普通煙草NtNAC055基因的克隆、鑒定及表達(dá)分析

王奇 李曉旭 郭存 郭永峰

摘?要：NAC家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中起著至關(guān)重要的作用，克隆和驗(yàn)證煙草中NAC相關(guān)基因可為煙草抗性育種提供理論依據(jù)。本研究采用RT-PCR方法從普通煙草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，對(duì)NtNAC055及其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)模式分析、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活等相關(guān)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NtNAC055基因的CDS序列全長(zhǎng)為1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC結(jié)構(gòu)域，編碼一個(gè)具有343個(gè)氨基酸的NAC轉(zhuǎn)錄因子;通過(guò)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，煙草NtNAC055與擬南芥ANAC055同源性較高，同屬于RD26亞家族;通過(guò)亞細(xì)胞定位分析以及轉(zhuǎn)錄激活分析發(fā)現(xiàn)，NtNAC055蛋白在細(xì)胞核中且具有轉(zhuǎn)錄激活活性;運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)該基因不同組織和脅迫處理后的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，NtNAC055基因在根、莖、葉、花和腋芽中均有表達(dá)，且在根部表達(dá)量最高;同時(shí)，該基因受干旱和熱脅迫的誘導(dǎo)，表明煙草NtNAC055基因可能參與了煙草的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：煙草;NtNAC055;非生物脅迫;干旱;基因表達(dá)

Abstract： NAC family is one of the largest transcription factor families in plants， and plays a significant regulatory role in plant development， signal transduction and abiotic stress response. Cloning and validation of NAC related genes in tobacco can provide a theoretical basis for tobacco breeding for stress tolerance. In this study， NtNAC055 was cloned from root cDNA of cv. K326 by RT-PCR. In addition， bioinformatics analysis， expression pattern analysis， subcellular localization and transactivation activity analysis of NtNAC055 were performed. The results showed that the full-length of NtNAC055 was 1032 bp， and the NtNAC055 protein was 343 aa that contained a typical NAC domain. Phylogenetic analysis indicated that NtNAC055 had high homology with ANAC055 from Arabidopsis. Subcellular localization and transactivation analyses showed that NtNAC055 was localized in the nucleus and had transactivation activities. The expressions of NtNAC055 were analyzed by qRT-PCR in different tissues of tobacco， and in seedlings under different abiotic stresses. The results showed that NtNAC055 was expressed in tobacco roots， stems， leaves， flowers and axillary buds， especially in roots. The expression levels of NtNAC055 were induced under drought and heat stresses， which indicated that NtNAC055 might be involved in tobacco abiotic stress responses.

Keywords： tobacco; NtNAC055; abiotic stress; drought; gene expression

NAC（NAM， AFAT， CUC）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子[1]，SOUER等[2]從矮牽牛中克隆到第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子NAM（No Apical Meristem），該轉(zhuǎn)錄因子家族成員作為重要的調(diào)控因子廣泛參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括葉片衰老[3-4]，側(cè)根發(fā)育[5-7]，果實(shí)成熟[8]，次生壁形成[9-10]和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11-13]等。同時(shí)，有很多文獻(xiàn)報(bào)道NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物響應(yīng)非生物脅迫中也發(fā)揮著重要的作用[14]。過(guò)表達(dá)ANAC072、ANAC019和ANAC055基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐旱性顯著提高[15]，并可以促進(jìn)擬南芥干旱應(yīng)答基因的表達(dá)。ANAC072可被多種生物、非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，包括脫落酸（ABA），NaCl，干旱，茉莉酸（JA）等[15-18]。在豆科植物中間錦雞兒中，過(guò)表達(dá)ANAC055的同源基因CiNAC4提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[19]。在玉米中，ZmNAC55基因在干旱、鹽等非生物脅迫處理下被顯著誘導(dǎo)，且過(guò)表達(dá)ZmNAC55的擬南芥植株對(duì)干旱的抗性明顯增強(qiáng)[20]。在水稻中，過(guò)表達(dá)OsNAC9基因可以有效提高轉(zhuǎn)基因水稻植株的耐旱性[21]。沙冬青在干旱、鹽、低溫和高溫脅迫以及施加外源ABA的條件下，AmNAC3、AmNAC4、AmNAC5的表達(dá)量均可被誘導(dǎo)上調(diào)。將3個(gè)基因分別轉(zhuǎn)入到擬南芥中，AmNAC3過(guò)表達(dá)株系的耐鹽性得到顯著提高，AmNAC4和AmNAC5基因可以提高耐鹽性和抗旱性[22]。煙草在不同的非生物脅迫和植物激素處理下，NtNAC072基因的表達(dá)可被NaCl、干旱以及ABA顯著誘導(dǎo)，說(shuō)明NtNAC072基因可能在煙草處于干旱脅迫和鹽脅迫等非生物逆境下起著重要的作用[23]。徐小艷等[24]將NtNAC1基因轉(zhuǎn)入野生型煙草植株中，在使用甘露醇模擬干旱條件下，其過(guò)表達(dá)株系根長(zhǎng)較野生型長(zhǎng)，證實(shí)了NtNAC1基因具有增強(qiáng)植株抗旱性的功能。代婷婷等[25]將NtNAC4基因轉(zhuǎn)入普通煙草中，在干旱處理下，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根長(zhǎng)與對(duì)照相比沒(méi)有受到明顯的抑制，表明過(guò)表達(dá)NtNAC4基因提高了植株的抗旱能力。

煙草（Nicotiana tabacum L.）為茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana）特種經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)的大部分地區(qū)都有種植。高溫、干旱、冷害、高鹽等極端環(huán)境嚴(yán)重影響了煙草的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而對(duì)其品質(zhì)造成損害。本研究運(yùn)用RT-PCR的方法對(duì)NtNAC055基因進(jìn)行分離克隆，對(duì)其表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行分析，旨在探討煙草抗逆性的調(diào)控機(jī)制和內(nèi)在機(jī)理，為后期培育抗逆新品種提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

種植材料為普通煙草K326。DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和亞克隆載體購(gòu)自北京全式金公司，GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞和AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自博邁德生物公司。GFP標(biāo)簽載體pYG56-GFP和pBridge載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。同源重組酶（Infusion）、PrimeSTAR Max DNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司。植物總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit、qRT-PCR試劑、酵母培養(yǎng)基購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?煙草材料種植和處理?供試普通煙草品種K326于2020年5月種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所氣候室。對(duì)K326種子進(jìn)行消毒，首先用75%酒精浸泡20 s，無(wú)菌水洗2次，再用15%的H2O2浸泡8～12 min，最后再用無(wú)菌水洗4～5次。將消毒過(guò)的煙草種子均勻地鋪在MS固體培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)至4片真葉期，將長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗分別轉(zhuǎn)移到含有100 mmol/L NaCl、10 μmol/L ABA、PEG-6000（5%）的相應(yīng)培養(yǎng)基上，在4 ℃和37 ℃光照培養(yǎng)箱中模擬低溫脅迫和熱脅迫。在處理時(shí)間為0、1、3和6 h時(shí)對(duì)處理的煙苗進(jìn)行整株采樣，每個(gè)處理每次采集3株，每株作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至–80 ℃冰箱中保存、備用。

將MS固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)一致的4片真葉期煙苗移栽至裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆里，置于氣候室正常培養(yǎng)。在煙株盛花期，采集正常生長(zhǎng)植株的根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、花及腋芽。根部組織取樣時(shí)，將煙草根系部位營(yíng)養(yǎng)土用水輕輕沖洗干凈，剪取側(cè)根。采集樣品時(shí)，先將樣品放入液氮中，然后轉(zhuǎn)移至–80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄?將采集的不同組織樣品以及脅迫處理的樣品在液氮中研磨至粉末，使用Trizol試劑提取各樣品的總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit對(duì)提取的總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，將反轉(zhuǎn)后的cDNA置于–20 ℃保存，備用。

1.2.3?NtNAC055基因的克隆?以擬南芥ANAC055蛋白序列為query序列，在茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solgenomics.net/）中進(jìn)行Blast P比對(duì)，獲得候選基因（Nitab4.5_0001204g0100.1），根據(jù)基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（NtNAC055-F：5'-ATGGGTGTTCAGGAAATGGACC-3';NtNAC05 5-R 5'-TTACCGACTGAAACCCATATTCACT-3'），以普通煙草K326根部cDNA為模板，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：PrimeSTAR?Max Premix 25 μL，引物F 1.5 μL，引物R 1.5 μL，cDNA 1.5 μL，用ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸20 s;32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將1000 bp左右的目的條帶切下經(jīng)凝膠回收純化試劑盒回收純化，回收的目的片段與亞克隆載體連接，取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中，在LB固體培養(yǎng)基上（Kan 100 μg/ml）37 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行篩選，挑取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4?NtNAC055基因生物信息學(xué)分析?使用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）工具，在線分析NtNAC055蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)。在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（www.arabidopsis.org）下載擬南芥ATAF1、ATAF2、AtNAP、RD26、ANAC055、ANAC019、AtNAC2和AtNAC3等脅迫相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。在茄科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solgenomics.net/）中下載馬鈴薯StNAC053、StNAC055和StNAC101等脅迫相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列[26]。在植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)EnsemblPlants（https：//plants.ensembl.org/ index.html）中下載其他物種脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列，包括水稻OsNAC4、OsNAC10，小麥TaNAC29、TaNAC2、TaNAC67，大豆GmNAC6、GmNAC11。利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線軟件進(jìn)行NAC蛋白序列的保守基序（motif）分析，并使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)[27]，運(yùn)用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

1.2.5?NtNAC055基因亞細(xì)胞定位分析?參照文獻(xiàn)[28]對(duì)NtNAC055基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。用Spe I單酶切質(zhì)粒載體pYG56-GFP，使用同源重組酶（Infusion）將去掉終止密碼子的NtNAC055基因編碼序列連接到帶有GFP標(biāo)簽的亞細(xì)胞定位載體上，即獲得融合表達(dá)載體35S：： NtNAC055-GFP。將構(gòu)建好的融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，以只含有GFP標(biāo)簽的質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌株為對(duì)照。將P19與目標(biāo)菌等比例混合后，注射到正常生長(zhǎng)4～5周的本氏煙草葉片背部，做好標(biāo)記，避光培養(yǎng)1 d后正常培養(yǎng)2 d，取少量注射的煙草葉片在激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8（德國(guó)Leica公司）488 nm激發(fā)光波長(zhǎng)下觀察GFP信號(hào)。

1.2.6?NtNAC055基因轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)?參照文獻(xiàn)[29]對(duì)NtNAC055基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)。用EcoR I單酶切質(zhì)粒載體pBridge，使用同源重組酶將NtNAC055基因編碼序列連接到pBridge載體中，構(gòu)建NtNAC055與GAL4BD融合載體。將GAL4BD-NtNAC055重組質(zhì)粒與pBridge空白載體分別轉(zhuǎn)入AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞中，然后在缺少色氨酸的培養(yǎng)基（SD/-Trp）上進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，隨后將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至加有X-gal的缺素培養(yǎng)基（SD/-Trp/X-gal）上，避光培養(yǎng)3～4 d至顯色。

1.2.7?NtNAC055基因表達(dá)模式分析?采取qRT-PCR技術(shù)對(duì)NtNAC055基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。根據(jù)NtNAC055基因的編碼序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，NAC055-qRT-F：5'-CCGACTGACGAGGAG CTTTT-3';NAC055-qRT-R：5'-TTGGTCGTGATCC ATTCGGG-3'，采用煙草26S rRNA基因（26S-F：5'-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3';26S-R：5'-TC TCCCTTTAACACCAACGG）作為管家基因[30]。提取鹽、脫落酸、PEG6000、4 ℃和37 ℃處理的煙草幼苗的總RNA，使用儀器ABI 7500（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行qRT-PCR，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

2?結(jié)?果

2.1?NtNAC055基因的克隆與序列分析

根據(jù)茄科數(shù)據(jù)庫(kù)BlastP比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)煙草NtNAC055基因的特異性擴(kuò)增引物，以K326根部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在泳道2內(nèi)有一條清晰的條帶，處在1000 bp附近（圖1），泳道1作為陰性對(duì)照，回收純化后連接亞克隆載體，測(cè)序結(jié)果顯示，NtNAC055基因CDS全長(zhǎng)為1032 bp，編碼343個(gè)氨基酸。采用ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)其分子量和理論等電點(diǎn)，結(jié)果顯示：NtNAC055蛋白分子量為38.7 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為7.06。

將煙草NtNAC055蛋白序列與擬南芥、馬鈴薯、小麥、水稻和大豆中的NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)（圖2），序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，NtNAC055蛋白序列N端具有保守的典型NAC結(jié)構(gòu)域Subdomain A-E，在Subdomain D中發(fā)現(xiàn)保守的核定位信號(hào)（NLS），而其C端序列一致性非常低，推測(cè)該區(qū)域可能與NAC蛋白的轉(zhuǎn)錄激活功能相關(guān)。

2.2?NtNAC055的進(jìn)化樹(shù)分析與保守基序分析

使用MEGA6軟件對(duì)煙草NtNAC055轉(zhuǎn)錄因子與其他物種中的NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，建立進(jìn)化樹(shù)（圖3）。從圖3可以看出，煙草NtNAC055與擬南芥ANAC055、ANAC072聚在一起，同屬于RD26亞家族。使用在線軟件MEME對(duì)NAC蛋白序列的保守基序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RD26亞家族內(nèi)的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有6個(gè)相同的保守基序且所處位置基本一致。而且NtNAC055與擬南芥ANAC055聚在同一小支內(nèi)，推測(cè)兩者在功能上可能具有相似性。

2.3?NtNAC055蛋白的亞細(xì)胞定位分析

為確定NtNAC055的亞細(xì)胞定位，以攜帶35S：： NtNAC055-GFP的農(nóng)桿菌和攜帶35S：：GFP的農(nóng)桿菌（陰性對(duì)照）侵染煙草葉片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察GFP信號(hào)，進(jìn)行NtNAC055蛋白的亞細(xì)胞定位（圖4），從圖中可以看出，NtNAC055-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中，與核指示劑DAPI共定位，而對(duì)照的GFP信號(hào)在細(xì)胞膜、細(xì)胞核均有表達(dá)，說(shuō)明NtNAC055蛋白定位于細(xì)胞核。

2.4?NtNAC055的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為了確定NtNAC055是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，分別將GAL4BD-NtNAC055融合載體和GAL4BD空載體（對(duì)照）轉(zhuǎn)化至AH109酵母感受態(tài)中，在缺少色氨酸的培養(yǎng)基（SD/-Trp）上均生長(zhǎng)良好，隨后將生長(zhǎng)良好的酵母單克隆轉(zhuǎn)移至缺少色氨酸的顯色培養(yǎng)基（SD/-Trp/X-gal）上，在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置避光培養(yǎng)。如圖5所示，只有轉(zhuǎn)化了GAL4BD-NtNAC055融合載體的酵母表達(dá)菌株在SD/-Trp/X-gal培養(yǎng)基上顯示藍(lán)色，而只有GAL4BD的對(duì)照酵母菌株沒(méi)有顯示藍(lán)色，表明NtNAC055蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.5?NtNAC055基因的表達(dá)模式分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了煙草不同組織中NtNAC055基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉、花、腋芽中NtNAC055基因均有表達(dá)，其中在根部的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低。另外，在衰老葉片中的表達(dá)量是幼葉的3.98倍，是成熟葉片的2.41倍（圖6A）。

對(duì)NtNAC055基因在不同脅迫及ABA處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，可知NtNAC055基因受多種脅迫和ABA的誘導(dǎo)和調(diào)控。在干旱處理6 h內(nèi)，NtNAC055基因的表達(dá)量隨干旱處理時(shí)間增加而顯著提高（圖6B），處理1 h時(shí)表達(dá)量為對(duì)照（0 h）的8.1倍，處理3 h時(shí)為對(duì)照的11.8倍，處理6 h時(shí)達(dá)到最高，為對(duì)照的22.4倍。在熱脅迫下，處理1 h時(shí)表達(dá)量為對(duì)照（0 h）的2.2倍，而處理3 h和6 h時(shí)表達(dá)量出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢(shì)（圖6C）。在鹽（圖6D）、低溫（圖6E）脅迫和ABA（圖6F）處理下，表達(dá)量均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。結(jié)果表明，NtNAC055基因可能在煙草受到干旱和熱脅迫時(shí)發(fā)揮重要的作用;而在受到鹽、低溫脅迫和ABA處理時(shí)NtNAC055基因的表達(dá)量也受到顯著的調(diào)控，但與干旱脅迫時(shí)的響應(yīng)模式存在明顯的差異。

3?討?論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫[3-7，14]等，其中ANAC019、ANAC055、ANAC072（RD26）屬于脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（SNAC-A）亞家族的成員[31]，可以調(diào)控非生物應(yīng)答基因的表達(dá)[16]。

本研究從普通煙草K326根部cDNA中克隆到脅迫相關(guān)基因NtNAC055，全長(zhǎng)1032 bp，編碼343個(gè)氨基酸殘基。與其他物種NAC蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NtNAC055蛋白具有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族典型的NAC結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化表明，NtNAC055與RD26亞家族中的成員ANAC055聚在一起，且蛋白保守基序具有較高的一致性，暗示兩者具有相似的生物學(xué)功能。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)表明，NtNAC055定位在細(xì)胞核中。此外，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子NtNAC055具有轉(zhuǎn)錄激活活性。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，NtNAC055基因在葉片和根中高表達(dá)。特別的，NtNAC055表達(dá)量隨著葉片衰老過(guò)程逐漸上升，在衰老葉片中的表達(dá)量分別是幼葉和成熟葉的3.98倍和2.41倍，暗示NtNAC055可能在葉片衰老中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

有研究表明，在十字花科菜心中，BrNAC055基因在衰老葉片中上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)BrNAC055基因能夠促進(jìn)葉片衰老[32]。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，在煙草中NtNAC055基因在衰老葉片中表達(dá)量上升（圖6A），暗示NtNAC055基因很可能在煙草中參與葉片衰老落黃的調(diào)控過(guò)程。在擬南芥中ANAC055基因受干旱、鹽等非生物脅迫的誘導(dǎo)，同時(shí)過(guò)表達(dá)ANAC055基因可以顯著提高植株的耐旱性[15]。在其他物種中，ANAC055的同源基因也被報(bào)道廣泛參與非生物逆境的響應(yīng)和調(diào)控過(guò)程。在玉米中，ZmNAC55基因在干旱、鹽、低溫和ABA處理下被顯著誘導(dǎo)，且過(guò)表達(dá)ZmNAC55的擬南芥植株對(duì)干旱的抗性明顯增強(qiáng)[20]。在甘藍(lán)型油菜中，BnaNAC55基因受冷、熱、ABA等非生物脅迫的誘導(dǎo)[33]。在新疆小擬南芥中，ApNAC055基因被鹽脅迫顯著誘導(dǎo)，提示該基因可能參與小擬南芥鹽脅迫響應(yīng)[34]。在豆科植物中間錦雞兒中，ANAC055的同源基因CiNAC4基因同時(shí)響應(yīng)干旱、鹽、熱、冷和ABA，在擬南芥中過(guò)表達(dá)CiNAC4基因提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[19]。本研究中，NtNAC055基因能夠被干旱和熱脅迫誘導(dǎo)，同時(shí)響應(yīng)ABA、鹽和冷脅迫，暗示NtNAC055基因可能參與多種非生物逆境的響應(yīng)和調(diào)控過(guò)程。

4?結(jié)?論

試驗(yàn)結(jié)果表明，NtNAC055基因?yàn)閿M南芥ANAC055的同源基因，編碼典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子，NtNAC055蛋白只在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，為核定位的轉(zhuǎn)錄因子且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。NtNAC055基因在煙草根部高量表達(dá)，而且同時(shí)受到干旱脅迫和熱脅迫的誘導(dǎo)。說(shuō)明NtNAC055基因可能在煙草響應(yīng)干旱脅迫、熱脅迫等逆境方面起重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果有利于進(jìn)一步探討煙草抗逆性的調(diào)控機(jī)制和內(nèi)在機(jī)理，后續(xù)研究將利用過(guò)表達(dá)、基因編輯等手段深入探索NtNAC055基因功能，為煙草抗逆育種提供理論依據(jù)和育種中間素材。

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