硃砂煙葉主要香氣物質(zhì)特征解析

李勇 逄濤 師君麗 鄒聰明 王亞輝 宋中邦 顧華國 隋學(xué)藝

摘?要：為了研究硃砂煙葉特征“糯米香”風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)，采用同時蒸餾萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法分析了硃砂煙葉（云煙87變異株）及其對照（云煙87）的香氣物質(zhì)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢出的114種香氣成分中，硃砂煙的平均香氣物質(zhì)含量是對照煙葉的2.5倍，硃砂煙中含量高于對照煙葉的化合物有96種，其中有52種香氣物質(zhì)的平均變化倍率（硃砂/對照）大于1.5。這些化合物主要來自非酶棕色化反應(yīng)和類胡蘿卜素降解，是煙葉主體香味的重要組成部分。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)本試驗與相關(guān)文獻(xiàn)有21種共同檢出的香氣物質(zhì)，其中16種香氣物質(zhì)在本試驗和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中均表現(xiàn)為硃砂煙中含量高于對照煙。試驗還發(fā)現(xiàn)麥斯明、3-氧代-a-紫羅蘭酮、糠醇、2-環(huán)戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18的含量分布存在對照煙葉<淺色硃砂煙<深色硃砂煙的規(guī)律，說明硃砂煙的顏色深淺可能與這些香氣成分的含量有關(guān)。香氣物質(zhì)含量的總體提高可能是硃砂煙形成其特征“糯米香”的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硃砂煙;香氣;巨豆三烯酮;氣相色譜;質(zhì)譜

Abstract： Flavor compounds screening of cherry-red tobacco leaf and normal flue-cured tobacco leaf was performed to elucidate the chemical basis of the “glutinous rice flavor” of cherry-red tobacco leaf. One hundred and fourteen flavor compounds were detected and the average content of these compounds in cherry-red tobacco was 2.5 times of that of the control. There were 96 compounds with higher concentration in the cherry-red tobacco than the control， of which， 52 compounds with fold-change （cherry-red/control） more than 1.5 were identified. These compounds， mostly from the Maillard reaction and the decomposition of carotenoids， are very important contributors of the dominant flavor of tobacco. The results of this study were compared with published references and 21 common compounds were extracted. Collectively higher concentrations in cherry-red tobacco for 16 of the common compounds were discovered. The relationship between the level of the red color of the cherry-red tobacco and the concentration of the flavor compounds was also studied. The concentration of myosmine， 3-oxo-a-ionone， 2-hydroxymethyl-furan， 2-Cyclopentene-1，4 -dione， 2-methyltetrahydrofuran-3-one， nicotinaldehyde， and the unknown compound 18 were found to have the lowest concentration in the control and the highest concentration in the dark cherry-red， indicating that the concentration of these compounds maybe related to the color of the cherry-red tobacco. The elevated concentration of the detected flavor compounds may account for the basis of the “glutinous rice flavor”.

Keywords： cherry-red tobacco; flavor; megastigmatrienone; gas chromatography; mass spectrometry

硃砂煙是烤煙的尼古丁轉(zhuǎn)化株，即烤煙中能將大部分尼古丁轉(zhuǎn)化為降煙堿的突變植株[1-3]。硃砂煙在國外被稱為“櫻紅煙”，最早報道于20世紀(jì)50年代[4-5]，因其特殊的“糯米香”風(fēng)味而受到卷煙工業(yè)的持續(xù)關(guān)注。硃砂煙煙葉的尼古丁含量較低、去甲基尼古丁和麥斯明含量較高等特征已明確，而決定其吸食風(fēng)味的香氣物質(zhì)特征尚不明確。目前，關(guān)于硃砂煙香氣特征的研究報道極少，僅見劉哲等[6]采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜分析硃砂煙香氣特征。由于頂空固相微萃取技術(shù)本身的特點，該報道的硃砂煙香氣成分中缺乏了以新植二烯、西柏三烯二醇、3-羥基-β大馬酮等為代表的煙葉中基礎(chǔ)香氣成分的數(shù)據(jù)。而同時蒸餾萃取是提取煙葉揮發(fā)性香氣成分最經(jīng)典的方法[7-9]。因此，有必要以同時蒸餾萃取為提取方法對硃砂煙和普通烤煙的香氣成分進(jìn)行更加廣泛的比較，以全面獲得硃砂煙的香氣特征。

本研究采用同時蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜法分析砂煙和對照煙葉中的香氣成分，解析硃砂煙的香氣特征，并通過不同顏色硃砂煙之間的香氣物質(zhì)比較，探索與硃砂煙顏色深淺相關(guān)的香氣成分。

1?材料與方法

1.1?儀器與試劑

Agilent 7890氣相色譜配5977四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）;改進(jìn)型同時蒸餾萃取儀（N-SDE）（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心）;定量濃縮儀（Syncore-y-6，瑞士BUCHI公司）;二氯甲烷，分析純。

1.2?樣品與標(biāo)樣

本試驗采用的煙葉樣品為2020年云南省曲靖市和玉溪市采收的烤后硃砂煙（云煙87變異種）及對照（云煙87）的中部煙葉。其中硃砂煙和對照煙種于同一地塊，土壤和栽培管理相同。各處理煙葉正常成熟采烤后分別取1 kg煙葉，去主脈后40 ℃條件下干燥4 h，粉碎過40目篩并于4 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)樣品包括1-戊烯-3-酮、3-甲基-1-丁醇、己醛、面包酮、3-甲基-2-丁烯醛、糠醛、糠醇、3，4-二甲基-2，5-二氫呋喃、5-甲基糠醇、苯甲醛、2-環(huán)戊烯-1，4-二酮、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰吡啶、6-甲基-5-庚烯-二酮、2-乙?；量?、苯乙醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香葉基丙酮、新植二烯、3-羥基-茄那士酮、巨豆三烯酮、氧化異佛爾酮、2，6-壬二烯醛、2-異丙基-5氧-己醛、2，3-二氫苯并呋喃、吲哚、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、β-環(huán)檸檬醛、茄酮、降茄二酮、5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、戊醛、3-羥基-2-丁酮、2，3-戊二酮、茄那士酮等，純度大于98%。內(nèi)標(biāo)，正十七烷。0#柴油購自云南省玉溪市紅塔區(qū)中國石化加油站，用于計算香氣物質(zhì)的線性保留指數(shù)。

1.3?樣品前處理方法

采用文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行樣品提取。準(zhǔn)確稱量20.00 g樣品，放入1 L的圓底燒瓶，同時加入350 mL蒸餾水和1 mL 20.0 μg/mL正十七烷內(nèi)標(biāo)溶液。向100 mL平底燒瓶中加入60 mL二氯甲烷作為萃取溶劑。將以上1 L和100 mL燒瓶分別安裝到同時蒸餾萃取裝置的萃取端和蒸餾端，用電熱套加熱蒸餾端燒瓶至沸騰，60 ℃水浴下加熱萃取端燒瓶，待蒸餾和萃取平衡后開始計時，提取2.5 h。將得到的二氯甲烷提取液加入10 g無水硫酸鈉進(jìn)行過夜干燥。干燥后的萃取液轉(zhuǎn)至定量濃縮儀進(jìn)行濃縮并定容至1.0 mL，轉(zhuǎn)入氣相色譜進(jìn)樣小瓶，以備分析。

1.4?GC-MS試驗條件

色譜條件：色譜分析柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）;程序升溫條件為50 ℃保持1 min，5 ℃/min 升至160 ℃，保持2 min;5 ℃/min 升至270 ℃，保持6 min;進(jìn)樣口溫度保持為250 ℃;載氣為氦氣;進(jìn)樣體積為1 μL;柱流量為1.0 mL/min;分流比為20∶1。

質(zhì)譜條件：溶劑延遲時間為1.9 min;質(zhì)量掃描范圍為m/z 35～400;傳輸線溫度為230 ℃;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集頻率為2 Hz。

1.5?數(shù)據(jù)處理

采用MS-DIAL數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[11-12]進(jìn)行色譜峰識別、峰匹配、噪音過濾、定量比較和定性鑒定。采用AMDIS和NIST MS Search 2.0進(jìn)行輔助結(jié)構(gòu)鑒定，質(zhì)譜和保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫來自NIST 2017 mainlib和Wiley registry8e。為了剔除試驗誤差和可能存在的隨機(jī)相關(guān)，試驗將玉溪和曲靖兩地硃砂煙和對照煙中變化倍率（硃砂/對照）均大于1且兩地平均值大于1.5的化合物作為硃砂煙含量顯著高于對照的化合物，將變化倍率均小于1且兩地平均值小于0.5的化合物作為硃砂煙含量顯著低于對照的化合物，將其余的化合物作為非顯著差異化合物。

2?結(jié)?果

2.1?硃砂煙和對照烤煙香氣成分的整體差別

試驗通過質(zhì)譜庫、保留指數(shù)等手段共鑒定出98種香氣成分，其中醛酮類占45%，醇類占19%，烴類占12%，含氮化合物占11%（圖1 A）。另外，本試驗中還檢測到16種含量顯著差異的未知化合物。對這114種化合物在硃砂煙和對照煙間的含量分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，硃砂煙的香氣物質(zhì)平均含量是對照煙葉的2.5倍。從化合物含量的變化倍率（硃砂/對照）來看，硃砂煙中含量低于對照的化合物僅占16%，而硃砂煙中含量高于對照的化合物則占84%（圖1 B），可見硃砂煙相對普通烤煙整體香氣成分含量更高。硃砂煙整體香氣物質(zhì)含量高于對照烤煙可能是其特征“糯米香”風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2?硃砂煙的特征香氣化合物

由表1看出，有52種香氣物質(zhì)其含量在硃砂煙中顯著高于對照烤煙，占所有被檢測香氣成分的45.6%。這些化合物中變化最大的是麥斯明，平均變化倍率達(dá)到41.1。麥斯明含量的升高是由于硃砂煙中尼古丁大量轉(zhuǎn)化成去甲基尼古丁，而去甲基尼古丁很容易脫氫形成麥斯明。同樣我們還發(fā)現(xiàn)以2，3-環(huán)戊烯并吡啶（變化倍率8.3）為代表的很多含氮化合物以及部分未鑒定出的化合物有很高的變化倍率，這些化合物很可能和麥斯明一樣，是去甲基尼古丁的初級或次級代謝物。試驗發(fā)現(xiàn)醛酮、醇、酯類化合物等物質(zhì)的變化倍率大致集中在1.5～5之間，并未出現(xiàn)生物堿（含氮化合物）和部分未知化合物（可能也是生物堿）那樣大的變化倍率。說明這些物質(zhì)的代謝途徑與以尼古丁和去甲基尼古丁為代表的生物堿代謝途徑存在著一定的關(guān)聯(lián)，但這些關(guān)聯(lián)相對麥斯明等物質(zhì)與去甲基尼古丁的關(guān)聯(lián)要弱一些。

醛酮類化合物一方面來自還原糖和氨基酸之間的非酶棕色反應(yīng)，另一方面來自類胡蘿卜素的降解。以糠醛、5-甲基糠醛、糠醇、面包酮為代表的醛酮類化合物含量的上升說明煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化對糖類代謝或氨基酸代謝也產(chǎn)生了影響。而β-大馬酮、3-羥基-β-大馬酮、香葉基丙酮、巨豆三烯酮均來自類胡蘿卜素的降解，硃砂煙中這些化合物含量的升高說明煙堿向降煙堿的轉(zhuǎn)化也影響了類胡蘿卜素的代謝途徑。

2.3?硃砂煙中含量較低的化合物

硃砂煙含量顯著低于對照的化合物僅有尼古?。ㄆ骄兓堵?.4）和未知物5（保留指數(shù)1751，質(zhì)譜特征離子173，平均變化倍率0.2）。由于硃砂煙中尼古丁含量顯著下降，硃砂煙作為低煙堿高香氣卷煙的原料將具有重要的意義。

2.4?硃砂煙與對照烤煙的共同香氣化合物

試驗共鑒定出60種含量無顯著性變化的化合物（表2）。這些香氣物質(zhì)一部分在玉溪樣品組和曲靖樣品組中的變化趨勢一致，但變化較?。ㄗ兓堵试?附近）。這些化合物的合成或分解代謝整體受煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化的影響較小，為烤煙中含量穩(wěn)定的香氣成分，屬于硃砂煙與普通烤煙的共同香氣化合物。另一部分香氣成分（如2，3-聯(lián)吡啶和2，3-二氫苯并呋喃）在玉溪樣品組和曲靖樣品組中的變化趨勢相反，且變化很大。這些化合物的含量變化可能受外部環(huán)境的影響更大，也不屬于硃砂煙的特征香氣成分。

2.5?試驗結(jié)果與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對

將本試驗得到的差異香氣成分與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，兩種方法共檢出21種共同的化合物（表3）。從整體上看，本試驗中21種化合物的平均變化倍率為3.6，而文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中的平均變化倍率為6.0。從香氣物質(zhì)個體看，苯甲醇、芳樟醇、苯乙醇、2-乙?；量⒛峁哦?、麥斯明、3-羥基-2-丁酮、苯甲醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、癸醛、β-大馬酮、香葉基丙酮、巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等化合物在本試驗玉溪和曲靖樣本中以及文獻(xiàn)報道[7]的試驗結(jié)果中均表現(xiàn)出在硃砂煙中的含量高于對照的特征，說明硃砂煙中這些化合物的含量分布規(guī)律具有很高的可靠性。同時，試驗也發(fā)現(xiàn)異戊醇、糠醇、苯乙醛、正壬醛、茄酮等化合物在本試驗中的分布規(guī)律與文獻(xiàn)不一致，這些化合物在硃砂煙中的含量分布還需要更多數(shù)據(jù)的支撐。

2.6?與硃砂煙顏色深淺相關(guān)的香氣物質(zhì)

對曲靖種植的硃砂煙烤后葉進(jìn)行顏色分類，得到硃砂淺色和深色的兩組樣品。對比分析對照樣品（顏色最淺）、淺色硃砂煙和深色硃砂煙中香氣成分的差異（圖2），發(fā)現(xiàn)麥斯明、3-氧代-a-紫羅蘭酮、糠醇、2-環(huán)戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18（保留指數(shù)2365，定量離子189）的含量分布均存在深色硃砂>淺色硃砂>對照的規(guī)律，而尼古丁的含量分布則為深色硃砂<淺色硃砂<對照，說明硃砂煙顏色的深淺可能與這些化合物的含量有關(guān)。

3?討?論

3.1?“糯米香”與香氣物質(zhì)含量之間的關(guān)系

硃砂煙最令人印象深刻的是其“糯米香”風(fēng)味，這種風(fēng)味普通烤煙不具有。但烤煙某種吸食風(fēng)味的形成通常是多種揮發(fā)性化合物共同作用的結(jié)果。硃砂煙中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物的含量整體高于普通烤煙，而尼古丁等化合物的含量則顯著低于普通烤煙。由于尼古丁主要影響卷煙的勁頭，而類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物等揮發(fā)性香氣物質(zhì)則通常被認(rèn)為影響吸食風(fēng)味，因此我們推測硃砂煙“糯米香”風(fēng)味的形成可能是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量整體提高對吸食風(fēng)味的綜合影響。而硃砂煙中巨豆三烯酮、苯甲醛、苯乙醛、糠醛等主要香氣物質(zhì)含量的提升可能是“糯米香”風(fēng)味的形成的重要原因。

從香氣化合物對煙葉香味特征的貢獻(xiàn)來看，硃砂煙中以巨豆三烯酮和香葉基丙酮為代表的香氣成分對煙葉清甜香風(fēng)格的彰顯、增香去雜、提高香味品質(zhì)等起到積極的作用[13-14]。

3.2?硃砂煙顏色深淺與香氣物質(zhì)的關(guān)系

硃砂煙的紅色物質(zhì)被認(rèn)為是降煙堿和醌類物質(zhì)反應(yīng)形成的[15-16]，但其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)至今未確定。試驗發(fā)現(xiàn)麥斯明、3-氧代-a-紫羅蘭酮、糠醇、2-環(huán)戊烯-1，4-二酮、面包酮、吡啶-3-甲醛以及未知物18的含量分布均存在深色硃砂>淺色硃砂>對照的規(guī)律，而尼古丁的含量分布則為深色硃砂<淺色硃砂<對照，說明硃砂煙顏色深淺與這些物質(zhì)存在相關(guān)關(guān)系。但硃砂煙的香氣提取物與對照煙葉在顏色上沒有顯著性差別，說明香氣物質(zhì)并不包含硃砂煙的紅色物質(zhì)。本試驗在對比不同提取溶劑對硃砂煙紅色物質(zhì)的提取效果時，發(fā)現(xiàn)與丙酮、氯仿、正己烷等試劑相比，純水能更好的提取出硃砂煙與對照煙葉中的紅色差別，說明朱砂紅的化學(xué)基礎(chǔ)是一種水溶性較好的物質(zhì)，以上提到的18種香氣物質(zhì)雖含量與硃砂煙紅色深淺有相關(guān)性，但不是引起硃砂煙紅色的直接原因。紅色物質(zhì)的最終確定需要通過分離純化和光譜、質(zhì)譜等技術(shù)的聯(lián)合使用來實現(xiàn)。

4?結(jié)?論

硃砂煙香氣物質(zhì)的整體含量大于對照煙葉，這些香氣物質(zhì)主要為非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物。3-氧代-a-紫羅蘭酮等8種香氣物質(zhì)的含量與硃砂煙的顏色成正相關(guān)關(guān)系，可能與硃砂煙顏色深淺有關(guān)。

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