92份雪茄煙原料種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

向小華 劉國(guó)祥 張興偉 夏長(zhǎng)劍 李媛 陳榮平 楊菁 趙文濤 吳達(dá) 李方友 呂洪坤

摘?要：為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)雪茄煙種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用SSR引物對(duì)92份可用作雪茄煙原料的種質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測(cè)到234個(gè)等位基因，平均為5.441 9，每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量變化范圍為0.099 5～0.846 9，平均值為0.608 2;Neis多樣性指數(shù)平均為0.654 6，Shannon信息指數(shù)平均達(dá)1.303 5。UPGMA聚類分析在遺傳距離0.35處可將供試種質(zhì)分為4個(gè)類群，PCA主成分分析將供試材料劃分為4個(gè)類群，Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將供試材料劃分為5個(gè)類群;不同分析方法劃分的類群雖然有所差異，但分析結(jié)果均與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。從中篩選出15對(duì)核心引物構(gòu)建了供試種質(zhì)的指紋圖譜，為建立雪茄煙種質(zhì)資源鑒定體系奠定理論基礎(chǔ)。本研究可為雪茄煙鑒定評(píng)價(jià)、遺傳背景研究和種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用等提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雪茄煙;種質(zhì)資源;SSR標(biāo)記;遺傳多樣性;指紋圖譜

Abstract： In order to evaluate the genetic diversity of cigar germplasm resources accurately， 92 cigars were analyzed with SSR primers. A total of 234 alleles were amplified and the average number was 5.441 9. The polymorphic information content of each locus varied from 0.099 5 to 0.846 9 with an average of 0.608 2. The average diversity index of Nei was 0.654 6， and the average of Shannon information index was 1.303 5. Unweighted pair-group method with arithmetic means cluster analysis showed that the tested cigar resources can be divided into 4 groups at the genetic distance of 0.35. The test materials were divided into 4 groups by principal component analysis and 5 groups by structure population genetic structure analysis. Although there were some differences in the groups divided by different analysis， the results were all related to the geographical origin. 15 core-primers were screened to construct the fingerprint database of the tested germplasms， which laid a theoretical foundation for the establishment on the identification system of cigar germplasm resources. This study provided scientific reference for cigar identification and evaluation， genetic background research， germplasm innovation and application.

Keywords： cigars; germplasm resources; SSR marker; genetic diversity; fingerprinting

雪茄是一種特殊的煙制品，傳統(tǒng)概念是全部用煙葉卷成的吸用煙卷，具有雪茄香型且香氣濃郁，勁頭大，煙氣呈堿性，焦油與煙堿比值小[1-2]。煙葉是雪茄的核心，其質(zhì)量和組成配方?jīng)Q定了雪茄的風(fēng)格特色。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉需要適宜的氣候、土壤、地形條件以及豐富的種植經(jīng)驗(yàn)，世界上公認(rèn)的種植雪茄煙葉最好的國(guó)家有古巴、多米尼加、印度尼西亞、美國(guó)、洪都拉斯等[3]。受環(huán)境、品種、栽培措施等因素的影響，我國(guó)雪茄生產(chǎn)仍然以進(jìn)口煙葉作為主要原料，在很大程度上制約了中國(guó)雪茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。

我國(guó)雪茄煙種質(zhì)資源十分匱乏，主要來(lái)源是國(guó)外引種和國(guó)內(nèi)地方優(yōu)質(zhì)晾曬煙品種篩選，往往存在同種異名、同名異種、遺傳背景不清等問(wèn)題。因此，有必要利用分子標(biāo)記技術(shù)準(zhǔn)確研究其遺傳規(guī)律，精準(zhǔn)鑒定我國(guó)雪茄煙資源，為后期品種選育和資源高效利用奠定基礎(chǔ)。相較于其他分子標(biāo)記方法，SSR標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于煙草及其他作物的遺傳多樣性研究中。BINDLER等[5]公布的第一張煙草SSR標(biāo)記遺傳連鎖圖譜為SSR分子標(biāo)記在煙草中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，我國(guó)利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性研究主要集中在烤煙[6]、曬晾煙[7]、香料煙[8]和野生煙[9]，對(duì)于雪茄煙的研究較少。本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)92份雪茄煙種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析和指紋圖譜繪制，以期為雪茄煙種質(zhì)資源鑒定、育種親本選擇、重要基因挖掘等工作奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

本研究供試的煙草種質(zhì)資源由中國(guó)煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克峁ū?），其中包括41份雪茄煙、31份曬煙、12份晾煙、4份烤煙和4份香料煙，所有種質(zhì)均具有雪茄煙香氣風(fēng)格且已用于雪茄煙育種，因此作為雪茄煙種質(zhì)資源進(jìn)行研究與利用。

1.2?基因組DNA的提取

供試材料于2019年種植在海南省儋州試驗(yàn)基地。采集幼嫩葉片用SLS法提取DNA，加ddH2O溶解后于?20 ℃低溫下保存。

1.3?SSR引物

試驗(yàn)所用引物為公共SSR標(biāo)記，引物合成由六合華大（北京）基因科技有限公司完成。

1.4?PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系10 μL，其中包括1 μL DNA，5 μL 2×Taq Master Mix，ddH2O 2 μL，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，共35次循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.5?數(shù)據(jù)分析

用DataFormater軟件將讀取的“0，1”數(shù)據(jù)進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換;用Popgene32軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Number of alleles，Na）、有效等位基因（Effective number of alleles，Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（Nei's gene diversity，H）、Shannons多態(tài)信息指數(shù)（Shannons information index，I）等;用PIC_CALC Version 0.6軟件計(jì)算多態(tài)信息量（Polymorphic Information Content，PIC）;用MEGA7.0.21軟件進(jìn)行聚類分析，方法采用類平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）;利用NTSYS-pc 2.10軟件進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）;利用Structure2.3.4軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析;并在引物分析結(jié)果的基礎(chǔ)上構(gòu)建92份雪茄煙資源的指紋圖譜。

2?結(jié)?果

2.1?遺傳多樣性分析

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（表2），觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）在2～12之間，平均值為5.21個(gè)，其中PT52689的最多（12個(gè)）。有效等位基因數(shù)（Ne）在1.117 2～7.088 8之間，平均值為3.437 4，占比63.17%。觀測(cè)雜合度（Ho）在0.136 4～0.894 5之間，平均值為0.341 8;群體平均Shannon′s遺傳多樣性指數(shù)（I）為1.303 5， PT52689最高（2.225 4），PT52176最低（0.214 64）;平均Nei′s多樣性指數(shù)（H）為0.654 6。期望雜合度（He）的平均值為0.658 2，大于0.5。說(shuō)明供試雪茄煙種質(zhì)的遺傳多樣性較高[8]。引物多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.099 5～0.846 9，其中大于0.5的有31對(duì)，說(shuō)明所選引物的多態(tài)性較高。

2.2?聚類分析

根據(jù)UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明（圖1），除YA1（No.9）和紅花鐵桿子（No.10）、海研201（No.27）和GBX2（No.28）外，利用SSR標(biāo)記可以將剩余88份雪茄煙資源相互區(qū)分開，并在遺傳距離為0.35時(shí)分為4大類。類群Ⅰ包括康州3號(hào)（No.7）、海研101（No.13）、古巴5號(hào)（No.14）等42份資源，涵蓋了供試種質(zhì)中來(lái)自于古巴的所有資源，占該大類的40.48%;類群Ⅱ包括萬(wàn)毛2012（No.65）和土耳其香料煙（No.67）2份資源;類群Ⅲ包括大白花（No.76）和湖南曬煙（No.77）2份資源;類群Ⅳ包括巴西1號(hào)（No.1）、巴西2號(hào)（No.2）、紅花鐵桿子（No.10）等46份資源，以國(guó)內(nèi)資源為主，其中來(lái)自于廣西的資源占該類資源的30.43%。從聚類圖中可以發(fā)現(xiàn)，類群Ⅰ以國(guó)外資源為主，其中來(lái)自古巴的有17份，來(lái)自多米尼加、美國(guó)、印度尼西亞的各有4份;類群Ⅳ以國(guó)內(nèi)資源為主，其中來(lái)自廣西的有17份，來(lái)自黑龍江的有5份，來(lái)自海南、四川的各有4份。雖然同一類群中的種質(zhì)來(lái)源于不同地區(qū)，但來(lái)自同一產(chǎn)地的種質(zhì)在聚類圖中成簇分布，說(shuō)明聚類結(jié)果與雪茄煙種質(zhì)的地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。

2.3?主成分分析

主成分分析結(jié)果表明，二維、三維主坐標(biāo)分析圖都將供試種質(zhì)劃分為4個(gè)類群（圖2）：類群Ⅰ包含巴西1號(hào)（No.1）等7份種質(zhì)，其中有5份為巴西引進(jìn)資源;類群Ⅱ包含海研106（No.11）等10份種質(zhì)，其中有8份種質(zhì)來(lái)源于古巴;類群Ⅲ包含康州2號(hào)（No.6）等67份國(guó)內(nèi)外種質(zhì)，來(lái)源地復(fù)雜多樣，但來(lái)自同一地區(qū)的種質(zhì)在坐標(biāo)圖中聚在一處;類群Ⅳ包含四塘晾煙（No.46）等8份種質(zhì)，全部來(lái)源于廣西。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析有一定的相關(guān)性，主成分分析中的類群Ⅰ和類群Ⅲ包含于聚類分析中的類群Ⅳ，主成分分析中的類群Ⅱ包含于聚類分析中的類群Ⅰ。因此得出與聚類分析相同的結(jié)果，即雪茄煙種質(zhì)資源在一定程度上是按照地理來(lái)源進(jìn)化劃分的。

2.4?遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件對(duì)92份雪茄煙種質(zhì)進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，由ΔK值確定最優(yōu)群體數(shù)K值，當(dāng)K=5時(shí)ΔK最大（圖3-A），表明等位變異頻率特征類型數(shù)K=5時(shí)其模型后驗(yàn)概率最大，因此可將供試種質(zhì)劃分為5個(gè)類群（圖3-B）。其中第1類群包括巴西1號(hào)（No.1）等7份種質(zhì)，與主成分分析中的類群Ⅰ相同;第2類群包括YA4（No.37）等25份種質(zhì)，國(guó)內(nèi)資源占68.00%;第3類群包括新靖晾煙（No.44）等17份國(guó)內(nèi)種質(zhì)，其中12份來(lái)自廣西;第4類群包括海研106（No.11）等15份國(guó)外引進(jìn)種質(zhì)，其中13份來(lái)自古巴;第5類群包括康州2號(hào)（No.6）等28份種質(zhì)，國(guó)外引進(jìn)資源占60.71%。供試材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性，此結(jié)果與UPGMA聚類分析和PCA主成分分析的結(jié)果基本一致。

2.5?DNA指紋圖譜構(gòu)建

DNA指紋圖譜作為種質(zhì)資源鑒定的重要工具，具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性[10]。本研究從供試SSR標(biāo)記中選取15對(duì)核心引物可將92份雪茄煙種質(zhì)區(qū)分開來(lái)。根據(jù)15對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果（以引物PT60917為例，圖4），結(jié)合參照分子量標(biāo)記，參考宋海斌等[11]圖譜代碼構(gòu)建方法構(gòu)建供試雪茄煙資源的指紋圖譜（表3）。

3?討?論

國(guó)內(nèi)自然環(huán)境與原產(chǎn)地之間的差異往往導(dǎo)致國(guó)外引進(jìn)的雪茄煙資源不能表現(xiàn)出原有特色[12-13]。目前我國(guó)雪茄原料產(chǎn)區(qū)主要有海南、四川、湖北和浙江，其中海南省位于23° N以南，與古巴和印度尼西亞的優(yōu)質(zhì)雪茄煙種植區(qū)緯度相近、土壤相近、氣候相同，被認(rèn)為是我國(guó)發(fā)展“中式雪茄”最具潛在優(yōu)勢(shì)的地區(qū)之一[14-16]。本研究將中國(guó)煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所收集到的雪茄煙種質(zhì)資源種植于海南省儋州市，可將供試種質(zhì)的雪茄風(fēng)格最大化地發(fā)揮出來(lái)，為“中式雪茄”的研究提供優(yōu)質(zhì)育種材料。

利用分子標(biāo)記研究種質(zhì)資源遺傳多樣性不易受外界環(huán)境條件影響，是目前為止最有效的遺傳分析方法[17]。本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)92份雪茄煙種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試種質(zhì)平均等位基因數(shù)為5.441 9，平均多態(tài)性信息量為0.608 2，說(shuō)明引物總體上有較好的鑒別能力;Neis多樣性指數(shù)平均值為0.654 6，期望雜合度平均值為0.658 2，遺傳相似性系數(shù)為0.095～1.000，說(shuō)明供試種質(zhì)代表性廣泛，遺傳多樣性豐富，這與供試種質(zhì)的地理來(lái)源差異較大有關(guān)[18]。

聚類分析、主成分分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果上存在一定差異：聚類分析在遺傳距離為0.35時(shí)將供試種質(zhì)分為4大類，主成分分析將供試種質(zhì)劃分為4個(gè)類群，遺傳結(jié)構(gòu)分析將供試種質(zhì)劃分為5個(gè)類群。綜合對(duì)比以上3種分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主成分分析中的類群Ⅰ和遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群1完全相同并包含于聚類分析中的類群Ⅳ;主成分分析中的類群Ⅱ包含于遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群4，同時(shí)均包含于聚類分析中的類群Ⅰ;主成分分析中的類群Ⅲ包含于遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群3，同時(shí)均包含于聚類分析中的類群Ⅳ;聚類分析中的類群Ⅱ和類群Ⅲ、遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群5均包含于主成分分析中的類群Ⅳ。3種方式存在差異的原因可能是分類方法依據(jù)不同：聚類分析依據(jù)的是遺傳距離，主成分分析依據(jù)的是遺傳相似系數(shù)，反映的都是種質(zhì)間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，但易受人為因素的影響，導(dǎo)致二者群體分類差異較大;群體遺傳結(jié)構(gòu)分類是基于數(shù)學(xué)模型之上，計(jì)算各供試材料間相應(yīng)的Q值（第i材料其基因組變異源于第K群體的概率），服從Hardy-Weinberg平衡的群體數(shù)目，其結(jié)果避免了人為因素對(duì)群體劃分的影響，具有較高的準(zhǔn)確性[19]。雖然3種分析結(jié)果不完全相同，但均與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性，在晾曬煙[7]、香料煙[8]和野生煙[9]中也得到了相同的結(jié)論。有研究表明[20-22]，烤煙的聚類結(jié)果與地域來(lái)源關(guān)系不大，而與系譜來(lái)源相關(guān)性較大，原因可能是烤煙育種中使用的骨干親本基本相似。在聚類分析結(jié)果中，YA1（No.9）和紅花鐵桿子（No.10）、海研201（No.27）和GBX2（No.28）沒有區(qū)分開，其中YA1（No.9）和紅花鐵桿子（No.10）分別來(lái)源于印度尼西亞和中國(guó)四川，并且在主成分分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析中與5份來(lái)自巴西的種質(zhì)資源劃為一類，原因可能是紅花鐵桿子（No.10）為國(guó)外引種卻又獨(dú)立命名;海研201（No.27）和GBX2（No.28）均來(lái)源于古巴，可能為重復(fù)引種，后期應(yīng)結(jié)合田間表型性狀調(diào)查結(jié)果，進(jìn)一步確定是否為同一種質(zhì)。

4?結(jié)?論

本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)?？谘┣蜒芯克占降?2份國(guó)內(nèi)外雪茄煙種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試種質(zhì)遺傳多樣性豐富，代表性廣泛;聚類分析和主成分分析將供試種質(zhì)劃分為4個(gè)類群，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將供試種質(zhì)劃分為5個(gè)類群，雖然不同分析方法劃分的類群有所差異，但分析結(jié)果均與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性，可為雪茄煙的遺傳背景研究和育種親本選擇提供科學(xué)依據(jù);利用核心引物構(gòu)建了92份雪茄煙種質(zhì)資源DNA指紋圖譜代碼，為建立雪茄煙種質(zhì)資源鑒定體系奠定了理論基礎(chǔ)。

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