was divided into 2 stages of 31 to 50-wk-old and 55 to 80-wk-old, and the later could further be divided into 55 to 60-wk-old and 65 to 80-wk-old. (3) For eggshell ultrastructure, mammillary thickness and rate of 70 and 80-wk-old were significantly lower than those of 31 to 60-wk-old (＜0.05), and mammillary knob density was significantly lower than that of 31-wk-old (＜0.05). (4) There were no significant changes in the contents of organic matter and total protein, per unit area and per eggshell and no significant change in calcium content per eggshell (＞0.05), but the calcium content per unit area of 70 and 80-wk-old were decreased significantly (＜0.05). The phosphorus content of 60, 70 and 80-wk-old was significantly lower than others (＜0.05), while the phosphorus content per eggshell and per unit area were significantly lower than those of 31-wk-old (＜0.05). (6) The eggshell mechanical properties was significantly positively correlated with the thickness of calcified layer and effective layer, mammillary knob density, effective layer rate, calcium content per unit area and the content of phosphorus, per eggshell and per unit area (＜0.05), was significantly negatively correlated with mammillary layer rate (＜0.05). 【】According to eggshell physical and mechanical properties, the laying cycle of Hy-Line Brown layers could be divided into 2 stages: 31 to 50-wk-old and 55 to 80-wk-old. The eggshell mechanical properties were decreased significantly after 65-wk-old, as the changes of eggshell ultrastructure layer thickness and rate might contribute to the decrease of eggshell mechanical properties in the laying cycle. The decrease of eggshell phosphorus content might be one of the reasons for the decrease of eggshell mechanical properties from 60 to 80-wk-old. From 70 to 80-wk-old, eggshell ultrastructural variation and the decrease of eggshell calcium content per unit area might aggravate the decrease of eggshell mechanical properties

laying period; eggshell quality; mechanical properties; eggshell ultrastructure; chemical composition

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.017

2020-11-20；

2021-02-03

國家自然科學基金（NSFC31872396）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-40-K12）、北京市家禽創(chuàng)新團隊（BAIC04-2018）

馬玲玲，E-mail：m18769822923@163.com。通信作者王晶，Tel/Fax：010-82106097；E-mail：wangjing@caas.cn

（責任編輯 林鑒非）