基因工程在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展

陳馨 楊武華

摘要：隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷地發(fā)展，基因工程技術(shù)也越發(fā)成熟，越來越多的應(yīng)用到了中藥的研究中，主要有中藥藥材基因序列的完善、中藥材的鑒定、中藥藥效評(píng)估、調(diào)節(jié)有效成分含量、參與單體化合物的合成等方面。本文將分別論述基因工程在中藥研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：基因工程;中藥;應(yīng)用進(jìn)展

【中圖分類號(hào)】R28 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）09-321-02

中醫(yī)藥在我國具有悠久的歷史，在治療疾病的過程中有著獨(dú)特的理論體系，然而更多的卻并未理解這理論體系，對(duì)中醫(yī)藥治療疾病存在著質(zhì)疑和不解，那么中藥的研究就顯得尤為重要，對(duì)于中藥的研究也日益增長。傳統(tǒng)中藥的特色和優(yōu)勢與現(xiàn)代生物工程技術(shù)相結(jié)合，為中藥的現(xiàn)代化和國際化提供了契機(jī)，有利于推動(dòng)中草藥的發(fā)展。現(xiàn)代生物技術(shù)以基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程為主，本文中主要對(duì)基因工程技術(shù)在中藥中的運(yùn)用進(jìn)行概括論述。

1.基因工程

基因工程（或稱遺傳工程、基因重組技術(shù)）是將不同生物的基因在體外剪切組合，并和載體（噬菌體、質(zhì)粒、病毒）的DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行克隆，并使轉(zhuǎn)入的基因在細(xì)胞或微生物內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)?；蚬こ套鳛楝F(xiàn)代生物工程技術(shù)的核心，在研究中藥的過程中也占據(jù)了主導(dǎo)地位。

1.1基因工程與藥材鑒定

中藥材運(yùn)用的越來越多，需求越來越多，在這需多供少的時(shí)代，藥材的來源也越來越多，對(duì)于藥材的質(zhì)量控制，需要更多的技術(shù)鑒定，基因工程技術(shù)的應(yīng)用更加具體化和可視化。石志剛[1]等人利用 psbA-trntH基因片段的保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出了整個(gè)psbA-trntH基因片段，測定了擴(kuò)增產(chǎn)物DNA堿基序，獲得7個(gè)寧夏枸杞主要品種psbA-trntH基因片段的完整序列，經(jīng)過分析能夠鑒定出不同枸杞之間的差異，或可有利于未來枸杞的鑒定。程方婷[2]等人對(duì)不同地區(qū)生長的地黃進(jìn)行DNA序列測定，選取了3個(gè)葉綠體DNA條形碼片段（ psbA-trnH、matK、rbcL）、核基因ITS片段以及進(jìn)化速率較快的3個(gè)候選葉綠體DNA片段（trnL-trnF、trnM-trnV和 trnS-trnG），證明trnS-trnG+ITS共同檢測能夠有效地區(qū)分不同地區(qū)的地黃。

隨著基因技術(shù)的不斷完善，已經(jīng)初步形成某些藥材的DNA檢測試劑盒及DNA條形碼技術(shù)。人參是一味及其珍貴和有效的藥材，其功效甚多，但由于產(chǎn)少需多，人工種植的越來越多，以次充好現(xiàn)象盛行，大大影響了藥效。周雨晴[3]等人研發(fā)了具有DNA提取及PCR鑒定的DNA檢測試劑盒，用于鑒別種植參及其偽品，并發(fā)現(xiàn)正品人參PCR在150-200bp有單一明亮條帶，將其DNA原液稀釋200倍、反復(fù)凍融20次、﹣20℃保存一年對(duì)檢測效果無任何影響。貝母是臨床最常用的止咳藥之一，川貝母善用于虛癥咳嗽，道地藥材的選擇和準(zhǔn)確性對(duì)于中醫(yī)治療疾病至關(guān)重要。周亭亭[4]等人運(yùn)用PCR和RFLP聯(lián)合使用，研制了川貝母DNA檢測試劑盒，RFLP結(jié)果顯示在100-250bp位置有兩條條帶清晰明亮的條帶，準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性均很高。李蕭涵[5]等人進(jìn)一步對(duì)川貝DNA試劑盒進(jìn)行完善，采用分子克隆技術(shù)獲得了正品川貝母特異基因序列，且進(jìn)出現(xiàn)在100-250bp明亮清晰、無亞種條帶的特異性條帶，實(shí)現(xiàn)了川貝母特異基因序列大量的分子克隆及保存，免去了每次鑒定均要重新提取標(biāo)準(zhǔn)品的繁冗工作。王俊[6]等人選取26份血竭樣品，檢測ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL（ UAA） 內(nèi)含子、trnL（ UAA） 內(nèi)含子的P6 環(huán)序列，從而可以鑒定血竭的真?zhèn)?，但因血竭是樹脂類藥材，其DNA含量較少，可能會(huì)因?yàn)楹窟^低而無法檢測，影響真?zhèn)蔚谋鎰e，仍需進(jìn)一步解決。湯歡[7]等人選取90個(gè)黃柏樣品，獲取穩(wěn)定的ITS2序列，NJ樹顯示川黃柏和關(guān)黃柏聚為一支，其混偽品各自聚為一支，說明可以通過ITS2序列鑒別川黃柏與關(guān)黃柏及其混偽品。利用基因工技術(shù)，鑒定中藥材，建立DNA條碼鑒定庫已經(jīng)成為目前的研究趨勢，也是中藥材質(zhì)控的重要手段，但由于產(chǎn)地多樣化，建立健全的鑒定庫也是比較困難的，需要不斷地研究探索與完善。

1.2基因工程與藥效評(píng)價(jià)

中藥在中醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中，講究配伍運(yùn)用，君臣佐使即成方，往往不止一味中藥，況且每味中藥的活性成分也是種類繁多，這對(duì)于中藥治療疾病的認(rèn)識(shí)以及治療機(jī)制的研究造成了很大的困擾?；蚬こ碳夹g(shù)的出現(xiàn)，一定程度上解決了這個(gè)問題，例如采用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型評(píng)價(jià)藥效、藥代以及毒理、作用機(jī)制及靶點(diǎn)?；蚯贸蜣D(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過動(dòng)物相關(guān)基因的調(diào)整從而產(chǎn)生適合疾病的動(dòng)物模型，為中藥藥效評(píng)價(jià)提供了新的、相對(duì)穩(wěn)定方法。目前比較成熟的模型主要有ApoE 基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型、MKR糖尿病小鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型、flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚等。

林海丹[8]等人選用ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，予以溫腎化痰方治療，發(fā)現(xiàn)該復(fù)方可明顯下調(diào)Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2 的基因及蛋白的表達(dá)。表明溫腎化痰方可通過降低促凋亡基因的表達(dá)及相應(yīng)蛋白的激活及表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡及增殖的幾率，延緩甚至改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。

MKR糖尿病小鼠模型是較早且較為成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，喻嶸[9]和成細(xì)華[10][11]等人選用該模型研究左歸復(fù)方對(duì)其代謝及炎癥的調(diào)節(jié)作用、抗氧化應(yīng)激作用、胰島素表達(dá)與分泌的影響。發(fā)現(xiàn)研究表明該方具有顯著的改善MKR鼠糖耐量異常、降低空腹血糖、改善高胰島素血癥的作用、保護(hù)胰島B細(xì)胞、調(diào)節(jié)胰島素表達(dá)和分泌、抑制氧化應(yīng)激，并具有降低與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞間黏附分子-1（ ICAM-1） 和血管細(xì)胞黏附分子（ VCAM-1） 水平的作用，從而改善MKR鼠的炎癥損傷和進(jìn)一步的血管損傷。

張琦[12][13]等人運(yùn)用轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，研究桂枝芍藥知母湯對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的療效及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)桂枝芍藥知母湯可以改善關(guān)節(jié)炎的病情和癥狀，其機(jī)制可能是抑制C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein， CRP）、白介素-2（Interleukin-2， IL-2）的分泌，同時(shí)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。

隨著對(duì)基因的認(rèn)識(shí)，斑馬魚已廣泛用于血管生成的研究，其中在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚逐漸被開發(fā)，有助于深入研究血管發(fā)育[14]。張碩[15]等人選用flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，予以高中低劑量黃芪、莪術(shù)配伍處理，發(fā)現(xiàn)黃芪、莪術(shù)配伍可抑制體節(jié)間血管根數(shù)、長度和面積，且黃芪、莪術(shù)配伍高劑量組抑制作用最強(qiáng)，還采用激光共聚焦成像觀察了體節(jié)間血管頂端細(xì)胞的行為發(fā)現(xiàn)黃芪、莪術(shù)配伍通過抑制頂端細(xì)胞絲狀偽足的伸展抑制斑馬魚血管生成。蘇梅[16]等人也運(yùn)用斑馬魚模型，探究腦脈利顆粒對(duì)血管新生的促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)中高劑量組有明顯的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能與升高VEGFR1基因表達(dá)有關(guān)，腦脈利顆粒還可預(yù)防血小板聚集性血栓形成，從而預(yù)防血栓。

1.3基因工程與藥材成分

藥材中的有效成分是有一定固定比例的，當(dāng)某些活性成分大量需求時(shí)，如何提高這個(gè)成分的含量與產(chǎn)量就是最直接的解決方法，有研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)基因，并調(diào)節(jié)有效成分的含量。對(duì)于某些藥材，學(xué)者們也進(jìn)行人工培育新品種的研究。目前主要有枸杞、枳殼、百合、刺五加、白及等中藥材。

趙亞華[17]等人發(fā)現(xiàn)將小鼠金屬硫蛋白- I cDNA通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入枸杞，mM T- IcDN A成功導(dǎo)入枸杞組織并得到表達(dá)，轉(zhuǎn)基因枸杞對(duì)鋅離子富集比對(duì)照高2倍以上。賀紅[18]等人采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法， 將能抑制病毒侵染的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入枳殼，，成功地獲得了轉(zhuǎn)外殼蛋白基因的枳殼植株。唐東芹[19]等人利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pBIXPTA基因?qū)氚俸匣ńz誘導(dǎo)的胚性愈傷組織，成功獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因百合植株。張佳楨[20]等人克隆刺五加香葉基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase， GPS）基因的cDNA序列，并分析基因序列特征、不同器官中基因表達(dá)水平及其與皂苷含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其克隆獲得刺五加GPS基因的cDNA全長序列，且明確了刺五加GPS基因的表達(dá)量與皂苷含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，為未來提高皂苷含量的研究奠定了基礎(chǔ)。許娟[21]等人克隆成功獲得白及磷酸甘露糖變位酶（PMM）基因（BsPMM）cDNA序列，檢測甘露糖合成相關(guān)基因（BsPMM和BsGMP）的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)BsPMM和BsGMP的表達(dá)具有品種、組織、時(shí)空的特性，或許是調(diào)控多糖合成代謝途徑的關(guān)鍵基因，參與白及甘露糖和多糖的合成過程，為未來提高白及甘露糖及多糖成分奠定基石。

Olsson等[22]利用qPCR分析了青蒿素生物合成下游途徑關(guān)鍵酶基因細(xì)胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）、紫穗槐二烯羥化酶（amorpha-4， 11-diene synthase，ADS）以及青蒿醛Δ11 （13） 還原酶（artemisinic aldehydeΔ11 （13） reductase， DBR2）僅在腺毛體頂端細(xì)胞表達(dá)，而MEP途徑關(guān)鍵酶基因5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）僅在近頂細(xì)胞中表達(dá)。將以上基因作為重要的靶點(diǎn)基因，通過基因工程改良青蒿，培育高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因新品種是研究重點(diǎn)之一，并且取得了良好的效果。

1.4基因工程與生產(chǎn)中藥有效化合物

利用植物作為生物反應(yīng)器，獲得中藥材中活性成分產(chǎn)生的相關(guān)基因，并獲得外源性基因表達(dá)產(chǎn)物的研究日益完善，為藥材中常用活性成分的大量生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。在我國青蒿治療瘧疾具有很悠久的歷史，隨著時(shí)代的發(fā)展，也逐漸為世界所接受，對(duì)于青蒿的研究也越來越多。但是由于原材料不足，對(duì)于其主要活性成分青蒿素的研究也更為關(guān)鍵，目前也有一些基因技術(shù)合成青蒿素，有望實(shí)現(xiàn)青蒿素的批量生產(chǎn)。青蒿素合成的相關(guān)酶主要有以下三種：法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜環(huán)化酶、氧化酶和加氧酶。向禮恩[23]等人采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同組織中青蒿素合成途徑涉及到的7個(gè)功能基因（ HMGR，DXR，F(xiàn)PS，ADS，CYP71AV1，CPR，AAR） 的表達(dá)水平進(jìn)行分析，同時(shí)測定對(duì)應(yīng)組織中青蒿素含量。發(fā)現(xiàn)青蒿素生物合成上游途徑涉及到的3 個(gè)關(guān)鍵酶基因HMGR，DXR，F(xiàn)PS在花中的表達(dá)量最高;青蒿素生物合成特有途徑涉及到的4個(gè)基因功能在根、莖、葉和花中均有表達(dá);ADS表達(dá)量在葉中最高，其次為花，在莖中表達(dá)量最低; CYP71AV1表達(dá)量在花中最高，在葉中最低;CPR的最高表達(dá)量也出現(xiàn)在葉中;而AAR在各個(gè)組織中表達(dá)量相對(duì)而言都較低。這些結(jié)果均表明青蒿素的合成收到多基因的雙向協(xié)同作用，需要更加明確調(diào)控路徑，才能高產(chǎn)量青蒿素。夏菁[24]等人成功從青蒿中克隆了兩個(gè)新的JA信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子JAZ （jasmonate ZIM-domain，JAZ）基因家族成員AaJAZ5和AaJAZ6，表明青蒿 JAZ 家族成員存在著功能分化，AaJAZ5 可能是青蒿中真正參與JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主效基因，對(duì)其在 JA 信號(hào)介導(dǎo)調(diào)控青蒿素生物合成具有指導(dǎo)意義。

東莨菪堿和莨菪堿主要來源于藥材顛茄，龍世平[25]等人采用基于發(fā)根的基因表達(dá)系統(tǒng)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化顛茄，潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)顛茄自身PMT和H6H基因發(fā)根;基因組PCR鑒定轉(zhuǎn)基因發(fā)根;液體搖床培養(yǎng)后，HPLC測量莨菪堿和東莨菪堿含量;qPCR檢測顛茄PMT和H6H基因表達(dá)水平。基因組PCR檢測獲得5個(gè)雙基因共轉(zhuǎn)化顛茄發(fā)根系，其中2個(gè)發(fā)根系（PH2和PH14）的總生物堿含量得到顯著提高，最高的是PH2;4個(gè)轉(zhuǎn)基因發(fā)根系（PH2、PH32、PH14 和 PH20）東莨菪含量都有提高，其中PH2東莨菪堿含量最高。基因表達(dá)量與生物堿含量結(jié)果基本一致，說明顛茄發(fā)根中PMT和H6H兩者同時(shí)維持高水平表達(dá)可以極大程度的促進(jìn)東莨菪堿積累，不僅如此，對(duì)于菪堿的合成也具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

2.討論

隨著基因工程技術(shù)不斷地進(jìn)步，對(duì)于中草藥的認(rèn)識(shí)也越加的完善，更加完善的基因庫建立，使得藥材的鑒別與質(zhì)量控制更加便捷和準(zhǔn)確;對(duì)中藥材的藥理研究提供了更加有利的技術(shù)手段，讓中藥材的功效可視化，更加容易理解;利用某些特異基因調(diào)控有效成分含量，提高了藥物的利用度，減少原材料的浪費(fèi)，同時(shí)也解決的供需不平衡的問題;轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決了有效單體產(chǎn)量低，不易種植培育的問題;對(duì)中藥材活性成分生物合成相關(guān)基因進(jìn)行研究，不僅有利于提高有效成分含量，同時(shí)還有利于實(shí)現(xiàn)活性成分的批量生產(chǎn)。相信隨著時(shí)代的進(jìn)步，基因工程技術(shù)會(huì)為中草藥的研究與發(fā)展帶來質(zhì)的飛躍。

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