杜鵑紅山茶ACO1的克隆及其表達(dá)分析研究

王江英 朱朋波 葛金濤 惠林沖 李紀(jì)元 孫明偉 趙統(tǒng)利 邵小斌 湯雪燕

摘 ?要：根據(jù)山茶（Camellia japonica）同源序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用同源克隆和3，5-RACE技術(shù)，從杜鵑紅山茶（C. azalea）花芽組織中克隆出ACC氧化酶（ACC-oxidase， ACO）基因，命名為CaACO1，基因全長1232 bp，開放閱讀框963 bp，編碼320個(gè)氨基酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，ACO1在杜鵑紅山茶不同組織中均得到表達(dá)，其中莖尖ACO1表達(dá)量最低，其次花芽、葉芽、根尖，表達(dá)量較高的是真葉和花器官，隨著葉片成熟和花器官發(fā)育ACO1表達(dá)量均逐漸增加。結(jié)果表明，該基因可能參與杜鵑紅山茶葉片發(fā)育，并且與花器官衰老密切相關(guān)。ACO1在參試的8個(gè)山茶品種花器官發(fā)育過程中的表達(dá)模式基本一致，但不同品種間的表達(dá)量存在差異。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ACO1表達(dá)量與花型、花色、花徑和花瓣數(shù)4個(gè)形態(tài)指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：山茶;ACC氧化酶;基因克隆;表達(dá)分析;形態(tài)指標(biāo)

Abstract： On the basic of homologous sequences of Camellia japonica， an ACC-oxidase （ACO） gene was cloned from the floral bud of C. azalea by the 3，5-RACE technology named CaACO1. The full-length cDNA of CaACO1 was 1232 bp， containing a 963 bp ORF which encoding 320 amino acids. Expression of ACO1 in the four development periods of the floral organ in C. azalea were analyzed by fluorescent quantitative real-time PCR. ACO1 was expressed in twelve samples differently， where the expression level of ACO1 in shoot tip was the lowest， medium in flower bud， leaf bud and root tip， the highest in true leaves and flower， which indicated that ACO1 may be involved in the leaf development of C. azalea and associated with flower senescence. The trends of expressions of ACO1 were almost the same as in the four development periods of the eight camellias， but the expression levels were different. Correlation analysis found that the expression of ACO1 was not significantly correlated with four morphological indexes of flower type， flower color， flower diameter and petal number.

Keywords： Camellia japonica; ACC-oxidase; gene clone; expression analysis; flower organ characteristics

山茶（Camellia japonica）樹形優(yōu)美，葉色濃綠，花形多樣，色彩豐富，花期較長，從10月到翌年5月都有開放，盛花期1—3月，具有極高的觀賞價(jià)值[1]。近年來新發(fā)現(xiàn)的杜鵑紅山茶（C. azalea）是山茶屬中能夠四季開花的奇特原種，是中國獨(dú)有的寶貴山茶種質(zhì)資源[2]。然而單朵花開放時(shí)間因不同山茶品種存在差異，但盛花期7～ 10?d后花朵均衰老敗落。通過分子生物學(xué)技術(shù)研究花器官發(fā)育相關(guān)基因可為花期延長提供依據(jù)。

乙烯是植物衰老的主要調(diào)控因子，參與植物的種子萌發(fā)、生根、莖葉生長、花芽分化以及葉片和花器官衰老等不同的生理發(fā)育過程[3-4]。ACC氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途徑中的最后一個(gè)酶，抑制ACO活性可以降低乙烯生成，從而延緩切花衰老和提高盆花品質(zhì)[5-6]。切花衰老期間，ACO在花器官不同部位表達(dá)量急劇增加，乙烯釋放量也對應(yīng)升高，而反義表達(dá)ACO基因，能降低轉(zhuǎn)基因植株中的乙烯含量，從而延遲花瓣的衰老[7-8]。目前已從多種觀賞花卉（如香石竹、百合及水仙）中克隆出ACO，反義ACO轉(zhuǎn)化香石竹后瓶插壽命延長，實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，ACO在水仙花瓣中的表達(dá)均隨著花器官衰老而逐漸上升[9-13]。

本研究以杜鵑紅山茶為材料，分離出ACO1基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析其在杜鵑紅山茶不同組織中的表達(dá)量，以及探究ACO1基因在葉片生長和花器官發(fā)育過程中的表達(dá)模式。另外，測定8種山茶花器官不同發(fā)育時(shí)期CaACO1基因表達(dá)量與花的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，為研究CaACO1基因在山茶乙烯合成及花器官形態(tài)建成中的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

2017年4月從浙江金華引進(jìn)5年生杜鵑紅山茶實(shí)生苗，2017年夏季能正常開花，2018年夏季采集根尖、莖尖、葉芽、第3片真葉、第5片真葉、第7片真葉、第10片真葉，以及花芽萌動(dòng)、現(xiàn)蕾期、孕蕾期、開花期、衰老期的花器官組織，共12個(gè)樣本。2018年10月從山東青島引進(jìn)3年生且立地條件相同的110份山茶種質(zhì)，2019年3月大部分品種處于盛花期，從中選擇花型、花色和花徑等性狀特征不同的8份種質(zhì)（表1），分別采集現(xiàn)蕾期、孕蕾期、始花期、盛花期的花器官組織。所有采集樣本液氮速凍，-80?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?CaACO1的克隆

按照EASY Spin Plus植物RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA。根據(jù)GenBank公布的ACO1同源基因序列進(jìn)行保守區(qū)片段擴(kuò)增，再按照TaKaRa 5-Full RACE Kit、3-Full RACE Kit說明書進(jìn)行目的片段5和3末端的擴(kuò)增，所用引物見表2。

1.3 ?生物信息學(xué)分析

DNAMAN 8.0軟件序列拼接后在NCBI上進(jìn)行Blast同源性比對，選擇同源性較高的8種植物，運(yùn)用DNAMAN 8.0軟件和MEGA 6.0軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。利用ProtParam軟件（http：//cn.expasy.org）分析蛋白質(zhì)的理化特性，HNN軟件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/）進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析;采用Swiss-model同源建模方法預(yù)測蛋白質(zhì)相應(yīng)的三級結(jié)構(gòu)。

1.4 ?CaACO1在杜鵑紅山茶不同組織中的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測CaACO1在杜鵑紅山茶12個(gè)組織樣品包括根尖、莖尖、

葉芽、第3片真葉、第5片真葉、第7片真葉、第10片真葉，以及花芽萌動(dòng)期、現(xiàn)蕾期、孕蕾期、開花期、衰老期花器官中的表達(dá)量，以山茶GAPDH為內(nèi)標(biāo)（所用引物見表2），生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)3次。運(yùn)用2?Ct法求得相對表達(dá)量。

1.5 ?CaACO1在花器官中的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測CaACO1在8個(gè)參試山茶品種現(xiàn)蕾期、孕蕾期、始花期和盛花期整個(gè)花器官中的表達(dá)量，以山茶GAPDH為內(nèi)標(biāo)（所用引物見表2），生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)3次。

運(yùn)用Y=10?Ct/3法計(jì)算實(shí)際表達(dá)量[14]。

1.6 ?CaACO1表達(dá)量與山茶的花器官形態(tài)指標(biāo)相關(guān)性分析

應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)隸屬分析法計(jì)算ACO1表達(dá)量的綜合隸屬值和8種山茶的形態(tài)指標(biāo)（花徑、花瓣數(shù)）的平均隸屬值[15]，利用SPSS 19.0軟件對不同山茶形態(tài)指標(biāo)的平均隸屬值和盛花期ACO1表達(dá)量隸屬函數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?CaACO1全長cDNA序列克隆

以杜鵑紅山茶小花芽RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，保守區(qū)片段擴(kuò)增，經(jīng)測序獲得長388 bp的序列（圖1A），NCBI Blast同源序列比對顯示，與其他物種的基因序列同源性高達(dá)90%，確認(rèn)此序列為杜鵑紅山茶ACO1基因的一段序列。利用5-RACE和3-RACE技術(shù)，從杜鵑紅山茶小花芽總RNA中分別獲得ACO1 cDNA的5和3端序列。測序結(jié)果表明5-RACE產(chǎn)物長度為741?bp（圖1B），3-RACE產(chǎn)物長度為774 bp（圖1C）。DNAMAN 8.0軟件拼接序列獲得基因全長1232?bp，命名為CaACO1，利用ORF Finder分析CaACO1的CDS區(qū)為963?bp（圖1D），編碼一條含320個(gè)氨基酸，分子量為36.164 kD，等電點(diǎn)為5.40的蛋白質(zhì)。

2.2 ?CaACO1的生物信息學(xué)分析

利用NCBI Blast和DNAMAN 8.0軟件對杜鵑紅山茶及同源性較高的8個(gè)物種（茶樹登錄號：ABI33224.1，光皮樺登錄號：ADK39027.1，咖啡樹登錄號：AGM48542.1，獼猴桃登錄號：AEM62884.1，芍藥登錄號：AEK70335.1，柿子登錄號：BAB89351.1，桃樹登錄號：AAL26910.1和天竺葵登錄號：AAC48977.1）的ACO氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果（圖2）表明，CaACO1編碼的CaACO以α-螺旋和無規(guī)則卷曲作為主要骨架，延伸鏈所占比例較小，無β-轉(zhuǎn)角;序列分析顯示，CaACO在序列中部保守性較高，具有1個(gè)PcbC superfamily保守結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用MEGA 6.0軟件中的鄰位相連法構(gòu)建了9種高等植物的ACO系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），從歸類結(jié)果可以看出，杜鵑紅山茶和茶樹同為山茶屬植物，在親緣關(guān)系上相對較近，與植物分類結(jié)果一致。

2.3 ?CaACO1在杜鵑紅山茶中的表達(dá)分析

CaACO1在杜鵑紅山茶不同組織中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖4A），其中莖尖中表達(dá)量最低，花芽、葉芽和根尖中的表達(dá)量分別是莖尖的2.29倍、4.04倍和9.27倍;第3片真葉、第5片真葉、第7片真葉、第10片真葉的表達(dá)量分別為葉芽的4.71倍、8.41倍、11.08倍、15.49倍（圖4B）;現(xiàn)蕾期、孕蕾期、開花期、衰老期的表達(dá)量分別為花芽萌動(dòng)期的5.07倍、11.74倍、42.27倍、23.23倍（圖4C）（P<0.05）。結(jié)果表明，CaACO1在莖尖、花芽、葉芽和根尖等幼嫩組織中的表達(dá)量較低，隨著葉片的不斷成熟以及花器官不斷發(fā)育，CaACO1的表達(dá)量逐漸增加，且表達(dá)模式基本一致。

2.4 ?CaACO1在不同山茶中的表達(dá)分析

杜鵑紅山茶的花器官4個(gè)發(fā)育時(shí)期（圖5A）中，CaACO1在現(xiàn)蕾期和孕蕾期表達(dá)量差異不顯著，與始花期和盛花期差異顯著，其中現(xiàn)蕾期中的表達(dá)量最低，孕蕾期和始花期的表達(dá)量分別是現(xiàn)蕾期的4.59倍和22.89倍，盛花期表達(dá)量最高，高達(dá)35.09倍（圖6A）。CaACO1在‘乙女椿（圖5B、圖6B）、‘馬歇爾（圖5C、圖6C）、‘黑騎士（圖5D、圖6D）、‘金華美女（圖5E、圖6E）、‘烈香（圖5F、圖6F）、‘十里紅塵（圖5G、圖6G）和‘耐冬（圖5H、圖6H）中的表達(dá)情況與杜鵑紅山茶相似。8種山茶的花器官4個(gè)發(fā)育時(shí)期CaACO1表達(dá)量均隨著花器官的成熟而增加（P<0.05）。比較發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)蕾期CaACO1表達(dá)量最低，孕蕾期的表達(dá)量約為花苞期的2.60～5.78倍，平均3.71倍;始花期的表達(dá)量約為花苞期的7.52～22.89倍，平均12.97倍;盛花期的表達(dá)量約為花苞期的18.38～35.09倍，平均25.02倍（圖6），表明CaACO1在幼嫩的花器官組織中表達(dá)水平較低，隨著花器官的不斷成熟，始花期表達(dá)量驟升，盛花期表達(dá)量達(dá)到最高，由此推測，CaACO1可能參與山茶的花器官發(fā)育，并且與花衰老密切相關(guān)。

2.5 ?CaACO1表達(dá)量與花器官形態(tài)指標(biāo)相關(guān)性分析

利用SPSS Pearson對花徑/花瓣數(shù)平均隸屬函數(shù)（△）和盛花期ACO1表達(dá)量的隸屬函數(shù)（RE-MFV）進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，8種山茶的花徑、花瓣數(shù)與盛花期ACO1表達(dá)量無相關(guān)性。

8種山茶中，根據(jù)花型可以分為4類（表3），第1類T1為單瓣（杜鵑紅山茶、‘耐冬）、第2類T2為半重瓣（‘黑騎士）、第3類T3為玫瑰重瓣至松散牡丹型（‘馬歇爾）、第4類T4為牡丹型（‘烈香）、第5類T5為完全重瓣型（‘乙女椿‘金華美女‘十里紅塵）。T1類的杜鵑紅山茶和‘耐冬的RE-MFV值排序分別為2和6，T2類的‘黑騎士排序?yàn)?，T3類的‘馬歇爾為8，T4類的‘烈香為1，而T5類的‘乙女椿‘金華美女和‘十里紅塵則分別為3、7、5，由此說明8種山茶的RE-MFV值與花型不存在明顯的相互關(guān)系。根據(jù)花色指標(biāo)從淺至深的排序結(jié)果與RE-MFV的排序結(jié)果不完全一致，說明RE-MFV值與花色也無明顯關(guān)系。

綜上可以看出，8種山茶盛花期的ACO1表達(dá)量與花型、花色、花徑、花瓣數(shù)都無顯著相關(guān)性。

3 ?討論

杜鵑紅山茶組織特異性表達(dá)分析顯示，CaACO1在12個(gè)組織樣品中均表達(dá)，表達(dá)量差異顯著，其中幼嫩組織莖尖、花芽、葉芽和根尖表達(dá)量較低，而葉片和花器官中的表達(dá)量則相對較高，并且隨著葉片的不斷成熟和花器官的發(fā)育，表達(dá)量基本呈遞增趨勢，說明CaACO1基因在葉片和花器官衰老過程中具有重要作用。其中，相對于開花期，衰老期的表達(dá)量有所下降可能是隨著花的衰老，細(xì)胞活性降低所造成。周露等[16]發(fā)現(xiàn)SmACO1在丹參不同組織中均有表達(dá)，根、莖、葉中的表達(dá)量較低，花中的表達(dá)量最高;NtACOY2基因在花瓣和副冠中的表達(dá)均隨著‘云香水仙花的衰老而逐漸上升[11]。田曉巖等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，在文心蘭切花衰老期間，OnACO2在唇瓣、花萼、側(cè)瓣和蕊柱中表達(dá)水平都急劇升高，認(rèn)為OnACO2基因是一個(gè)對花衰老發(fā)揮功能的基因。本研究可以推測，ACO1對花器官衰老起負(fù)調(diào)控作用[17]，康乃馨轉(zhuǎn)入反義ACO后，抑制其內(nèi)源ACO基因的表達(dá)，從而降低乙烯的生物合成，并且可以延遲花瓣衰老[8， 18]。轉(zhuǎn)化反義ACO的‘黃星香石竹在隔離條件下栽培開花正常，其切花在25?℃條件下瓶插壽命延長了4?d[10]，吳曉慶等[19]也發(fā)現(xiàn)反義ACO轉(zhuǎn)基因石竹瓶插花期和單朵花期比對照延長1倍，盆栽群體花期比對照延長15?d。

CaACO1在其他7種參試山茶的花器官中的表達(dá)模式與杜鵑紅山茶基本一致，但4個(gè)發(fā)育時(shí)期8種山茶的ACO1表達(dá)量排序存在差異?，F(xiàn)蕾期和孕蕾期，‘十里紅塵表達(dá)量均最高，‘烈香表達(dá)量最低;而始花期和盛花期表達(dá)量最高的則均為‘烈香，表達(dá)量最低的分別為‘金華美女和‘馬歇爾。由此推測，8種山茶花器官的ACO1表達(dá)模式雖然相似，但不同品種間隨著花器官衰老表達(dá)量增長的幅度卻不一致。一方面可能與山茶品種差異有關(guān)，也可能因?yàn)闃悠凡杉瘯r(shí)花的發(fā)育程度不一致有關(guān)。

8種山茶的花器官4個(gè)形態(tài)指標(biāo)中，可量化的2個(gè)指標(biāo)花徑、花瓣數(shù)與ACO1表達(dá)量的MFV值都不存在相關(guān)性，通過花型分類和花色排序也顯示與之無相關(guān)性，本研究可以推測，ACO1基因可能參與山茶的花發(fā)育，并且與花器官衰老密切相關(guān)，而不參與花的形態(tài)結(jié)構(gòu)與建成過程。

參考文獻(xiàn)

張宏達(dá). 山茶屬植物的系統(tǒng)研究[M]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部， 1981.

管開云， 李紀(jì)元， 王仲朗. 中國茶花圖鑒[M]. 杭州： 浙江科學(xué)技術(shù)出版社， 2014： 375.

Woltering E J， van Doorn W G. Role of ethylene in senescence of petals-morphological and taxonomical relationships[J]. Journal of Experimental Botany， 1988， 39（11）： 1605-1616.

van Doorn W G. Categories of petal senescence and abscission： a re-evaluation[J]. Annals of Botany， 2001， 87（4）： 447-456.

Nooden L D， Jones M L. Changes in gene expression during senescence[M]. Plant Cell Death Processes. Amsterdam： Elsevier， 2004： 51-71.

Hoeberichts F A， van Doorn W G， Vorst O， et al. Sucrose prevents up-regulation of senescence-associated genes in carnation petals [J]. Journal of Experimental Botany， 2007， 58（11）： 2873-2885.

田曉巖， 石樂松， 潘英文， 等. 文心蘭OnACO2基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 分子植物育種， 2015， 13（7）： 1602-1610.

Savin K W， Baudinette S C， Graham M W， et al. Antisense ACC oxidase RNA delays carnation petal senescence[J]. HortScience， 1995， 30（5）： 970-972.

余義勛， 張俊衛(wèi)， 孫振元， 等. 香石竹ACC氧化酶基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 林業(yè)科學(xué)研究， 2002， 15（3）： 256-260.

余義勛， 余義勛， 包滿珠. 反義ACO基因?qū)氆@得瓶插壽命長的香石竹植株[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2004， 31（5）： 633-636. d

劉鮮艷， 劉雅莉， 王躍進(jìn)， 等. 百合ACC氧化酶基因全長cDNA的克隆及序列分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2008， 28（4）： 4651-4656.

許潔婷. 百合LlACO1基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立[D]. 上海： 上海交通大學(xué)， 2008， 15-31.

孫申申， 溫秀萍， 陳曉靜. ‘云香水仙ACC氧化酶基因的克隆表達(dá)分析及其遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2017， 37（9）： 1685-1692.

Li X B， Fan X P， Wang X L， et al. The cotton ACTIN1 gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation[J]. Plant Cell， 2005， 17（3）： 859-875.

王彩華. 模糊論方法學(xué)[M]. 北京： 中國建筑出版社， 1988.

周 ?露， 化文平， 王喆之， 等. 丹參ACC氧化酶基因（SmACO1）的克隆與序列分析[J]. 植物研究， 2012， （5）： 584-590

Tang X Y， Gomes A M T R， Bhatia A， et al. Pistil-specific and ethylene-regulated expression of 1-aminocyclopropane- 1-carboxylate oxidase genes in Petunia flowers[J]. Plant Cell， 1994， 6（9）： 1227-1239.

張樹珍， 湯火龍， 楊本鵬， 等. 康乃馨ACC氧化酶反義基因遺傳轉(zhuǎn)化康乃馨的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2003， 30（6）： 699-702， 778.

吳曉慶， 譚華山， 張靜靜， 等. 根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACO基因轉(zhuǎn)化延長石竹花期的研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 34（6）： 21-26.

責(zé)任編輯：謝龍蓮