不同耐貯性甘薯的抗氧化特性差異

胡康棣 彭湘君 姚改芳 周志林 趙冬蘭 唐君 李立霞 張華

摘要：甘薯采后貯藏期短，在采后貯運過程中極易腐敗變質，從而影響甘薯的品質，造成大量損失。因此，研究不同耐貯性甘薯的生理生化指標差異具有重要的理論與實踐價值。以耐貯藏甘薯品種南瑞苕、奧墨紅、徐55-2、新大紫、徐薯18和不耐貯藏甘薯品種徐薯23、大紅花、南瓜薯、滿村香、萬二、金吊薯為試驗材料，考察甘薯葉片中抗氧化酶活性及活性氧（ROS）含量的差異，解析抗氧化代謝與甘薯耐貯性的相關性。結果表明，與不耐貯藏甘薯品種相比，耐貯的甘薯品種抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性較高，脂氧合酶（LOX）活性、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫（H2O2）含量和超氧陰離子（O-2·）產生速率相對較低。熱圖分析結果顯示，耐貯藏甘薯品種的葉片抗氧化酶活性相對較高，活性氧含量相對較低，不耐貯藏甘薯品種的葉片抗氧化酶活性相對較低，活性氧含量相對較高。主成分分析結果表明，不同耐貯性的甘薯品種中抗氧化能力和貯藏性能之間呈正相關。相關性分析結果顯示，不同抗氧化酶之間有著較高的正相關系數(shù)，而與LOX活性、H2O2含量、O-2·產生速率、MDA含量呈明顯負相關。由此可見，耐貯藏甘薯品種較不耐貯藏甘薯品種有著更好的抗氧化能力。研究結果為耐貯甘薯的選育提供了理論參考。

關鍵詞：甘薯;貯藏;活性氧自由基;抗氧化酶;相關性分析

中圖分類號： S531.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0162-06

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]屬旋花科甘薯屬，富含維生素、礦物質、膳食纖維、必需脂肪酸及抗氧化劑等[1]。甘薯是重要的低投入、高產出、耐干旱、耐脊薄、多用途的糧食、飼料及工業(yè)原料作物和新型的生物能源作物[2]。甘薯主要以塊根為利用對象，因其體積大、含水量高，在運輸和貯藏過程中的損失嚴重，從而限制了甘薯產業(yè)的發(fā)展。

影響甘薯種薯貯藏的主要因素有薯塊自身的生理變化、病菌侵染和貯藏環(huán)境條件等[3]。呼吸作用可造成植物細胞內活性氧（reactive oxygen species，簡稱ROS）的產生和積累，而植物體內的活性氧主要以自由基、非自由基形式存在，ROS主要包括超氧陰離子自由基（O-2·）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）、脂質過氧化物和單線態(tài)氧[4]。ROS通常被認為是有氧代謝的副產物，其產生的主要部位是線粒體和葉綠體中的電子傳遞鏈。當電子傳遞到氧（O2）時，就會產生ROS，而且逆境脅迫會加劇ROS的積累[5]。ROS介導的氧化應激可對植物細胞造成氧化脅迫，使其呈現(xiàn)多種有害的細胞學效應，如生物膜過氧化、細胞核受損、氨基酸氧化、蛋白質變性、DNA鏈斷裂、色素破壞、光合作用受阻、呼吸作用異常、酶失活及植物生長素IAA分解等[6-7]?？寡趸赶抵饕ǔ趸锲缁福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）等[8-9]，可以將體內形成的過氧化物轉換為毒害較低或無害的物質。在正常條件下，植物細胞中產生的ROS可通過體內抗氧化酶介導的酶促反應清除系統(tǒng)維持在相對穩(wěn)定的水平。抗氧化酶可以清除活性氧及氧化中間體，在果實采后貯藏過程中起著重要作用，這種平衡可能也會因抗氧化酶的消耗或ROS的過量積累而被打斷，導致氧化應激，從而對細胞大分子和生物膜造成損害并促進脂質過氧化。膜脂過氧化的產物丙二醛（MDA）可以使細胞膜上的蛋白發(fā)生氧化并交聯(lián)，導致蛋白失活，形成細胞膜空隙，進一步破壞細胞結構的完整性[4，10]。脂氧合酶（LOX）廣泛存在于高等植物體內，與植物的生長發(fā)育與衰老、脂質過氧化作用、光合作用及其他脅迫反應等有關。LOX以亞油酸、亞麻酸等多元不飽和脂肪酸為底物，導致膜脂過氧化反應，生成氫過氧化物，從而破壞膜的完整性[11]?？梢?，酶促清除系統(tǒng)對于ROS的代謝平衡至關重要。因此，筆者提出假說，認為甘薯采后貯藏能力與甘薯的抗氧化性能密切相關。本試驗主要以11種不同耐貯性的甘薯品種為研究對象，探究不同耐貯性甘薯的抗氧化酶活性和活性氧含量，分析不同甘薯品種抗氧化系統(tǒng)與甘薯貯藏性能的關系，以期為甘薯的貯藏保鮮和耐貯甘薯品種的篩選提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2018—2019年在合肥工業(yè)大學植物采后貯藏生理研究所進行，甘薯[Ipomoea batatas （L.）Lam.]品種南瑞苕、奧墨紅、徐55-2、新大紫、徐薯18、徐薯23、大紅花、南瓜薯、滿村香、萬二、金吊薯的扦插莖由國家甘薯改良中心提供，其中南瑞苕、奧墨紅、徐55-2、新大紫、徐薯18耐貯，徐薯23、大紅花、南瓜薯、滿村香、萬二、金吊薯不耐貯。取倒二葉至倒五葉無病害、無機械損傷的甘薯葉片組織，立即將每個品種的葉片用液氮預冷后研磨成粉末，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 SOD活性的測定

采用氮藍四唑（NBT）法[12]測定SOD的活性：取0.5 g甘薯葉片樣品，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液（PBS）冰浴研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清即為粗酶液。反應體系為5 mL，取上述粗酶液，加入50 mmol/L pH值為7.8的磷酸緩沖液[含有130 mmol/L蛋氨酸、0.75 mmol/L 氯化硝基四氮唑藍（NBT）、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉]、0.02 mmol/L核黃素，最后加入維生素B2，立刻混勻，用均勻的燈光照射10 min，迅速測定反應液在560 nm處的吸光度。

1.3 POD活性的測定

采用愈創(chuàng)木酚法[13]測定POD活性，粗酶液的提取方法同SOD，反應體系為3 mL，測定時取 100 μL 粗酶液，加入50 mmol/L pH值為6.0的磷酸緩沖液，含有0.25%愈創(chuàng)木酚和3% H2O2，混勻后在470 nm處測定吸光度。

1.4 CAT活性的測定

CAT活性的測定參照文獻[14]，反應體系為 1 mL，粗酶液提取方法同SOD，取150 μL粗酶液，加入50mmol/L pH值為7.0的磷酸緩沖液及3%H2O2。用紫外分光光度計測定240 nm處吸光度。

1.5 APX活性的測定

APX活性的測定參考白友強等的方法[15]，測定時反應體系為3 mL，其中含有2.5 mL pH值為7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液、0.1 mL 15 mmol/L抗壞血酸、0.2 mL 15 mmol/L H2O2、0.2 mL粗酶液，在290 nm處測定吸光度。

1.6 過氧化氫含量的測定

參考Hu等的方法[16]，具體步驟如下：稱取0.5 g甘薯葉片放入添加有液氮的研缽中迅速研磨成粉末，加入5 mL預冷的提取液（丙酮），繼續(xù)研磨至勻漿狀態(tài)，12 000 r/min離心10 min（4 ℃），吸取1 mL上清液轉移到新的離心管中，加入0.1 mL 5%硫酸化鈦，上下顛倒混勻，常溫靜置5 min使其充分反應，反應結束后離心，棄去上清液，留取沉淀，加入 2 mL 2 mol/L硫酸充分溶解沉淀，此時溶液呈淺黃色，利用酶標儀在412 nm處測定吸光度。同時，用標準過氧化氫制作標準曲線，根據標準曲線可計算出樣品中的過氧化氫濃度。

1.7 超氧陰離子含量的測定

O-2·的檢測參照Wang等的方法[17]：取 0.3 g 甘薯葉片樣品，加液氮研磨，再加入3 mL 0.1 mol/L、pH值為7.8的磷酸緩沖液再次研磨后使用低溫離心機于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清即為超氧根陰離子測定液。測定時每個樣品分為2組（空白對照組和測定組），取1 mL上清液與1 mL提取用的磷酸緩沖液、1 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺加入2組試管中混勻，于25 ℃水浴加熱1 h，然后分別加入1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸、1 mL 7 mmol/L α-萘胺，搖勻后于25 ℃水浴20 min，再于530 nm處測定吸光度。在同樣的條件下制定標準曲線，根據標準曲線的結果，計算出樣品中超氧根陰離子的含量。

1.8 LOX活性的測定

LOX的測定參考Lara等的方法[18]：取0.5 g分裝好的甘薯葉片，加入液氮快速研磨，加入5 mL 0.1 mol/L、pH值為6.8磷酸緩沖液[含有4% 交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、1% Triton X-100]，快速研磨成勻漿后，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液即為LOX粗酶液。測定時反應混合物中有濃度為0.1 mol/L、pH值為5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.01 mol/L的亞油酸鈉，于30 ℃水浴保溫10 min后加入粗酶液，混勻后反應15 s開始記錄234 nm處的吸光度，以后每隔30 s記錄1次。

1.9 丙二醛含量的測定

采用硫代巴比妥酸法[19]檢測甘薯葉片組織中的MDA含量。MDA可以與硫代巴比妥酸在酸性條件下發(fā)生顏色反應，因此可以利用分光光度法進行測量。將提取液離心后取上清，加入0.5%硫代巴比妥酸（TBA），混勻后在沸水浴中充分反應15 min。離心，吸取上清液加入96孔酶標板內，分別在450、532、600 nm處測定其吸光度。

1.10 數(shù)據處理及分析方法

利用基迪奧網站（https：//www.omicshare.com/）進行相關性、熱圖和主成分（PCA）分析。

2 結果與分析

2.1 11種不同品種甘薯的表觀及貯藏特性

甘薯塊根含水量高，生理活動旺盛，不易長時間貯藏。貯藏適溫為9～15 ℃，空氣相對溫度為80%～90%，一般可貯藏5～6個月。低于9 ℃時易使甘薯遭遇冷害，高于15 ℃時則會加速甘薯脫水。

種質薯塊收獲后在溫度10～15 ℃、濕度80%～90%的甘薯中貯藏，不作任何保鮮處理，貯藏6個月后調查，觀察并記錄薯塊的腐爛程度和貯藏前、貯藏后的質量并進行分級。所有樣品均在3個生物重復中制備，11個甘薯品種的貯藏特性見表1。

2.2 甘薯中SOD、POD、CAT、APX活性的分析

為了探究不同甘薯品種的貯藏特性是否與其抗氧化酶活性相關，筆者檢測了不同甘薯品種葉片的抗氧化酶差異。由圖1可以看出，耐貯藏甘薯品種南瑞苕、奧墨紅、徐55-2、新大紫、徐薯18的SOD活性較高，其中南瑞苕的SOD活性最高;不耐貯藏甘薯品種徐薯23、大紅花、南瓜薯、滿村香、萬二、金吊薯的SOD活性整體上低于耐貯藏甘薯品種，其中滿村香的SOD活性最低。POD是植物體內清除過氧化氫的主要氧化還原酶。如圖1-B所示，POD活性與SOD活性相似，耐貯藏甘薯品種的POD活性總體明顯高于不耐貯藏甘薯品種，其中南瑞苕的POD活性最高 徐55-2次之 不耐貯藏甘薯品種中金吊薯的POD活性最高，但其POD活性仍低于耐貯藏甘薯品種中的任意一種。CAT能夠催化H2O2分解為O2、H2O2，從而減少植物體內H2O2的積累，減少細胞受到的H2O2損害。圖1-C為不同甘薯品種的CAT活性，可以看出，耐貯藏甘薯品種的CAT活性整體上高于不耐貯藏甘薯品種，其中奧墨紅的CAT活性最高，大紅花的CAT活性最低。APX是植物體內抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原途徑的重要抗氧化酶之一，是清除H2O2的關鍵酶。從圖1-D可以看出，5個耐貯藏甘薯品種的APX活性高于6個不耐貯藏甘薯品種，其中南瑞苕酶活性最高，徐薯23的酶活性最低?？傊?，與不耐貯藏甘薯品種相比，耐貯藏甘薯品種的抗氧化酶活性較高，有利于清除活性氧。

2.3 甘薯中ROS含量的分析

在貯藏過程中，甘薯細胞內的代謝平衡被破壞，有1%～2%的O2會形成ROS，而ROS的積累會對細胞產生損傷。ROS主要包括超氧根陰離子自由基（O-2·），而O-2·又可以轉變成H2O2、羥基自由基（·OH）、單線態(tài)氧（1O2）等。因此，O-2·、H2O2代謝是衡量果實貯藏性能的重要指標。如圖2-A所示，耐貯藏甘薯品種間O-2·的產生速率差異不明顯，且整體低于不耐貯藏甘薯品種，大紅花產生O-2·的速率最高;由圖2-B可以看出，耐貯藏甘薯品種間H2O2含量差異不大，不耐貯藏甘薯品種中大紅花的H2O2含量最高，且不耐貯藏甘薯品種的整體H2O2含量高于耐貯藏甘薯品種。上述結果表明，與耐貯藏甘薯品種相比，不耐貯藏甘薯品種中H2O2與O-2·含量增加。

2.4 甘薯中LOX、MDA含量的分析

如圖3-A所示，與抗氧化酶相反，耐貯藏甘薯品種的LOX活性整體上低于不耐貯藏甘薯品種。MDA可以使細胞膜脂過氧化，從而造成細胞氧化損傷，圖3-B展示了11種不同品種甘薯葉片的MDA含量，可見耐貯藏甘薯品種的MDA含量整體上低于不耐貯藏甘薯品種，其中徐55-2的MDA含量最低，大紅花的MDA含量最高，金吊薯次之。由此可見，與不耐貯藏甘薯品種相比，耐貯藏甘薯LOX活性較低，膜脂過氧化產物MDA含量較低，有利于防止不飽和脂肪酸的氧化，防止膜脂過氧化。

2.5 甘薯各生理指標的熱圖分析

熱圖分析能發(fā)現(xiàn)抗氧化酶與活性氧的變化規(guī)律和內在聯(lián)系以及它們之間可能存在的相互協(xié)同與拮抗作用。從圖4可以看出，耐貯藏甘薯品種南瑞苕、奧墨紅、徐薯55-2、新大紫、徐薯18的抗氧化酶SOD、POD、APX、CAT活性與LOX活性、丙二醛含量、過氧化氫含量、超氧陰離子產生速率相互拮抗，抗氧化酶活性相對較高，活性氧含量相對較低;不耐貯藏甘薯品種徐薯 32、金吊薯、南瓜薯、萬二、滿村香、大紅花的抗氧化酶活性與活性氧含量也明顯拮抗。耐貯藏甘薯品種中含有較高的抗氧化酶活性水平，而有較低的活性氧含量。與此相反的是，不耐貯藏甘薯品種中活性氧含量較高，抗氧化酶活性較低。

2.6 主成分分析

由圖5可以看出，PC1、PC2分別揭示了數(shù)據的85.3%、7.7%可變性。根據上述測量參數(shù)，在PC1中耐貯藏甘薯品種和不耐貯藏甘薯品種之間存在明顯聚類。此外，在PC1方向上顯示，最高正負荷值的甘薯品種是金吊薯，PC2上的南瑞苕表現(xiàn)出最低的負荷值，表明其與貯藏性能的相關性。因此可以認為，這些抗氧化物質對耐貯性甘薯的貯藏性能貢獻很大，抗氧化能力和貯藏性能之間的正相關性在具有不同耐貯性的甘薯品種中可能是普遍的。

2.7 甘薯抗氧化酶與貯藏性的相關性分析

通過對甘薯各生理指標間的相關性進行分析，可以了解它們之間存在的內在聯(lián)系。由圖6可以看出，11個品種甘薯葉片中SOD活性與POD、CAT、APX活性有著較高的正相關系數(shù)，分布在 0.79～0.93之間;與LOX活性、H2O2含量、O-2·產生速率、MDA含量呈明顯負相關，相關系數(shù)分布在 -0.87～-0.91之間，表明抗氧化酶活性之間呈明顯正相關，而與活性氧含量呈明顯負相關。

3 討論

成熟和衰老會導致植物果實中的ROS積累和抗氧化活性的變化，例如番茄、甘薯要清除自身產生的活性氧，通常是由酶類抗氧化物質和非酶促抗氧化物質來完成的[20]。在甘薯采后的貯藏期間，一般通過抗氧化酶清除O-2·和H2O2，SOD、CAT、APX和POD都能夠分解甘薯衰老中產生的H2O2、·OH 等ROS代謝產物，進而保護植物組織免受ROS產生的傷害[21]。甘薯在低溫存儲過程中容易受到冷害，在抗寒脅迫下，抗氧化酶活性在儲存早期迅速增強，此后由于ROS清除酶活性逐漸丟失，ROS代謝產物含量急劇增加[22-23]。

本研究比較了不同耐貯性的甘薯的抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）、脂氧合酶（LOX）、活性氧（H2O2、O-2·）和丙二醛含量，發(fā)現(xiàn)耐貯藏甘薯品種中抗氧化酶活性相對較高，能夠減少自由基積累、維持細胞ROS的代謝平衡、提高其抵抗逆境的能力，從而延長了甘薯采后的貯藏期;同時，與不耐貯藏甘薯品種相比，耐貯藏甘薯品種中活性氧、MDA含量以及脂氧合酶LOX活性較低，相對減小了活性氧對細胞的損傷，減輕了細胞膜脂的過氧化作用，提高了甘薯的抗病性，從而延長了甘薯的貯藏期。耐貯藏甘薯品種和不耐貯藏甘薯品種在PCA分布上具有特征性，可通過主成分分析進行區(qū)分和識別。相關性分析結果表明，11種采后甘薯葉片抗氧化酶活性之間呈明顯正相關，而與活性氧含量、MDA含量、LOX活性呈明顯負相關。熱圖結果顯示，與不耐貯藏甘薯品種相比，耐貯藏甘薯的抗氧化酶活性較高，脂氧合酶活性較低，活性氧及MDA含量較低，不耐貯藏甘薯品種活性氧含量相對較高，抗氧化酶活性相對較低。本研究結果可為耐貯甘薯的品種選育及應用提供一定的參考，為不同耐貯性甘薯產品的開發(fā)與利用提供相關參考依據。

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